Generazione di Allineati tessuto funzionale del miocardio attraverso la stampa microcontatto

Sommario

La generazione di allineato tessuto miocardico è un requisito fondamentale per adattare i recenti progressi nel campo della biologia delle cellule staminali a fini clinicamente utili. Qui si descrive un metodo di stampa per microcontatto il controllo preciso di forma e funzione cellulare. Utilizzo di popolazioni altamente purificate di cellule staminali embrionali derivate progenitori cardiaci, abbiamo quindi generare anisotropo tessuto funzionale del miocardio.

Abstract

Insufficienza cardiaca avanzata rappresenta un'importante sfida clinica insoddisfatta, derivanti dalla perdita di vitali e / o completamente funzionale cellule muscolari cardiache. Nonostante la terapia farmacologica ottimale, scompenso cardiaco rappresenta una delle principali cause di mortalità e morbilità nel mondo sviluppato. Una sfida importante nello sviluppo di farmaci è l'identificazione di saggi cellulari che ricapitolano precisione normale e patologica del miocardio fisiologia umana in vitro. Allo stesso modo, le principali sfide in biologia rigenerativa cardiaca ruotano intorno alla identificazione e l'isolamento di progenitori cardiaci paziente-specifici in quantità clinicamente rilevanti. Queste cellule devono poi essere assemblati in tessuto funzionale analogo al nativo architettura del tessuto cardiaco. Stampa microcontact consente la creazione di precise forme proteiche micropatterned che assomigliano organizzazione strutturale del cuore, fornendo così spunti geometriche per controllare l'adesione cellulare spazialmente. Quidescriviamo il nostro approccio per l'isolamento di cellule miocardiche altamente purificato da cellule staminali pluripotenti differenziazione in vitro, la generazione di superfici di crescita cellulare micropatterned con proteine ​​della matrice extracellulare, e l'assemblaggio delle cellule derivate da cellule staminali muscolari cardiache in anisotropo tessuto miocardico.

Introduzione

Nonostante i recenti progressi nella terapia medica, scompenso cardiaco avanzato rimane una delle principali cause di mortalità e morbilità nel mondo sviluppato. La sindrome clinica nasce da una perdita di tessuto miocardico funzionale e successivamente una incapacità del cuore scompensato per soddisfare le richieste metaboliche dei soggetti affetti. Dal momento che il cuore ha una capacità limitata di rigenerazione, il trapianto di cuore autologo è l'unica terapia in corso clinicamente accettati direttamente volto a rifornire perso tessuto funzionale del cuore. Svantaggi significativi del trapianto di cuore, tra cui un numero limitato di cuori donatori e alla necessità di una terapia a lungo termine immunosoppressiva, preclude l'uso molto diffuso di questa terapia. Come risultato, la terapia medica è stato il cardine del trattamento per pazienti con malattia cardiaca. Una sfida importante nello sviluppo di farmaci è l'identificazione di saggi cellulari che ricapitolano accuratamente fisiologia normale e patologica del miocardio in vitro.

La convergenza recente di biologia delle cellule staminali e l'ingegneria dei tessuti tecnologia solleva nuove vie promettenti per la rigenerazione cardiaca. Generazione funzionale del tessuto miocardico da un rinnovabili paziente-specifica fonte sarebbe un importante passo avanti nel campo. Ciò consentirebbe lo sviluppo di malattie saggi specifici cellulari per lo sviluppo di farmaci e di scoperta e avrebbe posto le basi per la medicina rigenerativa cardiaca. Umane staminali embrionali (ES), le cellule e, soprattutto, umane staminali pluripotenti indotte (iPS), cellule rappresentano un potenziale rinnovabile paziente-specifica fonte di cellule progenitrici ventricolari e dei miociti ventricolari maturi. La combinazione di biologia delle cellule staminali e strategie di ingegneria tessutale risolve questo problema generando tessuto cardiaco funzionale in vitro che possono essere utilizzati per lo sviluppo di saggi cellulari per la scoperta di farmaci o in cardiaci approcci rigenerativi per il trattamento di insufficienza cardiaca avanzata.

