Summary
对齐心肌组织的产生是一个关键的要求，适应干细胞生物学的最新进展，临床上有用的目的。在这里，我们描述了一个微接触印刷方法的精确控制细胞的形状和功能。使用高度纯化群体中的胚胎干细胞源性心肌祖细胞，然后产生各向异性功能的心肌组织。
Abstract
充血性心脏衰竭是一个重大的未满足临床的挑战，可行的和/或功能齐全的心肌细胞所产生的损失。尽管最佳的药物治疗，心脏衰竭的发病率和死亡率在发达国家的首要原因。在药物开发的一个主要挑战是确定的细胞分析，准确地概括了人类正常和病变心肌生理特性的影响 。同样，心脏再生生物学的主要挑战围绕特定病人的心脏祖细胞的数量在临床相关的识别和分离。这些细胞，然后组装成类似于天然心脏组织架构允许创建精确的微图案的的蛋白质形状类似的组织结构的心。微接触印刷的功能性组织，从而提供了控制细胞黏附空间的几何线索。于此我们描述我们的方法隔离的高度纯化的心肌细胞在体外 ，微图案与胞外基质蛋白的细胞的生长表面的生成由多能干细胞分化的干细胞来源的心肌细胞的到各向异性心肌组织中的组装。
Introduction
尽管在药物治疗的最新进展，先进的心脏衰竭的发病率和死亡率在发达国家仍然是一个领先的原因。出现临床综合征，功能性心肌组织的亏损，随后衰竭的心脏无法满足代谢的需求受影响的个人。由于心脏的再生能力是有限的，自体心脏移植是目前唯一临床接受治疗的直接目的是补充失去功能的心脏组织。心脏移植的显着的缺点，包括有限数量的供心和长期免疫抑制治疗，需要排除这种疗法的广泛普及使用。因此，与心脏疾病的患者，药物治疗是主要的治疗方法。在药物开发的一个主要挑战是确定的细胞分析，准确地概括正常和病变心肌生理特性的影响 。
最近收敛的干细胞与组织工程技术提出了新的心肌再生的可行途径。从可再生的病人特定的源生成功能的心肌组织将在该领域的一大进步。这将允许特定疾病的细胞实验药物开发和发现的发展，并会为心脏再生医学奠定了基础。人类胚胎干细胞（ES）和，更重要的，人类诱导多能干细胞（iPS）细胞代表一个潜在的可再生室祖细胞和心室肌细胞的成熟病人的具体来源。干细胞生物学和组织工程战略的组合解决了这个问题，通过产生用于药物开发的或先进的心脏衰竭的治疗在心脏再生的方法的发展中的细胞分析，可以使用的功能在体外的心脏组织。
_content“> A的主要挑战一直在心肌再生的最佳细胞类型的鉴定。一个广泛的细胞进行了研究，但到今天为止，已经发现虽然不同从各种来源具有多源性前体，一个细胞的识别源，以满足如承诺生肌细胞命运的关键要求，维修能力扩大在体内或在体外和组合物的功能性心肌组织已被证明是一个中心问题2。我们以前曾描述了一种双转基因小鼠系统承诺心室祖细胞（CVP）， 在体外由ES细胞分化的高度纯化的种群的隔离，使我们产生了一种新的双转基因小鼠表达红色荧光蛋白DsRed的ISL1依赖增强剂的MEF2C基因的控制下，并增强型绿色荧光蛋白的控制下心脏特异性NKX2.5增强。基于这两种颜色的荧光报道系统，第一和第二心脏领域祖细胞从显影的ES细胞中，可以通过荧光激活细胞分选术（FACS）根据它们的表达MEF2C和Nkx2.5基因分离。 CVP类似心肌细胞，心肌标志物及结构与功能品质，提供了巨大的潜力心脏组织再生的目的的表达模式的基础上。虽然已经有许多组织工程领域的进步，模仿原生细胞结构仍然是一个关键的挑战。传统的方法来应对这一挑战，包括种子细胞在体外的生物或人工合成的支架。由于一些弊端的棚架，包括迅速降解，有限的物理和机械稳定性和低细胞密度1,4,5，我们试图工程支架的组织。 Alt键尽管心肌细胞可以修改自己的局部微环境细胞外基质蛋白的分泌，他们有一个更有限的能力，组织起来，杆状心肌细胞在没有外线索。因此，需要一个模板，提供适当的空间和生物细胞的线索，组成功能性心肌组织。微接触印刷解决这个难题，提供一种简单和廉价的技术，能够精确地控制细胞的形状，组织，和功能6-8，所有这一切都是至关重要的对齐的功能性心肌组织的生成。它包括使用的微织构的聚二甲基硅氧烷（PDMS）的特征尺寸范围下降至2μm9，使胞外基质蛋白的沉积在精确的图案的PDMS基板上，从而影响细胞的粘附空间的邮票。
