Bioreattore microfluidico picolitro per l'analisi microbica di singole cellule: fabbricazione, configurazione del sistema e funzionamento

Sommario

In questo protocollo viene introdotta la fabbricazione, l'impostazione e il funzionamento di base di un bioreattore microfluidico picolitro (PLBR) per l'analisi di singole cellule di microrganismi procarioti. I microrganismi rilevanti a livello industriale sono stati analizzati come prova di principio che consente di comprendere il tasso di crescita, la morfologia e l'eterogeneità fenotipica in determinati periodi di tempo, difficilmente possibili con i metodi convenzionali.

Abstract

In questo protocollo vengono descritte in dettaglio la fabbricazione, la configurazione sperimentale e il funzionamento di base del bioreattore microfluidico picolitro (PLBR) di recente introduzione. Il PLBR può essere utilizzato per l'analisi di singoli batteri e microcolonie per studiare questioni biotecnologiche e microbiologiche riguardanti, ad esempio, la crescita cellulare, la morfologia, la risposta allo stress e la produzione di metaboliti o proteine a livello di singola cellula. Il dispositivo è dotato di un flusso continuo di fluidi che consente condizioni ambientali costanti per gli studi di perturbazione, ma consente anche cambi rapidi di fluido e condizioni di oscillazione per imitare qualsiasi situazione ambientale desiderata. Per fabbricare i dispositivi monouso, un wafer di silicio contenente strutture SU-8 di dimensioni inferiori al micrometro è servito come stampo di replicazione per la colata rapida di polidimetilsilossano. I chip sono stati tagliati, assemblati, collegati e configurati su un microscopio ad alta risoluzione e completamente automatizzato adatto per l'imaging time-lapse, un potente strumento per l'analisi delle cellule spazio-temporali. Qui, l'organismo della piattaforma biotecnologica Corynebacterium glutamicum è stato seminato nel PLBR e la crescita cellulare e la fluorescenza intracellulare sono state seguite per diverse ore svelando l'eterogeneità della popolazione dipendente dal tempo a livello di singola cellula, non possibile con i metodi di analisi convenzionali come la citometria a flusso. Oltre alle informazioni sulla fabbricazione dei dispositivi, vengono dimostrate anche la preparazione della precoltura, il caricamento, l'intrappolamento dei batteri e la coltivazione PLBR di singole cellule e colonie. Questi dispositivi aggiungeranno una nuova dimensione nella ricerca microbiologica per analizzare i fenomeni dipendenti dal tempo di singoli batteri sotto stretto controllo ambientale. Grazie al processo di fabbricazione semplice e relativamente breve, la tecnologia può essere facilmente adattata a qualsiasi laboratorio di microfluidica e semplicemente adattata a esigenze specifiche.

Introduzione

La microscopia time-lapse è un potente strumento per studiare le cellule viventi in vivo¹. Nel frattempo, le piattaforme di microscopia completamente automatizzate disponibili in commercio, tra cui la compensazione della deriva della messa a fuoco indotta termicamente, sono comunemente applicate nella ricerca biologica per studiare fenomeni dipendenti dal tempo, che vanno dalla ricerca sul cancro e sulle cellule neuronali all'ingegneria tissutale e agli studi dinamici con singole cellule di lievito o batteriche^2-6.

Tipicamente vengono applicate piastre a pozzetti trasparenti, agar-pad o semplicemente vetrini per microscopia per fornire ambienti di coltura cellulare durante l'imaging time-lapse⁷. Anche se adatti a determinate ricerche, questi semplici sistemi hanno un controllo molto limitato sulle condizioni ambientali e non consentono perturbazioni più complesse o cambiamenti di mezzo ben definiti e veloci. I dispositivi a chip microfluidici monouso prodotti mediante produzione di massa sono stati introdotti sul mercato di recente, ma sono per lo più adattati a tipi di cellule eucariotiche più grandi⁴. Sebbene la crescita possa essere seguita, le indagini sulla crescita ben definite riguardanti, ad esempio, l'intrappolamento preciso delle cellule, le dimensioni della colonia, la direzione di crescita e la capacità di rimozione delle cellule sono limitate. Gli habitat e i reattori microfluidici, in cui le cellule batteriche vengono coltivate in ambienti 3D sono stati sviluppati^8-10, presentano svantaggi quando si tratta di studi quantitativi a livello di singola cellula. Sebbene sia possibile analizzare l'eterogeneità complessiva della popolazione, molti parametri cellulari non possono essere determinati con precisione con la risoluzione di una singola cellula poiché la crescita non è limitata ai monostrati.

