Summary
Células neuroprogenitoras Humanos (CPN) se ampliaron en condiciones proliferantes. NPC se diferenciaron en cultivos de neuronas-rica en la presencia de una combinación de neurotrofinas. Marcadores neuronales se detectaron por tinción de inmunofluorescencia. Para aislar una población pura de las neuronas, NPCs se diferenciaron en láminas de membrana PEN y se realizó con láser captura microdissection.
Abstract
Células neuroprogenitoras (NPC) aislados a partir de cerebro fetal humano se ampliaron en condiciones proliferativas en presencia de factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) para proporcionar un suministro abundante de células. NPC fueron diferenciadas en la presencia de una nueva combinación de factor de crecimiento nervioso (NGF), derivado del cerebro factor neurotrófico (BDNF), dbAMPc (DBC) y ácido retinoico en platos recubiertos con poli-L-lisina y laminina de ratón para obtener neurona ricas culturas. NPC también se diferenciaron en ausencia de las neurotrofinas, DBC y ácido retinoico y en presencia de factor neurotrófico ciliar (CNTF) para producir cultivos de astrocitos-rica. NPC diferenciadas se caracterizan por la tinción de inmunofluorescencia para un panel de marcadores neuronales incluyendo NeuN, sinapsina, la acetilcolinesterasa, sinaptofisina y GAP43. Proteína glial fibrilar ácida (GFAP) y STAT3, marcadores de astrocitos, se detectaron en el 10-15% de los NPCs diferenciadas. Para facilitartipo de célula caracterización molecular específica, se realizó la captura de microdisección láser para aislar las neuronas cultivadas en polietilennaftalato (PEN) se desliza de membrana. Los métodos descritos en este estudio proporcionan valiosas herramientas para avanzar en nuestra comprensión de los mecanismos moleculares de la neurodegeneración.
Introduction
Neurogénesis largo de la vida se sabe que se producen en la zona subventricular de los ventrículos laterales y en la capa de subgranular del giro dentado del cerebro adulto de mamíferos 1. Células neuroprogenitoras (NPCs) que se originan en estas regiones son células pluripotentes que pueden diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos 2. NPC han generado interés debido a su potencial para ser trasplantadas en pacientes con diversos trastornos neurodegenerativos incluyendo la enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, accidente cerebrovascular y enfermedad de Alzheimer (EA) 3. Los estudios con NPCs han centrado generalmente en este ángulo el trasplante, pero el potencial de las neuronas derivadas de la APN como un modelo de cultivo celular para determinar el mecanismo de neurodegeneración no se ha explotado plenamente. Estudios previos han utilizado generalmente las neuronas post-mitóticas aisladas de tejidos cerebrales de roedores que necesitan ser aislados para cada experimento, ya que no sonauto-renovación. Aunque las líneas celulares de neuroblastoma humano incluyendo las células SK-N-MC SH-SY5Y y se pueden ampliar, que no tienen las características de las neuronas primarias. NPC Humanos, por otro lado, ofrecen tanto ventajas porque pueden ser expandido para múltiples pasajes y se pueden diferenciar para generar una población de células con las características de las neuronas primarias de 4,5. En el presente estudio, se describe un nuevo protocolo de diferenciación para obtener una población de neuronas ricas consistente de NPCs disponibles comercialmente aisladas de cerebro fetal humano. Debido a que estos cultivos contienen un pequeño porcentaje de las células gliales, que necesitamos métodos adicionales para aislar una población pura de las neuronas para la caracterización molecular. Microdisección de captura por láser (LCM) es una nueva técnica por la que una población homogénea de células de una sección de tejido puede ser capturado de forma selectiva para el análisis de la expresión génica 6. El cerebro es un tejido heterogéneo que consta de neuronas, glía y otras células Types. LCM se ha utilizado para determinar la expresión génica específica de las neuronas análisis 7-10. Hemos realizado anteriormente mcm de las neuronas del hipocampo de AD (Tg2576) secciones de cerebro de ratón para mostrar disminución de la expresión de la proteína de unión al elemento de respuesta a AMP cíclico (CREB) y BDNF específicamente en las neuronas del hipocampo 11. En el presente estudio, se describe los procedimientos para la expansión de los NPCs humanos, la diferenciación neuronal, la tinción de inmunofluorescencia de marcadores neuronales y LCM para el aislamiento de las neuronas cultivadas en portaobjetos de membrana PEN.