_content "> Una sfida centrale nella rigenerazione cardiaca è stata l'identificazione di un tipo cellulare ottimale. Una vasta gamma di cellule sono state studiate ^1, tuttavia ad oggi, pur differenti precursori multipotenti cardiogeniche da fonti diverse sono stati scoperti, l'identificazione di una cellula fonte che soddisfa i requisiti critici come impegno per il destino cellulare miogenico, mantenimento della capacità di espandersi in vivo o in vitro e la composizione di un tessuto funzionale del miocardio ha dimostrato di essere un problema centrale ^2. Abbiamo precedentemente descritto un doppio sistema transgenico murino che permette l'isolamento di popolazioni altamente purificate di progenitori ventricolari impegnati (CVP) da cellule ES differenziazione in vitro. Abbiamo generato un romanzo topo transgenico doppia che esprime la proteina fluorescente rossa DsRed sotto il controllo di un Isl1-dipendente enhancer del gene MEF2C e rafforzata di proteina fluorescente verde sotto il controllo diil cardio-specifica Nkx2.5 enhancer. Sulla base di questa bicolore sistema reporter fluorescente, primo e secondo progenitori cardiaci campo da cellule ES di sviluppo possono essere isolati mediante fluorescenza activated cell sorting (FACS) secondo la loro espressione di MEF2C e Nkx2.5 geni. CVP assomigliano miociti cardiaci in base agli schemi di espressione dei marcatori del miocardio e le qualità strutturali e funzionali ^3, quello che offre una grande promessa per scopi di rigenerazione dei tessuti cardiaci.

Anche se ci sono stati molti progressi nel campo dell'ingegneria tissutale, imitando nativo architettura cellulare rimane una sfida fondamentale. I metodi convenzionali per affrontare questa sfida sono semina scaffold biologici o sintetici con cellule in vitro. Causa di una serie di svantaggi, tra scaffold rapida degradazione, limitata stabilità fisica e meccanica e bassa densità cellulare ^1,4,5, abbiamo tentato di progettare scaffold-meno tessuto. AltHough cellule cardiache possono modificare il loro microambiente locale, attraverso la secrezione di proteine ​​della matrice extracellulare, hanno una capacità più limitata ad organizzarsi per asta a forma di miociti cardiaci in assenza di segnali extracellulari. Così, un modello che fornisce indicazioni appropriate cellule spaziali e biologici a comporre funzionale tessuto miocardico è richiesto. Stampa microcontact risolve questo problema fornendo una tecnica semplice ed economico per controllare con precisione la forma delle cellule, organizzazione e funzione ^6-8, tutti che sono cruciali per la generazione di allineato tessuto funzionale del miocardio. Esso comprende l'uso di microtextured polidimetilsilossano (PDMS) francobolli con dimensioni caratteristiche che variano fino a 2 micron ⁹ che permettono la deposizione di proteine ​​della matrice extracellulare su substrati PDMS in schemi precisi e quindi di incidere adesione cellulare spazialmente.

Qui, ci si propone di combinare la tecnologia della bioingegneria dei tessuti con stelo cell biologia per generare anisotropo tessuto funzionale del miocardio. Di conseguenza, abbiamo qui dimostrano nostro approccio recentemente pubblicato per i seguenti: (1) la generazione di superfici proteiche micropatterned il PDMS substrati da stampa microcontact per la generazione di un modello per il tessuto miocardico allineati, (2) l'isolamento di altamente purificata da progenitori cardiaci cellule ES differenziazione in vitro, e (3) la combinazione di entrambe le tecniche per generare allineato funzionale tessuto miocardico.

Protocollo

Il protocollo di generare allineato tessuto funzionale del miocardio può essere divisa in tre parti principali. La fabbricazione del master micropatterned utilizzando tecniche di litografia morbida non è considerato parte del protocollo seguente, ma può essere fatta in base al metodo stabilito ^6.

1. Stampa microcontact di fibronectina su PDMS Substrati

1. Mescolare Sylgard 184 (Dow Corning) elastomero PDMS in una base da 10:1 a curare il rapporto agente e degassare l'assembly utilizzando un essiccatore per eliminare eventuali bolle d'aria.
2. Cure PDMS contro un master precedentemente fabbricato con 20 micron di larghezza e 2 micron alti crinali, separati da 20 micron spaziatura sia per 2 giorni a temperatura ambiente o 4 ore a 65 ° C per ottenere microtextured francobolli PDMS.

* Curare in un essiccatore è altamente raccomandato per eliminare eventuali bolle d'aria.