Questa limitazione ha innescato lo sviluppo di microsistemi che consentono la coltivazione di cellule in canali e habitat ben definiti con cellule che crescono in monostrati piatti con risoluzione di singole cellule e un controllo particolarmente stretto sulla fornitura di terreni e sulle condizioni ambientali^6,11,12. Pochi esempi di sistemi microfluidici per la coltivazione di cellule batteriche sono stati dimostrati^12-14. I batteri in genere mostrano tassi di crescita molto rapidi e richiedono strutture microfluidiche nell'intervallo di pochi micrometri e inferiori, soprattutto quando si desiderano monostrati cellulari per la microscopia. Keymer et al. ha dimostrato la crescita e la diffusione di ceppi di E. coli in paesaggi microfabbricati^15,16. Poiché erano interessati alla dinamica delle popolazioni, non hanno indagato con la risoluzione di una singola cellula.

Abbiamo sviluppato il bioreattore picoliter (PLBR)¹³, che è attualmente applicato per studiare vari indicatori di prestazione biotecnologica come la crescita¹⁷ e l'analisi della produttività accoppiata a fluorescenza a livello di singola cellula^18,19. L'attuale dispositivo microfluidico consente il controllo del reattore ambientale a un volume di coltura definito di circa un picolitro e l'osservazione continua di singole cellule contemporaneamente. Rispetto ai sistemi di scatole monostrato aperte^11,14, in cui uno o due lati sono aperti sul canale di alimentazione dei supporti, il PLBR consente l'intrappolamento e la coltura controllati. Il design consente la coltivazione a lungo termine di batteri senza il rischio che diverse colonie adiacenti formino una grande popolazione. Inoltre, il sistema incorpora regioni di coltivazione di 1 μm di altezza (nell'ordine del diametro cellulare) per limitare la crescita dei batteri ai monostrati cellulari. Al contrario, i canali di alimentazione sono 10 volte più profondi per ridurre al minimo la resistenza idraulica.

Rispetto ai sistemi di coltivazione batch miniaturizzati²⁰, il sistema attuale consente la coltivazione con parametri ambientali costanti grazie al flusso continuo di fluidi. Inoltre, i parametri ambientali come la composizione del fluido, la temperatura, le portate e lo scambio di gas possono essere facilmente controllati e modificati in pochi secondi. Ciò consente di studiare in modo specifico la risposta cellulare ai cambiamenti ambientali, riguardanti ad esempio la disponibilità di nutrienti o gli stimoli di stress. La richiesta di volumi di terreni ridotti, vale a dire nell'ordine di pochi microlitri, consente ai ricercatori di eseguire nuovi studi, ad esempio la perturbazione delle cellule durante l'imaging time-lapse con surnatante di esperimenti su larga scala che svelano la risposta cellulare in queste specifiche condizioni ambientali¹⁷. Il bioreattore picoliter fornisce ai ricercatori un sistema robusto che controlla strettamente le condizioni biofisiche e viene azionato utilizzando pompe a siringa ad alta precisione e microscopia automatizzata a campo chiaro e fluorescenza per l'imaging time-lapse. Qui riportiamo un protocollo completo che include la progettazione del dispositivo, la fabbricazione e le applicazioni esemplari.