在此，我们建议组织生物工程技术相结合的干CEL升生物产生各向异性功能的心肌组织。因此，我们在这里展示我们最近发表的方法为如下：（1）生成的微图案蛋白质表面上的PDMS基板通过微接触印刷的模板的对齐的心肌组织的生成，（2）的高度纯化的心脏祖细胞从隔离ES细胞分化在体外的 ，和（3）这两种技术的组合，以产生对准功能性心肌组织。
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Protocol
生成对齐的功能性心肌组织的协议可分为三个主要部分组成。使用软光刻技术制造的微图案主不考虑了以下协议的一部分，但可以根据建立的方法6。
1。微接触印刷PDMS基板上的纤维连接蛋白
- 混合SYLGARD184（道康宁）PDMS弹性体固化剂的比例和脱气组件，使用干燥器，以消除任何气泡在10:1的基础。
- 对先前制造的主站与宽为20μm和2μm的高大脊，分离了20微米的间距为要么是2天，在室温下或4小时，在65℃，得到的微织构的PDMS邮票PDMS固化。
*固化在干燥器中强烈建议，以消除任何气泡。
- 到盖玻片（ 例如旋涂PDMS22x22毫米）在5,000 rpm下，持续2分钟，使用也是Headway自旋涂布机产生薄而均匀的厚度为15μm的PDMS基板。
- 去除灰尘和污垢颗粒，用70％乙醇清洁邮票。让它们空气干燥。
*邮票可以多次使用，但是，定期更新PDMS邮票的建议因表面磨损随着时间的推移。
- 将邮票在一个SPI等离子准备II等离子清洗机和1分钟，在275毫呈现PDMS表面亲水性。
*氧等离子体处理应关注。较长的处理时间可能会导致弹性体开裂。
- 消毒，用70％乙醇中1分钟的邮票。用压缩空气干燥迅速。
*采取进一步的措施，应在生物安全柜中进行，保持无菌。
- 盖邮票表面与Fibronectin溶液（DDH 2 O中的50微克/毫升）。让它吸附的至少10分钟。
- 从邮票甩掉纤维连接蛋白的解决方案和快速干燥压缩空气。
- 建立适形邮票和PDMS基板之间的接触2分钟，然后用力按压。
- 冲洗DDH 2 O的微图案化基板它们存储在DDH 2 O 2周，在4°C，除非最初用于最大。商店的PDMS邮票在DDH 2 O。
2。维护的双转基因胚胎干细胞系
首先，需准备以下媒体培养小鼠胚胎干细胞：
小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）媒介：Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM），10％胎牛血清（FBS）的胚胎干细胞或分化级，1％青霉素-链霉素（P / S）
胚胎干细胞（ESC）的媒介：DMEM，15％FBS的ES细胞级1％非必需氨基酸（NEAA），0.5％（P / S），0.2％，白血病抑制因子（LIF），0.0007％2 - 巯基乙醇（2-ME）
- 涂层6孔板用无菌的0.1％明胶DDH 2 O中，并让它吸附15分钟，在37℃下
- 从解冻的等分试样添加的MEF在锥形管中的50毫升PBS和离心机在1,000 rpm离心5分钟。重悬MEF中在MEF介质。
- 经过吸附，吸出多余的明胶和MEF中添加入井。允许的MEF 1日至连接。
*等分千万的MEF足以3 6 -孔板。
- 附上的MEF时，添加从解冻的等分试样，以50毫升PBS ES细胞在一个锥形管和离心机在1,000 rpm离心5分钟。的重悬ES细胞在ESC介质，并将其添加MEF中的孔中。融合文化ES细胞ESC介质，直到达到。
*一旦ES细胞达到汇合，传代的热曲红外发光二极管，以避免过度生长和维持ES细胞集落。
- 准备的ES细胞的传代。吸液ESC介质，并用无菌PBS洗一次。
- 吸出PBS，加入500μl胰蛋白酶。流程3.5分钟，37°C。
- 移液器的胰蛋白酶溶液，向上和向下几次打破ES细胞集落的中和用500μl的ESC介质。
- 通过ES细胞根据您所需的比率， 例如转移33μl到另一家与事先准备好的MEF中通过1/30。维持ES细胞在ESC中。
*一个通道的1/30的比率允许ES细胞在3天内达到汇合。根据通道ES细胞在体外分化时间表。