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Protocol
1. La expansión de los NPCs Humanos (Figura 1)
- Revive la madre congelada de NPCs humanos de cerebro fetal (Lonza, Walkersville, MD, EE.UU.) y el cultivo en suspensión en matraces T-75 como neuroesferas (Figura 1A) en medio neurobasal contienen suplementos proliferación, EGF (10 ng / ml) y FGF (10 ng / ml).
- Después de 3 días en cultivo, transferir las neuroesferas a un tubo de 15 ml y centrifugar a 500 rpm durante 5 min.
- Descartar el sobrenadante dejando tras de ~ 100 l medio por encima de la pastilla de células y transferir a un tubo Eppendorf. Un pelet de 100 l de células es suficiente para dividir en 2 matraces T-75. Si menos, reducir el número de frascos como células neuroprogenitoras fallan a proliferar si dividir delgada.
- Se tritura el precipitado con una punta l 50x 200 mientras se mantiene la punta 200 l contra la parte inferior del tubo. Divida la suspensión de células por igual en dos partes y añadirlos a 2 T-75 frascos (1-2), una división de continuarla expansión y la otra para la diferenciación.
- Continuar con el cultivo de las células neuroprogenitoras de expansión (primer matraz) cambiando el medio cada 4-5 días hasta que las neuroesferas alcanzan su tamaño original de 300-500 micras. Cambie medio por centrifugación (500 rpm, 5 min), se elimina el medio viejo y añadir nuevo medio.
2. La diferenciación de los NPCs humano en una cultura de la neurona-rica (Figura 2)
- Para la diferenciación de las células neuroprogenitoras en una rica cultura de la neurona, coloque un solo cubreobjetos en cada pocillo de una placa de 24 pocillos y cubrir con 100 g / ml de poli-L-lisina mediante la adición de 500 l en cada pocillo. Incubar los platos durante 30 min a TA.
- Aspirar la solución de poli-L-lisina y enjuagar la placa con agua estéril.
- Después, cubra los pocillos de la placa con 500 l de 5 mg / ml de laminina de ratón y se incuba durante 30 min. Después de la incubación, lavar los pocillos con PBS.
- 4 días después splittión de las células (paso 1.4), transfiera las pequeñas neuroesferas en el frasco etiquetado «para la diferenciación 'en las placas revestidas con una densidad de ~ 500 neuroesferas por pocillo de placas de 24 pocillos.
- Después de 6 horas, cuando las neuroesferas se fijan a la placa, retire el medio de proliferación y se añade medio de diferenciación consiste en medio neurobasal, suplemento de B27, NGF (20 ng / ml), el BDNF (10 ng / ml), DBC (100 mM), y ácido retinoico (2 M).
3. Inmunofluorescencia tinción de Diferenciados NPCs (Figura 3)
- Después del cultivo de las células neuroprogenitoras en medio de diferenciación neuronal durante dos semanas, se obtiene un cultivo de neuronas-rica. Enjuague las neuronas una vez en PBS y luego fijar en paraformaldehído al 4% durante 30 min. Una vez fijado, enjuagar las células tres veces con PBS.
- Se incuban las células con tampón de permeabilización (5% de BSA y 0,2% de Triton X-100 en PBS) a TA durante 60 min.
- Incubar los platos O / N a 4 ° C iagitador de NA con la siguiente combinación de anticuerpos policlonales y monoclonales en 3% de BSA en PBS: NeuN (1:250) y sinapsina (1:250); acetil colinesterasa (1:500) y sinaptofisina (1:250); BDNF (1 : 500) y GAP43 (1:250); STAT3 (1:500) y GFAP (1:1000).