Protocollo

1. Fabbricazione di wafer

1. Progettare il dispositivo microfluidico contenente gli ingressi, le uscite, i canali principali e i PLBR (Figura 1A) utilizzando il software CAD.
2. Il progetto presentato in questo protocollo (Figura 2) consiste in due ingressi di semina, un generatore di gradiente per la miscelazione di due diversi substrati, un'uscita e sei array di PLBR. Ogni array contiene 5 PLBR, per un totale di 30 PLBR paralleli all'interno di un dispositivo microfluidico.
3. Creare una fotomaschera litografica contenente i layout di chip desiderati (Figura 1B). La fotomaschera è stata prodotta internamente mediante scrittura a fascio di elettroni con risoluzione submicronica. La maschera utilizzata era composta da uno strato di cromo su una lastra di vetro 5 in².
   Nota: eseguire tutti i passaggi seguenti in condizioni di camera bianca di classe 100 o superiore (un diagramma di flusso del processo è mostrato nelle Figure 3A e 3B).
4. Pulire un wafer di silicio da 4 pollici con piranha (rapporto 10:1 di acido solforico e perossido di idrogeno) e acido fluoridrico per diversi minuti (Attenzione: sostanze chimiche pericolose). Risciacquare con acqua deionizzata (DI) per circa 10 secondi.
5. Disidratare il wafer per 20 minuti a 200 °C.
6. Centrifugare 1 μm di fotoresist SU-8 2000.5 sul wafer (1° strato) (4 ml di resist, centrifugare 10 sec con, v = 500 giri/min e a = 100 giri/min/sec, centrifugare 30 sec con v = 1.000 giri/min e a = 300 giri/min/sec).
7. Posizionare il wafer rivestito su una piastra riscaldante a 95 °C per eliminare il solvente in eccesso (1,5 min a 65 °C, 1,5 min a 95 °C e 1 min a 65 °C; utilizzare idealmente due piastre riscaldanti).
8. Inserire 1^° strato di fotomaschera (qui le regioni di intrappolamento dei reattori picolitro) e wafer all'interno dell'allineatore maschera ed esporre il wafer a 350-400 nm (contatto vuoto, 64 mJ/cm², t = 3 sec, I = 7 mW/cm²).
9. Eseguire la cottura post-esposizione su una piastra riscaldante a 95 °C per avviare la polimerizzazione di SU-8 (1 min a 65 °C, 1 min a 95 °C e 1 min a 65 °C). Nota: dopo questo passaggio si possono vedere le strutture nello strato SU-8.
10. Mettere il wafer in un bagno di sviluppo SU-8 per 1 minuto e trasferire il wafer in un secondo contenitore con lo sviluppatore SU-8 fresco per alcuni secondi.
11. Sciacquare il wafer in isopropanolo per rimuovere lo sviluppatore SU-8 e asciugare il wafer utilizzando il flusso di azoto della centrifuga per wafer.
12. Infornate la cialda per 10 minuti a 150 °C.
13. Centrifugare il fotoresist SU-8 2010 da 9 μm sul wafer (2° strato) (erogare 4ml di resist, centrifugare per 10 sec con v = 500 giri/min, a = 100 giri/min/sec e centrifugare per 30 s con v = 4.000 giri/min, a = 300 giri/min/sec).
14. Posizionare il wafer con SU-8 su una piastra riscaldante a 95 °C per eliminare il solvente in eccesso (15 min a 65 °C, 45-60 min a 95 °C e 10 min a 65 °C). Nota: è necessario prestare attenzione a rughe e bolle. Se il wafer viene riscaldato a una velocità di 95 °C, il solvente evaporato può essere incapsulato in minuscole bolle di gas.
15. Inserire la fotomaschera con il layout desiderato (qui i canali principali per l'apporto di nutrienti) e il wafer nell'allineatore della maschera ed esporre a 350-400 nm (contatto duro, 64 mJ/cm², t = 10 sec, I = 7 mW/cm²)
16. Eseguire la cottura post-esposizione su una piastra riscaldante a 95 °C per finalizzare la polimerizzazione di SU-8 (5 min a 65 °C, 3:30 min a 95 °C, 3 min a 65 °C). Nota: dopo questo passaggio si possono vedere le strutture nello strato SU-8.
17. Posizionare il wafer in un bagno di sviluppo SU-8 per 45 secondi, trasferire il wafer in un secondo contenitore con il rivelatore SU-8 fresco e sviluppare per 60 secondi.
18. Sciacquare il wafer per 20 secondi con isopropanolo per rimuovere eventuali residui di sviluppatore SU-8 e asciugare il wafer utilizzando azoto pressurizzato.
19. Infine infornate la cialda a 150 °C. Di conseguenza si ottiene il wafer finale (Figura 1C), che verrà utilizzato come stampo master per lo stampaggio PDMS.
20. Eseguire le misure del profilometro (Figura 3C) per convalidare le altezze della struttura dell'SU-8. Nota: le imprecisioni nell'altezza della struttura possono comportare un intrappolamento inefficiente delle cellule o la perdita di cellule durante la coltivazione.