3. Spin cappotto PDMS su vetrini coprioggetto di vetro (ad esempio,22x22 mm) a 5.000 rpm per 2 minuti usando un rivestitore a rotazione Headway produrre sottile e uniforme PDMS substrati di spessore 15 micron.
4. Pulire francobolli con il 70% di etanolo per rimuovere la polvere e le particelle di sporco. Lasciate asciugare all'aria.

Francobolli * può essere utilizzato più volte, però, rinnovando francobolli PDMS su base regolare è raccomandato a causa di una abrasione della superficie nel tempo.

5. Francobolli di luogo in un plasma-Prep Cleaner SPI II al plasma e di processo per 1 min a 275 mTorr per renderizzare superfici PDMS idrofilo.

Ossigeno * trattamento al plasma dovrebbe essere guardato. Tempi di trattamento più lunghi possono causare la rottura del elastomero.

6. Sterilizzare francobolli con etanolo al 70% per 1 min. Asciugare rapidamente con aria compressa.

* Ulteriori misure devono essere eseguite in una cappa di sicurezza biologica per mantenere la sterilità.

7. Coprire timbro superfici con Fibronectin soluzione (50 mg / ml in DDH ₂ O). Lasciare assorbire almeno 10 min.
8. Scuotere soluzione fibronectina dai francobolli e asciugare rapidamente con aria compressa.
9. Stabilire contatto conforme tra francobolli e PDMS substrati per 2 minuti e premere con decisione.
10. Sciacquare substrati micropatterned con DDH ₂ O. Conservare in DDH ₂ O per un massimo di 2 settimane a 4 ° C, salvo inizialmente utilizzato. Conservare PDMS francobolli in DDH ₂ O.

2. Manutenzione di doppie linee staminali embrionali transgeniche

In primo luogo, preparare i seguenti supporti per la coltura di cellule di topo ES:

Fibroblasti embrionali di topo (MEF)-Medium: Dulbecco modificato (DMEM), 10% di siero fetale bovino (FBS) ES cellule o Differenziazione-grade, 1% penicillina-streptomicina (P / S)

Cellule staminali embrionali (ESC)-Medium: DMEM, 15% FBS cellule ES-grade,1% Aminoacidi non essenziali (NEAA), 0,5% P / S, 0,2% leucemia inibitorio Factor (LIF), 0,0007% 2-mercaptoetanolo (2-ME)

1. Cappotto piastre da 6 pozzetti con 0,1% di gelatina sterile in DDH ₂ O e lasciate assorbire 15 min a 37 ° C.
2. Aggiungere MEFs da una aliquota scongelati a 50 ml PBS in una provetta conica e centrifugare loro a 1.000 rpm per 5 min. Risospendere in MEF MEF-media.
3. Dopo l'assorbimento, aspirare l'eccesso gelatina e aggiungere MEF nei pozzetti. Lasciare MEF 1 giorno a fissare.

* Una aliquota di 10 milioni di MEF è sufficiente per 3 piastre da 6 pozzetti.

4. Quando MEFs sono attaccati, aggiungere cellule ES da una aliquota scongelati a 50 ml PBS in una provetta conica e centrifugare loro a 1000 rpm per 5 min. Risospendere le cellule ES in ESC-media e aggiungerli ai pozzetti contenenti MEF. Cultura cellule ES in ESC-medio fino a confluenza è raggiunto.

* Una volta che le cellule staminali hanno raggiunto confluenza, passaging è requIRED per evitare la crescita eccessiva e mantenere colonie di cellule ES.

5. Preparazione delle cellule ES per passaging. Aspirare ESC-media e lavare una volta con PBS sterile.
6. Aspirare PBS e aggiungere 500 ml di tripsina. Processo di 3,5 minuti a 37 ° C.
7. Pipettare la soluzione tripsina su e giù diverse volte per abbattere colonie di cellule ES e neutralizzarla con 500 ml di ESC-media.
8. Cellule ES passaggio secondo il rapporto desiderato, ad esempio 33 microlitri trasferimento ad un altro ben preparato precedentemente con MEFs al passaggio 1/30. Mantenere le cellule ES in ESC-Medium.

* Un rapporto di passaggio di 1/30 consente alle cellule staminali di raggiungere la confluenza entro 3 giorni. Cellule ES Passage secondo il vostro programma nel differenziamento in vitro.