- Lavar los cubreobjetos tres veces con PBS y luego se incuban con anticuerpos secundarios anti-ratón-FITC anti-conejo-Cy3 y a temperatura ambiente en la oscuridad durante 90 min. Después de la incubación, los cubreobjetos lavar tres veces con PBS.
- Ponga 10 l de medio de montaje sobre un portaobjetos de vidrio, sacar el portaobjetos de la placa de cultivo con unas pinzas y colóquela boca abajo en el medio de montaje. Con cuidado, limpie el exceso de medio de montaje y sellar los bordes con esmalte de uñas.
- Examine las neuronas inmunoteñidas en un microscopio de fluorescencia.
4. Microdisección de captura por láser de neuronas (Figura 4)
- Diferenciar NPCs en un cultivo de neuronas ricas en PEN diapositiva membranas recubiertos con poli-L-lisina y laminina de ratón siguiendo los procedimientos descritos para la Figura 2.
- Realice todos los pasos subsiguientes en condiciones libres de RNasa.
- Teñir las culturas utilizando HistoGene Stain (Arcturus) para visualizar las células.
- Encuentra las áreas de poblaciones neuronales puras carentes de astrocitos utilizando la imagen del mapa de carreteras de toda la diapositiva con el sistema Veritas LCM. Marque las neuronas usando las herramientas de dibujo.
- Realizar captura por láser de estas áreas utilizando precisión y la automatización controlada por ordenador en un proceso de dos pasos. En primer lugar, de IR (infrarrojos) se enciende en múltiples puntos con un ajuste de potencia de láser de 70 mW y un pulso de 2500 microsegundos para obtener la membrana se adhieren a la tapa. A continuación, el área marcada se extirpa mediante una herramienta de corte de UV en un ajuste bajo nivel de 10 mV.
- La combinación de estos procesos de captura selectivamente las zonas marcadas de la membrana PEN en CapSure LCM macro tapas. Cuando se levanta la tapa, la membrana con el neurons se adhiere a la tapa.
- Aislar ARN total de muestras LCM utilizando un kit de aislamiento de ARN PicoPure (Arcturus) y tratar con DNasa.
- Amplificar el ARN aislado utilizando el kit de amplificación RiboAmp ARN siguiendo instrucciones del kit.
- Realizar Análisis en tiempo real RT-PCR utilizando sondas TaqMan para detectar neurofilamento humana de cadena pesada (hNFHc).
Abreviaturas:
AD, la enfermedad de Alzheimer; BDNF, el factor neurotrófico derivado del cerebro; CREB, la proteína de unión al elemento de respuesta al AMP cíclico; DBC, el AMP cíclico dibutiril; EGF, factor de crecimiento epidérmico; FGF, factor de crecimiento de fibroblastos; GFAP, proteína ácida glial fibrilar; LCM, laser capturar microdissection; NGF, factor de crecimiento nervioso; NPC, neuroprogenitoras celular; PEN, polietilennaftalato.
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Representative Results
Expansión de NPCs (Figura 1)
Cuando neuroesferas se descomponen a una única suspensión de células por trituración, la punta de la pipeta tiene que tocar la parte inferior del tubo de modo que haya algo de resistencia cuando la suspensión se pipetea arriba y abajo. El número de veces de la trituración varía entre los individuos y debe ser decidido por ensayo y error mediante el examen de la suspensión celular resultante con un microscopio. Es crítico para proporcionar suficiente densidad de suspensión de células porque la proliferación será a un ritmo más rápido cuando los NPC vienen en estrecho contacto. Si NPC no crecen, la densidad celular debe ser aumentada mediante la reducción del número de matraces. Hemos sido capaces de ampliar las neuroesferas con capacidad para 10 a 15 pasajes. Así abundante oferta de NPCs humanos se puede generar, lo que reduce el uso de tejido fetal humano. Para el suministro continuo de NPCs y las neuronas, es deseable para expandirlas inicialmente por 3-4 pasajes y, posteriormente,, La mitad de los NPCs se puede ampliar como neuroesferas y la otra mitad se puede diferenciar para los experimentos en curso. Alternativamente, NPCs También se puede expandir para más pasajes, congelados en nitrógeno líquido como en el caso de líneas de células para generar mayor oferta de acciones, y revivieron cuando sea necesario. También es deseable llevar a cabo experimentos con las neuronas derivadas de diferentes lotes de NPC.