2. Fabbricazione di chip di polidimetilsilossano

Nota: tutti i passaggi seguenti dovrebbero essere eseguiti idealmente in condizioni di flusso laminare per evitare che le particelle di polvere interferiscano con la procedura di fabbricazione (un diagramma di flusso del processo è mostrato nella Figura 4).

1. Preparare una miscela di polidimetilsilossano (PDMS) base e agente indurente in un rapporto 10:1. Mescolare accuratamente fino ad ottenere una soluzione omogenea che appare opaca. Preparare quanto necessario per l'altezza dello strato desiderata (qui 3 mm).
2. Degassare la miscela PDMS per circa 30 minuti sotto leggero vuoto fino a quando tutte le bolle sono scomparse.
3. Preparare il dispositivo di stampaggio (o la piastra di Petri) con l'apposito wafer SU-8 e versarvi la miscela PDMS (Figura 1D).
4. Cuocere il PDMS per 3 ore a 80 °C in forno.
5. Staccare con cautela la lastra PDMS dal wafer. Tagliare la lastra in trucioli singoli utilizzando un bisturi pulito e affilato.
6. Lavare le patatine in un bagno di n-pentano per 90 minuti, seguito da due bagni di lavaggio con acetone (90 minuti ciascuno). Asciugare le patatine durante la notte per rimuovere eventuali residui di solvente. Attenzione: eseguire il lavaggio PDMS sotto cappa aspirante. Nota: durante il lavaggio con n-pentano, i monomeri e i dimeri vengono rimossi dal PDMS polimerizzato e la dimensione del chip può temporaneamente raddoppiare durante la procedura di lavaggio.
7. Conservare i chip PDMS microfluidici in contenitori chiusi fino all'esperimento finale.
8. Poco prima dell'esperimento, perforare i fori di ingresso e di uscita nel chip PDMS utilizzando un ago (o perforatore) con un diametro leggermente inferiore rispetto ai connettori utilizzati per collegare i tubi con il chip PDMS.
9. Pulire accuratamente il chip PDMS microfluidico con isopropanolo e utilizzare dello scotch per rimuovere eventuali particelle di polvere che potrebbero attaccarsi al lato PDMS strutturato. Usa lo scotch più volte fino a quando non si vedono particelle sul chip.
10. Pulire successivamente un vetrino di vetro sottile 170 μm con acetone e isopropanolo. Infine pulire con acqua deionizzata e asciugare con azoto pressurizzato.
11. Prima dell'attivazione del plasma, riscaldare il pulitore al plasma e far funzionare il plasma per circa 300 secondi. Vetrino di vetro ossidato al plasma e chip PDMS (potenza 50 W, tempo = 25 sec, portata di ossigeno = 20 sccm).
12. Allineare il PDMS e il chip di vetro prima dell'incollaggio. Infine, posizionare con cautela il chip PDMS sul vetrino (Figura 1E). Il PDMS e il vetro si collegheranno in pochi secondi. Nota: non spingere con una pinzetta sulla parte superiore del chip PDMS durante il processo di incollaggio. Ciò può portare al cosiddetto collasso del tetto dei canali e delle piccole strutture.
13. Per rafforzare il legame, cuocere il chip di vetro PDMS finale per 10 secondi a 80 °C.

3. Preparazione della coltura batterica

Nota: Tutte le coltivazioni devono essere preparate in terreno filtrato sterile per evitare l'accumulo di particelle indesiderate, che potrebbero interferire durante la coltivazione.