（3） 在体外分化的双转基因胚胎干细胞系和心脏祖细胞的分离和幼苗生长的
首先，准备followi纳克媒体的胚胎干细胞在体外分化为：
适应媒介：Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基（IMDM），15％FBS的ES细胞级，1％NEAA，0.5％，P / S，0.2％LIF，0.0007％2-ME的
分化中：IMDM，15％FBS级分化。 1％NEAA，P / S，0.35％，0.0007％的0.1M抗坏血酸0.5％2-ME的
- ES细胞在体外分化开始时已经达到汇合。外套10厘米的培养皿中，用无菌的0.1％明胶DDH 2 O中，并让它吸附15分钟，在37℃下
*成为知道在体外分化过程的持续时间。需要8天，直到心脏祖细胞可以分离。相应地设计您的实验。
- 像以前一样的收获ES细胞。吸附后，吸出物过量的明胶，约1/3-1/2的ES细胞悬浮液添加到制备的培养适应介质的培养皿中。培养细胞2天。
*选择适应的胚胎干细胞的数量根据你的实验。
- 收获适于ES细胞入50毫升含锥形管中的PBS中，用1。胰蛋白酶5毫升。离心离解的ES细胞以1,000 rpm离心5分钟，和他们在分化培养基中重悬。
- 进行胚状体（EB），约1,000个细胞每10微升在15厘米的培养皿中的下拉使用一个多通道移液管。反转的盘子和文化的EB挂滴2.5天，在37°C。
- 后2.5天，池类胚体的6-815厘米培养皿到一个使用分化介质并进行培养在37℃下进一步3.5天中
- 经过3.5天，收集的EB，在一个圆锥形50毫升的试管中，并让他们沉到了底部约5分钟。吸取上清液，用无菌PBS洗胚体。让我们再次胚体下沉的底部为APPRoximately 5分钟。
- 游离的EB处理他们2。 5毫升的胰蛋白酶中2分钟，在水浴中，在37℃下振荡管轻声。然后，添加2。 5毫升的无菌PBS中的胰蛋白酶溶液，向上和向下与10毫升的血清学吸管吸取试剂约8-10倍打破细胞团。中性化胰蛋白酶与10毫升的FACS缓冲液中含有7.5％FBS的ES细胞或分化级，并在PBS中的0.01％的DAPI。
- 解离胚体在1,000 rpm离心5分钟，它们在约1ml的FACS缓冲液中重悬。 1毫升移液管移液管向上和向下分解细胞团约8-10倍。
* FACS缓冲液中添加游离的EB估计金额。过于高度集中的细胞可能会堵塞在FACS，，也低浓度细胞可能会不必要地延长FACS时间。
- 转移细胞到无菌的圆底管与一个35微米的细胞过滤器，以获得单细胞悬浮液。
- 排序分化的胚胎干细胞的使用FACSAria流式细胞仪，并获得纯化群体中的CVP。
*我们开发了一个多步骤的选通策略，以隔离高度纯化的着色细胞。简单地说，我们第一门上的前向散射振幅（FSC-A）和侧向散射光的幅度（SSC-A）（ 图1A）。这让我们分开整个细胞从细胞碎片。然后，我们门上的FSC-A和前向散射宽度（FSC-W）（ 图1B）。这使我们能够分离细胞汗衫，双峰和其他细胞聚集。然后，我们门上SSC-A和侧向散射光宽度（SSC-W）（ 图1C）。这增加了细胞汗衫纯度。然后，我们栅极上的DAPI染色，隔离活细胞（DAPI染色阴性）从非存活细胞（ 图1D）。然后，我们门上Phycoeryhthrin幅度（PE-A）和PE-菁染料幅度（PE-CY7-A），以获得真正的红色正相关（r + - ）细胞，并排除自身荧光的红色阴性细胞（ 图1E）。 R +，R -细胞，然后选通分别对异硫氰酸荧光素的幅度（FITC-A）和PE-A排序真正的绿色环保阳性（G+）和真正的绿色阴性（G - ）细胞在这些人群中（ 图1F + 1G）。这样的结果在4的细胞群体，如下所示：R + G +，R + G - ，R - G +和R - G - （ 图1H）。
- 钝化微模式基片，用1％的Pluronic F-127 DDH 2 O中的10分钟。然后，用无菌PBS洗3倍。
*的Pluronic F-127是一种表面活性剂，阻止细胞粘附。它支持禁闭的细胞粘附到微图案的面积。