Diferenciación Neuronal de NPCs (Figura 2)
NPC son células multipotentes y se pueden diferenciar en neuronas, astrocitos u oligodendrocitos en función de las condiciones de cultivo. Nuestro protocolo de diferenciación implicado siembra de 4 días de edad neuroesferas en platos recubiertos (Figura 2A). Hemos observado que es esencial para sembrar densidad suficiente de manera que las neuroesferas diferenciación de las neuronas extienden alrededor y forman una densa red de procesos neuronales. Imágenes después de 1 (Figura 2B) y 4 días (Fig.2C URE) de siembra se muestran. Cultivos de neuronas ricas en rendimiento 80-90% de neuronas y astrocitos 10-15%, se obtuvieron después de la diferenciación de NPC en presencia de una combinación de NGF, BDNF, DBC y ácido retinoico durante dos semanas (Figura 2D). Para el mejor de nuestro conocimiento, el protocolo descrito en este estudio para la diferenciación neuronal no ha sido descrito previamente por otros. En las zonas de baja densidad, NPCs diferenciarse en astrocitos (Figura 2E). Para obtener un cultivo de astrocitos-rico, NPC pueden ser cultivadas en presencia de CNTF (10 ng / ml) y en ausencia de NGF, BDNF, DBC y ácido retinoico. Por lo tanto la composición de la neurona-astrocito puede ser manipulado durante la diferenciación, dependiendo del objetivo del experimento.
Caracterización de neuronas diferenciadas (Figura 3)
Para caracterizar mejor estos NPCs diferenciados, se realizó la doble inmunotinción para marcadores neuronales wpoliclonal i-ésimo y anticuerpos monoclonales, seguido de exposición a conejo y de ratón anticuerpos secundarios ligados a Cy3 (rojo) y FITC (verde), respectivamente. Se detectaron los siguientes marcadores neuronales: Figura 3A:. NeuN y sinapsina Figura 3B:. Acetil colinesterasa (AChE) y sinaptofisina Figura 3C: BDNF y GAP43. Por lo tanto, los NPCs diferenciados tienen las características de las neuronas primarias. Además, se detectaron marcadores de astrocitos GFAP y STAT3 en una pequeña población de células (Figura 3A). Por lo tanto se necesitan métodos adicionales para el análisis de la expresión génica específica de las neuronas.
Microdisección de captura por láser (LCM) de neuronas (Figura 4)
Aunque LCM puede ser utilizado para el aislamiento de células a partir de una placa de cultivo, nuestros intentos iniciales de LCM con neuronas fallidos porque están firmemente unidos a las placas revestidas. Para superar este problema, hemos diferenciado NPCs oN diapositivas con insertos de membrana PEN recubiertos con poli-L-lisina y laminina de ratón. El portaobjetos se coloca dentro de una placa de cultivo celular de 100 mm (Figura 4A). Los arreglos de la diapositiva membrana PEN y tapas de LCM se muestran en la Figura 4B. Los cultivos se tiñeron con tinción Histogen (Arcturus) para visualizar las células (Figura 4C). El portaobjetos se coloca en el microscopio en el instrumento Arcturus Veritas. Las neuronas que ser capturados fueron marcados con herramientas de dibujo (Figura 4D). CapSure HS casquillos se colocaron en la membrana PEN. Usando una combinación de corte por láser UV e IR captura por láser, se recogieron las áreas marcadas en la tapa. Las neuronas capturadas se muestran en la tapa a baja (Figura 4F) y alta (Figura 4F) de ampliación.