1. Utilizzare una piastra di agar contenente gli organismi desiderati (qui, C. glutamicum ATCC 13032) e inoculare una colonia in 20 ml di terreno BHI fresco, incubare per una notte (≈ 8-14 ore) a 30 °C su un agitatore rotante (120 giri/min).
2. Trasferire 10 μl della precoltura nel terreno desiderato (qui CGXII²¹) che verrà utilizzato durante la coltivazione microfluidica e lasciare crescere la cellula per una notte a 30 °C su un agitatore rotante (120 giri/min).
3. Trasferire la quantità desiderata di sospensione cellulare (tra 10-500 μl, a seconda dell'inizio dell'esperimento) nel terreno desiderato (qui CGXII²¹) che verrà utilizzato durante la coltivazione di cellule microfluidiche. Nota: la cosa migliore è utilizzare le cellule della fase logaritmica iniziale per la semina. Per la coltura di C. glutamicum la migliore densità ottica (OD₆₀₀) per la semina era compresa tra 0,5 e 2.
4. Trasferire 1 ml di coltura batterica in una provetta sterile da 2 ml. Nota: questa operazione deve essere eseguita subito dopo l'assemblaggio del chip PDMS microfluidico per ridurre al minimo il tempo di trasferimento tra il pallone di agitazione e la coltivazione microfluidica. In genere il tempo di trasferimento è di circa 15 minuti e dovrebbe essere mantenuto il più basso possibile per evitare l'impatto sul metabolismo causato dalla limitazione dell'ossigeno e dai cambiamenti di temperatura.

4. Configurazione sperimentale

Nota: Tutti i passaggi vengono eseguiti con un microscopio invertito.

1. Avviare l'incubatrice del microscopio 2 ore prima dell'esperimento per riscaldare il sistema. Nota: la microscopia deve essere dotata di un incubatore a grandezza naturale per controllare la temperatura e, se lo si desidera, il flusso di gas. Non è necessario un ulteriore controllo dell'umidità poiché il sistema di chip è continuamente infuso con fluidi.
2. Aprire il sistema di incubazione, selezionare l'obiettivo desiderato e, se necessario, aggiungere olio da immersione sull'obiettivo.
3. Montare il chip all'interno del portachip. Se necessario, fissare la lastra di vetro con del nastro adesivo per evitare che si muovano scheggiature durante il funzionamento del palco.
4. Centrare il campione sul microscopio e mettere a fuoco gli array PLBR.
5. Collegare gli ingressi e le uscite con tubi appropriati (Figura 1F). Collegare il tubo a un serbatoio di scarico. Un chip rappresentativo può essere visto nella Figura 4D.
6. Inserire le siringhe nelle pompe e avviare il flusso del fluido. Utilizzare il terreno, il tampone o, se necessario, la soluzione di rivestimento e risciacquare i canali microfluidici per circa 1 ora. Nota: la soluzione di rivestimento viene utilizzata per rivestire le pareti dei canali per prevenire l'adesione di cellule non specifiche.
7. Per E. coli, la soluzione allo 0,1% di BSA viene utilizzata per rivestire le pareti del canale. Per C. glutamicum non è necessario alcun rivestimento. Dopo la procedura di rivestimento, lavare il truciolo con un terreno prima della semina cellulare.
8. Prima della semina e della coltivazione delle celle, verificare che non si verifichino perdite e che la temperatura sia costante.

5. Semina di cellule batteriche nel dispositivo microfluidico

1. Assicurarsi che le soluzioni batteriche desiderate siano disponibili in siringhe appropriate collegate al tubo.
2. Scollegare il tampone o la soluzione di rivestimento e collegare la sospensione cellulare al chip. Per ridurre al minimo il volume di morte, le bolle d'aria indesiderate e per ridurre il tempo di sperimentazione, sostituire l'ago completo e il tubo, piuttosto che solo le siringhe.
3. Infuse la sospensione cellulare nei canali a una portata volumetrica di 200 nl/min fino a riempire la maggior parte dei PLBR con la quantità di celle desiderata (Figura 5A). Nota: i risultati ottimali della semina dipendono dal ceppo batterico, OD₆₀₀ e dal terreno di crescita della precoltura. Questi parametri devono essere adattati per aumentare l'efficienza di intrappolamento e il tempo necessario fino a quando un numero sufficiente di celle non viene intrappolato nelle strutture del reattore. Per C. glutamicum, tipicamente è stata utilizzata una sospensione cellulare di OD₆₀₀ 0,5-2; per E. coli l'OD₆₀₀ era compreso tra 0,5 e 1.
4. Se viene riempito solo un piccolo numero di PLBR, aumentare la portata a 800-1.200 nl/min.
5. Scollegare la sospensione cellulare e collegare il terreno di coltura al chip (Figura 5B). Assicurarsi che non si introducano bolle d'aria durante il cambio del fluido. Perfondere con terreno di crescita fresco a 100 nl/min.