3. Differenziamento in vitro di doppie linee di cellule staminali embrionali transgeniche cellulari e isolamento e il seeding dei progenitori cardiaci

In primo luogo, preparare il followisupporti ng necessario per la differenziazione in vitro di cellule staminali:

Adattamento-Medium: Medio Iscove Modified Dulbecco (IMDM), il 15% delle cellule ES FBS-grade, 1% NEAA, 0,5% P / S, 0,2% LIF, 0,0007% 2-ME

Differenziazione-Medium: IMDM, 15% FBS Differenziazione-grade. 1% NEAA, 0,5% P / S, 0,35% di acido ascorbico 0,1 M, 0,0007% 2-ME

1. Avviare il differenziamento in vitro, quando le cellule ES hanno raggiunto confluenza. Cappotto 10 piatti di coltura sterile cm con 0,1% di gelatina in DDH ₂ O e lasciarlo assorbire 15 min a 37 ° C.

* Essere consapevoli della durata del processo di differenziazione in vitro. Ci vogliono 8 giorni fino progenitori cardiaci può essere isolato. Organizza il tuo esperimenti di conseguenza.

2. ES cellule Harvest come prima. Dopo l'assorbimento, aspirare l'eccesso gelatina e aggiungere circa 1/3-1/2 della sospensione cellulare ES alla cultura preparatapiatti contenenti Adaptation-media. Cellule di coltura per 2 giorni.

* Scegli la quantità di cellule ES per l'adattamento in base alle proprie esperienze.

3. Harvest adattato cellule ES in una provetta da 50 ml contenente PBS usando 1. 5 ml di tripsina. Centrifugare le cellule ES dissociate a 1000 rpm per 5 minuti e risospendere in Differenziazione-media.
4. Fai corpi embrionali (EBS) di circa 1.000 cellule per 10 microlitri in calo piatti cm 15 di coltura utilizzando una pipetta multicanale. Capovolgere le piastre e la cultura EBS come appendere gocce per 2,5 giorni a 37 ° C.
5. Dopo 2,5 giorni, piscina EBs di 6-8 cm 15 piatti di coltura in uno utilizzando Differenziazione-media e la cultura li per altri 3,5 giorni a 37 ° C.
6. Dopo 3,5 giorni, raccogliere EBs in un tubo da 50 ml conica e far loro si depositano sul fondo per circa 5 min. Aspirare il surnatante e lavare EBS con PBS sterile. Lasciate EBs affondare di nuovo verso il basso per caoximately 5 min.
7. Dissociate EBs elaborando con 2. 5 ml di tripsina per 2 minuti in un bagno d'acqua a 37 ° C agitando la provetta dolcemente. Quindi, aggiungere 2. 5 ml di PBS sterile alla soluzione tripsina e pipettare su e giù con una pipetta 10 ml sierologica circa 8-10 volte per abbattere cluster cellulari. Neutralizzare tripsina con 10 ml di tampone FACS contenente 7,5% FBS cellule ES-o-Differenziazione grado e 0,01% in PBS DAPI.
8. Centrifugare dissociato EBs a 1000 rpm per 5 minuti e risospendere in circa 1 ml di tampone FACS. Pipettare su e giù con una pipetta 1 ml circa 8-10 volte per abbattere cluster cellulari.

* Aggiungi tampone FACS in base alla quantità stimata di dissociata EBS. Cellule ad essere estremamente concentrati possono ostruire durante FACS e le cellule concentrate troppo bassi possono prolungare il tempo di FACS inutilmente.

9. Trasferire le cellule a una sterile a fondo rotondo tubo con un colino cella 35 micron per ottenereuna sospensione singola cella.
10. Cellule ES Ordina differenziate utilizzando un citofluorimetro FACSAria e ottenere purificata popolazioni di CVP.