Figura 1.La expansión de los NPCs humanos. A. NPC se cultivaron en suspensión en matraces T75 como neuroesferas. B. Cuando las neuroesferas alcanzado el tamaño de 300-500 micras, que se transfirieron a tubos de 15 ml y se centrifugó a 1000 rpm durante 5 min. C. El sobrenadante se descartó y el sedimento de células en 200 l medio se transfirió a tubos Eppendorf y se trituró. D. neuroesferas listo para ser dividido se muestra. E. neuroesferas rotos siguientes trituración se muestran.
Figura 2. La diferenciación de los NPCs humanos. A. Neuroesferas estaban rotas por trituración y se cultivaron durante cuatro días para generar nuevas neuroesferas. B. Cuatro neuroesferas de un día se sembraron en placas recubiertas con poli-L-lisina y laminina de ratón. C. DifferentiaSe observó ción de NPCs en presencia de NGF, BDNF, DBC y ácido retinoico en tres días después de la siembra. cultura D. Neurona ricos se obtuvo después de dos semanas. E. NPCs diferenciarse en astrocitos en zonas de baja densidad. F. NPCs diferenciado en una cultura astrocito-rico en la presencia de CNTF (10 ng / ml) y en ausencia de NGF, BDNF, DBC y ácido retinoico.
Figura 3. Neuronal y marcadores de astrocitos en NPCs humanos diferenciados. NPCs diferenciada durante dos semanas se fijaron y doble immunostained para los objetivos indicados con anticuerpos policlonales y monoclonales, seguido por la exposición al conejo y de ratón secundaria de anticuerpos vinculados con Cy3 (rojo) y FITC (verde), respectivamente. Se detectaron los siguientes marcadores neuronales: NeuN A. y sinapsina.B. acetil colinesterasa (AChE) y sinaptofisina. C. BDNF y GAP43. Además, se detectaron los siguientes marcadores de astrocitos: D. STAT3 y GFAP.
Figura 4. Captura láser microdisección de las neuronas. A. NPCs se diferenciaron en un portaobjetos de membrana PEN recubierto con poli L lisina y laminina de ratón. El portaobjetos se coloca dentro de un 100 mm de placa de cultivo celular. B. Las disposiciones de la pluma de diapositivas de membrana y la tapa de la GCV en el instrumento Arcturus Veritas se muestran. C. Los cultivos se tiñeron con tinción de Histogen (Arcturus) para visualizar las células. D. La neuronas que ser capturados fueron marcados con herramientas de dibujo. Las neuronas capturadas se muestran en la tapa a baja (E) y alta (F) Magnificación. Haz clic aquí para ver más grande la figura .
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Discussion
Se describe en este estudio un modelo de cultivo celular de la neurona-rica por la diferenciación de las células neuroprogenitoras humanos auto-renovación y un método para aislar una población pura de las neuronas mediante láser captura microdissection. Hemos utilizado una combinación de NGF, BDNF, DBC y el ácido retinoico para la diferenciación neuronal de NPCs. DBC se utiliza para activar CREB, un factor de transcripción que mejora la neurogénesis 12. El ácido retinoico induce la salida del ciclo celular y reduce la población glial 13. El método descrito en este estudio incorpora modificaciones a lo largo de nuestro informe anterior 14. Anteriormente se había utilizado el paso de trituración de las neuroesferas a una suspensión de células individuales y, a continuación la siembra en placas recubiertas. Esto puede conducir a la diferenciación neuronal ineficiente en zonas de baja densidad (Figura 2E). Ahora hemos introducido el procedimiento de siembra de cuatro días de edad pequeñas neuroesferas (Figura 1B) para asegurar el enlace entre la diferenciaciónting neuronas (Figura 1C). Además, el suplemento de la diferenciación (Stem Cell Technologies) se sustituye con suplemento B27 (Invitrogen), 4-5 días después de la siembra. El método actual produce 80-90% neuronas consistentemente. Estas neuronas con una extensa red de procesos se pueden mantener en cultivo durante 2-3 meses, una clara ventaja sobre el modelo neuronal resultante de la diferenciación de las líneas celulares de neuroblastoma humano. La inmunotinción para varios marcadores neuronales incluyendo NeuN, sinapsina, la acetilcolinesterasa, sinaptofisina y GAP43 se observaron con NPCs diferenciadas (Figura 3). STAT3 y GFAP, también se detectaron marcadores de astrocitos en una pequeña población de células. Al aumentar la concentración de ácido retinoico a 2-5 M, la población de astrocitos se puede reducir más. Sin embargo, estos cultivos no se pueden mantener durante una larga duración porque las células gliales apoyar la supervivencia neuronal por la secreción de factores de crecimiento. Hemos observado que sees deseable para aumentar la concentración retinoico 3-5 días antes de realizar los experimentos.