6. Imaging time-lapse

1. Seleziona PLBR specifici per l'imaging time-lapse. In genere vengono scelti PLBR che contengono una singola cellula madre all'inizio di un esperimento. Il numero di regioni di interesse che possono essere esaminate in un esperimento dipende dalla frequenza dei fotogrammi desiderata e dalla configurazione microscopica.
2. Selezionare un frame rate appropriato in base al numero di PLBR. Assicurarsi che il microscopio sia in grado di gestire la quantità desiderata di ROI nell'intervallo di time-lapse.
3. Scegli i set di filtri appropriati (qui YFP). Chiudi automaticamente l'otturatore durante il movimento della fase e dopo ogni misurazione time-lapse per evitare lo sbiancamento dei cromofori.
4. Configura la sequenza di microscopia time-lapse e avvia l'esperimento.
5. Dopo che tutti i PLBR sono cresciuti eccessivamente, l'esperimento può essere interrotto, il chip PDMS microfluidico può essere scartato e l'esperimento può essere valutato.

7. Analisi

Nota: I seguenti passaggi o parti della procedura possono essere eseguiti manualmente o da programmi di analisi delle immagini come ImageJ, ecc.

1. Determinare i PLBR di interesse se la coltivazione soddisfa tutti i criteri desiderati, ad esempio il numero di cellule madri, la posizione delle cellule madri, ecc.
2. Per determinare il tasso di crescita di una microcolonia, contare il numero di cellule in ogni intervallo di tempo.
3. Calcola il tasso di crescita massimo tracciando il tempo rispetto a ln (numero di celle). La pendenza del grafico rappresenta il tasso di crescita in [1/ora] (vedi Figura 6).
4. L'analisi dei dati di fluorescenza dipende fortemente dall'esperimento eseguito. In questo rapporto, è stato scelto un esempio per illustrare l'eterogeneità da colonia a colonia e da cellula a cellula tra diverse microcolonie isogeniche (vedi Figura 7).

Risultati

Fabbricazione del dispositivo

Il sistema microfluidico PLBR viene realizzato mediante uno strato di PDMS legato a una chip di vetro sottile, adatto per microscopia ad alta risoluzione. La fabbricazione comprende due passaggi principali: in primo luogo la realizzazione del master di riproduzione (Figure 1A, 1B e 1C) e in secondo luogo la fabbricazione della chip (Figure 1D, 1E e 1F). Secondo il protocollo, vengono utilizzate tecniche standard di microfabbricazione fotolitografica per creare lo stampo master. Laboratori privi di una facility con camera bianca possono procurarsi stampi master SU-8 personalizzati disponibili in commercio. Mediante ripetute stampature in PDMS (Figure 1A, 1B e 1C) è possibile produrre centinaia di chip monouso. La stampatura in PDMS e l'assemblaggio della chip possono essere effettuati in qualsiasi laboratorio e non richiedono camere bianche, anche se ambienti di lavoro con flusso laminare sono preferibili.

Il processo inizia con la progettazione del sistema del chip microfluidico. Tipicamente si utilizza un software CAD per progettare il chip microfluidico (Figura 1A). Dopo la progettazione CAD, una maschera viene generata mediante uno scrittore a fascio elettronico (Figura 1B) con risoluzione submicrometrica. Nello studio attuale è stata creata una maschera al cromo da 5 in, utilizzata per la litografia del wafer SU-8. Il wafer di silicio-SU-8 finale viene utilizzato per la stampatura del PDMS (Figura 1D). Dopo un passaggio di cottura, la lastra di PDMS viene tagliata in chip che vengono legati in modo irreversibile alle lamelle di vetro (Figura 1E). Infine, vengono collegati i tubicini (Figura 1F).