- 附加的图案化区域周围的PDMS垫片然后用力按压。然后，种子CVP纤维连接蛋白微图案基板上。
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Representative Results
FACS纯化在体外分化的ES细胞中显示的前体细胞（ 图1）的四个不同的种群。微图案纤连蛋白的存在下，确认通过免疫荧光显微镜连续纤维粘连蛋白线（ 图2）显示一个完整的转印。到纤维连接蛋白微图形电镀的的FACS隔离祖导致调整R + G +的R - G +人口。的Pluronic F-127虽然作为一个支持细胞粘附阻断剂使用，在R + G -和R - G -种群没有尊重各向异性的纤连蛋白结构和成长为相邻的的蛋白质线（ 图3）之间的空间。
图1。 Represe流式细胞仪图ntative第6天， 在体外分化的ES细胞。（A）浇注前向散射振幅（FSC-A）和侧向散射振幅（SSC-A）（B）门控FSC-A和正向分散宽（ FSC-W）（C）（E）门控SSC-A和侧向散射光宽度（SSC-W）。（D）门控DAPI染色。选通Phycoeryhthrin（PE）和PE-菁染料（PE- CY7）。门异硫氰酸荧光素的幅度（FITC-A）和PE-A（H）流式细胞仪情节揭示不同人群的祖：R + G +，R + G - ，R - G +（F，G） R - G - 点击这里查看大图 。
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图2。代表的微图案纤连蛋白底物的免疫荧光显微镜。比例尺，80微米。
图3。代表荧光显微镜的胚胎（A）和ES细胞衍生的（B）FACS隔离祖细胞后5天的文化对纤维连接蛋白微细核，蓝色; SMMHC，红色，肌节α-辅肌动蛋白，绿色。比例尺，40微米。转载自网域内等人 （2009年）。
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Discussion
在这个协议中，我们提出了一个方法，心源性祖细胞分离纯化的人口和种子微图案纤连蛋白底物是什么让他们调整和采取心肌细胞杆形。正常的细胞组织是正常组织的功能8,10，特别是用于心肌组织的关键。已经示出心肌细胞发展改进的机械11,12和形成各向异性单元阵列时的电生理特性11,13。由于微图案纤连蛋白底物上培养的心脏祖细胞棒状的心肌细胞在体外分化成，这代表apivotal的步骤心脏组织内生物工程。
微接触印刷是一种简单和廉价的工具，它可以用于产生类似于体外心肌组织中的 2 -维的模板。然而，有效的和成功的图案提取ellular基质蛋白依赖关键蛋白质的选择。而大的多种不同的蛋白质已被成功地加盖到PDMS基板，某些蛋白质，如I型胶原，要求基板的PDMS表面改性之前，微接触印刷14。此外，施加的压力量，以及邮票作为冲压的持续时间也可以极大地影响微接触印刷的效率和保真度。
在该协议中的另一个关键步骤是使用的等离子净化器，使PDMS邮票亲水性的表面。这是众所周知的，微接触印刷的PDMS邮票和基板时，不会发生不进行氧等离子体处理15，和几组发现，调谐的PDMS基板的润湿性是必需的，以便使转印的蛋白质可能3,6 ，15。然而，我们发现，增加的亲水性PDMS印章，而不是PDMS基板结果更均匀的蛋白质微图形具有更高的质量，如少破坏或不完全蛋白质。
对于所提出的协议，选择微细图案的宽度为20μm，根据小鼠新生儿心肌细胞16的报告的单元格的宽度。然而，应进行的微图案的制造在一个物种和心脏发育阶段依赖16-20的方式，以防止由于空间有限的细胞存活率的相对影响。
ES细胞来源的CVP，特别是R + G+人口的发现和纯化，使心脏组织内的可靠的研究生物工程。值得一提的是，我们观察到我们的胚胎干细胞源性心肌祖细胞能够维持其细胞排列形成承包心肌组织。由于构建三维功能组织是组织生物工程领域中的一个重要目标，我们生成的二维各向异性心肌组织可以有效地使用多个细胞片层，如先前描述的其它类型的细胞21,22的其他组。然而，迄今为止，报告系统的转基因的一个限制是在体外分化的ES细胞的结果。 FACS提供CVP，尤其是强心源性R + G +人口，目前帐户的近似平均0.5％的所有分化的细胞。因此，提高的胚胎干细胞在体外分化成CVP将产生足够数量的CVP建立较大的各向异性心脏组织组成的纵向排列的心肌纤维的重要一步。