La naturaleza heterogénea de las neuronas diferenciadas presenta retos en cuanto a la determinación de la expresión de genes de perfiles-tipo de células específicas. Por lo tanto, hemos optimizado las condiciones para mcm de neuronas cultivadas (Figura 4). En el presente estudio, hemos diferenciado los PNJ en las diapositivas con insertos de membrana PEN y LCM realizado ya que esta técnica presenta dificultades con neuronas cultivadas en platos regulares de cultivo de células, ya que están firmemente sujetos. Aunque los objetivos de LCM se pueden cumplir mediante análisis inmunohistoquímico, LCM ofrece varias ventajas, incluyendo la capacidad para amplificar la señal a nivel del ARN, realizar análisis multiplex, y la cuantificación precisa. Cuando se combina con microarrays, LCM permite el análisis de expresión de miles de genes en tipos de células seleccionadas 15.
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Disclosures
No hay conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el subsidio Revisión Mérito (NEUD-004-07F) de la Administración de Veteranos (SP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neuroprogenitor cells (NPCs) | Lonza | PT-2599 | |
| Neurocult NS-A human basal medium | Stem cell technology | 5750 | |
| Neurocult NS-A Proliferation supplement | Stem cell technology | 5753 | |
| Neurocult NS-A Differentiation supplement | Stem cell technology | 5754 | |
| B-27 Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| Human epidermal growth factor | Stem cell technology | 2633 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F0291 | |
| Brain Derived Neurotrophic Factor | Cell signaling | 3897S | |
| Nerve Growth Factor | Invitrogen | 13257-019 | |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma | D-0627 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P-5899 | |
| Mouse laminin | Sigma | L-2020 | |
| Retinoic acid | Sigma | R-2625 | |
| STAT3 antibody | Cell signaling | 9132 | |
| GFAP antibody | Cell signaling | 3670 | |
| GAP43 antibody | Transduction laboratories | 612262 | |
| BDNF antibody | Millipore | AB1534SP | |
| Acetyl cholinesterase antibody | Santz cruz | Sc-11409 | |
| Synaptophysin antibody | Abcam | ab18008-50 | |
| NeuN antibody | Chemicon | MAB377 | |
| Synapsin antibody | Novus | NB300-104 | |
| Anti mouse FITC | Jackson Immuno | 115-095-146 | |
| Research Laboratories | |||
| Anti Rabbit Cy3 | Jackson Immuno | 711-165-152 | |
| Research Laboratories | |||
| BSA | Sigma | A1653 | |
| Triton-X 100 | Acros | 21568-2500 | |
| Paraformaldehye | Fisher | 4042 | |
| Coverslip (Big circle cover slip) | Fisherbrand | 12-545-102 | |
| Mounting medium (Prolong Gold) | Invitrogen | P36930 | |
| Pen membrane | Applied biosystems | LCM0521 | |
| Histogene LCM frozen section staining kit | Applied biosystems | KIT0401 | |
| RiboAmp RNA Amplification kit | Applied biosystems | KIT0201 | |
| Picopure RNA Isolation kit | Applied biosystems | KIT0202 | |
| CapsureMacro LCM caps | Applied biosystems | LCM0211 |
References
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