Figura 2 mostra in dettaglio la progettazione del sistema microfluidico. Esso è composto da due ingressi per il caricamento delle cellule, un generatore di gradiente per la miscelazione di diversi substrati o mezzi e un’unica uscita. I canali principali hanno dimensioni di 50 µm x 10 µm (L x A). Ogni dispositivo comprende sei serie di PLBR, ciascuna contenente 5 PLBR. Ciò porta alla presenza di 30 reattori in parallelo all’interno di un singolo dispositivo microfluidico.

Figura 3 illustra la produzione del master per la replicazione. Come descritto in dettaglio nel protocollo, uno strato iniziale in SU-8 viene realizzato mediante litografia SU-8 (Figura 3A). Una procedura analoga viene applicata per il secondo strato (Figura 3B). Per verificare la geometria dei canali, abbiamo analizzato l'altezza dei PLBR e dei canali principali utilizzando un profilometro. Nell'esempio mostrato in Figura 3C, è stato misurato il primo strato (lo strato di coltura). In questo caso, lo strato presenta un'altezza costante di 1.200 nm, adatta alla coltura di C. glutamicum in mezzo BHI.

Figura 4 illustra la procedura di stampaggio del PDMS, che inizia con la miscelazione del PDMS (Figura 4A), seguita dal processo di stampaggio (Figura 4B) e infine dal passaggio di incollaggio (Figura 4C). Figura 4D mostra il chip microfluidico finale, composto da una piastra di vetro spessa 170 µm, dal chip in PDMS (alto 3 mm) con ingressi e uscite, e da aghi in acciaio collegati a tubi. Al termine dell'esperimento, il chip può essere smaltito senza necessità di un'accurata pulizia. Inoltre, è facile da assemblare e da maneggiare. Non è necessaria alcuna procedura complessa o difficoltosa di riempimento.

Principio del dispositivo

Figura 5 mostra il principio di funzionamento del sistema reattore. Le cellule vengono infuse nel dispositivo microfluidico e singole cellule rimangono intrappolate all'interno del PLBR semplicemente grazie alle interazioni tra cellula e parete. A causa della differenza di resistenza idrodinamica tra canale e PLBR, all'interno del PLBR si verifica un flusso minimo. Dopo il seminamento del PLBR (Figura 5A), la fase di crescita e osservazione viene avviata sostituendo la soluzione batterica con il mezzo di crescita (Figura 5B). Una volta che i PLBR sono completamente colonizzati (Figura 5C), l'esperimento viene generalmente interrotto e le immagini a intervalli di tempo possono essere analizzate. Per ulteriori dettagli sui meccanismi di intrappolamento e sul profilo di flusso all'interno del PLBR, si rimanda il lettore a Grünberger et al.¹³ .

Analisi del tasso di crescita

Il sistema attuale può essere applicato per studiare diverse specie batteriche in relazione a diversi parametri biologici, come la crescita, la morfologia o un segnale fluorescente. In un primo esempio, C. glutamicum, un organismo produttivo di rilevanza industriale, è stato coltivato in condizioni standard di coltivazione (T=30 °C, mezzo CGXII²¹). Figura 6A mostra le curve di crescita ottenute da tre microcoloni isogeniche. La crescita esponenziale prosegue fino al riempimento dei PLBR, indicando l'assenza di limitazioni nutrizionali. Figura 6B mostra quattro immagini di microscopia in contrapposizione di fase a tempo differito di una colonia in crescita di C. glutamicum.