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Disclosures
作者宣称，他们没有竞争的金融利益。
Acknowledgments
这部分工作是在纳米系统（CNS），在该中心的成员，这是由美国国家科学基金会的支持下，美国国家科学基金会奖没有国家纳米技术基础设施网络（NNIN）。 ECS-0335765。 CNS是哈佛大学的一部分。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Prepare 0.1M solution in ddH2O |
| Desiccator, Vacuum 10 inch | Nova-Tech International, Inc. | 55206 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| FACSAria II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum ES cell-grade | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Fetal Bovine Serum Differentiation-grade | Gemini Bio-Products | 100-500 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F4759 | Solubilize to 1 mg/ml in ddH2O |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 22x22mm | Fisher Scientific | 12-548-B | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | Prepare 0.1% solution in ddH2O |
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc. | PWM32-PS-CB15 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | Thermo Scientific | SH30228.01 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | Self-prepared from LIF-secreting cell lines | Prepare 500x stock solution | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Harvested from day 12-15 mouse embryos | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Prepare 1% solution in ddH2O |
| Round-Bottom Tube with 35 μm cell strainer | BD Biosciences | 352235 | |
| SPI Plasma-Prep II Plasma Cleaner | SPI Supplies | 11005-AB | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Vacuum Gauge | SPI Supplies | 11019-AB |
References
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