* Abbiamo sviluppato un multi-step strategia di gating per isolare altamente purificate celle colorate. In breve, abbiamo primo cancello sulla ampiezza forward scatter (FSC-A) e Scatter ampiezza laterale (SSC-A) (Figura 1A). Questo ci permette di separare le cellule intere da detriti cellulari. Abbiamo poi cancello FSC-A e Forward Scatter-Larghezza (FSC-W) (Figura 1B). Questo ci permette di isolare cellule canottiere da doppiette e altri aggregati cellulari. Abbiamo poi cancello SSC-A e Side Scatter-Larghezza (SSC-W) (Figura 1C). Questo aumenta la purezza singoletti cellulari. Abbiamo poi cancello colorazione DAPI per isolare cellule vitali (DAPI-negativi) da cellule non vitali (Figura 1D). Abbiamo poi cancello Phycoeryhthrin ampiezza (PE-A) e PE-Cyanine colorante 7 Ampiezza (PE-Cy7-A) per ottenere vera rosso-positivo (R ⁺ ) e True Red-negativi (R ^- cellule) e di escludere autofluorescenti rosso-negativi cellule (Figura 1E). R ⁺ e R ^- le cellule sono poi gated separatamente ampiezza isotiocianato di fluoresceina (FITC-A) e PE-A per ordinare i veri verde-positivi ⁽⁺ G) e vero verde-negativi (G ^-), le cellule all'interno di queste popolazioni (Figura 1F + 1G). Ciò si traduce in 4 popolazioni di cellule come segue: R ⁺ G ^+, R ⁺ G ^-, R ^- G ⁺ e R ^- G ^- (Figura 1H).

11. Passivare micropatterned substrati con 1% Pluronic F-127 in DDH ₂ O per 10 min. Poi, lavarli 3 volte con PBS sterile.

* Pluronic F-127 è un tensioattivo che blocca l'adesione cellulare. Supporta confinamento di adesione delle cellule alla zona micropatterned.

12. Fissare le guarnizioni PDMS in tutta la regione modellatae premere con decisione. Poi, CVP seme su fibronectina substrati micropatterned.

Risultati

FACS-purificazione di cellule staminali in vitro differenziate rivelato quattro popolazioni distinte di progenitori (Figura 1). La presenza di micropatterned fibronectina è stata confermata da immunofluorescenza che visualizzato un completo trasferimento di fibronectina linee continue (Figura 2). Placcatura di FACS-progenitori isolati su microdisegnature fibronectina ha comportato l'allineamento della R ⁺ G ⁺ e parte del R ^- G ⁺ popol...

Discussione

In questo protocollo, abbiamo presentato un metodo per isolare popolazioni purificate di cellule progenitrici cardiogeno e alle sementi li micropatterned substrati fibronectina ciò che permette loro di allineamento e di prendere un miociti cardiaci forma a bacchetta. Normale organizzazione cellulare è fondamentale per la funzione tessuto normale ^8,10, in particolare per il tessuto miocardico. Miociti cardiaci hanno dimostrato di sviluppare meccaniche migliorate proprietà elettrofisiologiche ^11,12 e...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del materiale	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acido L-ascorbico	Sigma-Aldrich	A4544	Preparare la soluzione 0.1M in DDH 2 O
Essiccatore, vuoto da 10 pollici	Nova-Tech International, Inc.	55206
4 ',6-Diamidino-2-fenilindolo, cloridrato (DAPI)	Life Technologies	D1306
Eagle modificato da Dulbecco Medio	Thermo Scientific	SH30022.01
DPBS	Gibco	14190
FACSAria II Citofluorimetro	BD Biosciences
Siero fetale bovinoCellule ES-grade	Gemini Bio-Prodotti	100-106
Fetal Bovine Serum Differenziazione-grade	Gemini Bio-Prodotti	100-500
Fibronectina da plasma bovino	Sigma-Aldrich	F4759	Solubilizzare a 1 mg / ml in DDH 2 O
Fisherfinest Premium copertura di vetro 22x22mm	Fisher Scientific	12-548-B
Gelatina da pelle suina	Sigma-Aldrich	G1890	Preparare una soluzione 0,1% in DDH 2 O
Headway Spin Coater	Headway Research, Inc.	PWM32-PS-CB15
Medio Iscove Modified Dulbecco	Thermo Scientific	SH30228.01
Fattore inibitorio di leucemia	Se stesso-Preparato da LIF-secernenti linee cellulari		Preparare la soluzione 500x magazzino
MEM aminoacidi non essenziali	Gibco	11140-050
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250
I fibroblasti embrionali di topo	Raccolti da giorni 12-15 embrioni di topo
Penicillina-Streptomicina	Gibco	15140-122
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443	Preparare una soluzione all'1% in DDH 2 O
Round-Provetta a fondo con 35 filtro cella pm	BD Biosciences	352235
SPI plasma-Prep II Plasma Cleaner	SPI Forniture	11005-AB
Sylgard184 Kit di silicone elastomero	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
0,25% tripsina-EDTA	Gibco	25200-056
Vacuometro	SPI Forniture	11019-AB