Analisi della fluorescenza

Per la microscopia a fluorescenza a singola cellula, i ricercatori spesso utilizzano proteine fluorescenti specifiche, ad esempio GFP o derivati, per associare un fenotipo specifico di interesse a un output misurabile (un segnale fluorescente). Per dimostrare l'applicabilità del PBLR in studi di microscopia a fluorescenza con acquisizioni temporali, abbiamo analizzato l'emissione fluorescente di un ceppo di C. glutamicum che esprime una proteina fusa YFP-TetR codificata da un plasmide sotto il controllo del promotore Ptac (pEKEx2-yfp-tetR)^18,22. In presenza di basse concentrazioni di induttore (IPTG), si sa che l'espressione da Ptac provoca una notevole variabilità da cellula a cellula in popolazioni batteriche isogeniche. Partendo da una singola precultura, sono state seguite la crescita e la fluorescenza a livello di singola cellula in diverse microcolonie isogeniche. Come mostrato nella Figura 7, abbiamo osservato eterogeneità fenotipica tra microcolonie diverse e eterogeneità a livello di singola cellula all'interno di colonie derivate da una singola cellula madre. Una colonia (Figura 7B, PLBR 1) ha mostrato quasi nessuna emissione fluorescente, mentre le cellule del PLBR 2 hanno mostrato una bassa emissione fluorescente dovuta all'espressione basale di yfp-tetR dal promotore Ptac. Nel PLBR 3, l'emissione fluorescente è risultata notevolmente più intensa rispetto alle altre colonie ed è stata osservata una vasta distribuzione della popolazione. Questo esempio dimostra l'applicabilità del PBLR per studi di microscopia a fluorescenza con acquisizioni temporali. Rispetto alla citometria a flusso, in cui la fluorescenza di singole cellule può essere determinata in un singolo punto temporale, il sistema attuale permette di tracciare le cellule e di studiare in tempo reale la fluorescenza a livello di singola cellula per molte generazioni.

Figura 1. Panoramica del processo di produzione del chip PLBR. Fabbricazione dello stampo maestro: a partire da (A) Progettazione, (B) Fabbricazione della maschera litografica e (C) Produzione del wafer. Produzione del chip in PDMS-vetro: a partire da (D) Stampa del PDMS, seguita da (E) Incollaggio tra vetro e PDMS e (F) Assemblaggio finale del chip.

Figura 2. Progettazione del chip PLBR. (A) Disegno CAD dell'intero chip microfluidico; (B) Ingrandimento di posizioni selezionate del layout: il layout comprende due ingressi per il mezzo (a1), un generatore di gradiente con canali di miscelazione (a2) e 6 array PLBR paralleli (b1). b2 mostra un singolo PLBR, integrato in un canale fluido largo 100 µm. Il PLBR ha un diametro interno di 40 µm e canali nutrizionali larghi 2 µm. L'ingresso per il seeding ha una lunghezza di 40 µm. Il colore rosa rappresenta il primo strato (zona di trattenimento e coltivazione) e il colore blu rappresenta il secondo strato (trasporto del fluido).

Figura 3. Illustrazione del processo di fabbricazione di un wafer a due strati. (A) Fabbricazione del primo strato contenente le strutture di intrappolamento; (B) Fabbricazione del secondo strato contenente i canali fluidici, gli ingressi e le uscite; (C) Profili superficiali rappresentativi del primo strato. In questo caso, l'altezza del primo strato era di 1.200 nm ed è utilizzata per la coltivazione di C. glutamicum in mezzo complesso.

Figura 4. Realizzazione del dispositivo e chip rappresentativo. Illustrazione del processo di stampaggio del PDMS: (A) miscelazione e degasaggio del PDMS; (B) stampaggio del PDMS; (C) sformatura, taglio e saldatura del chip. Chip finale (riprodotto con permesso della Royal Society of Chemistry¹³): (D) fotografia del chip in PDMS con 2 ingressi e 1 uscita; (E) immagine CAD di sei array paralleli contenenti ciascuno 5 PLBR; (F) immagine al microscopio elettronico a scansione (SEM) di un singolo PLBR.

Figura 5. Principio di funzionamento del sistema PLBR. (A) Fase di semina; (B) Fase di crescita delle microcolonie batteriche; (C) Fase di troppopieno. Riprodotto con permesso della Royal Society of Chemistry13. http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H.

Figura 6. Determinazione del tasso di crescita di microcoloni di C. glutamicum WT. (A) Grafico di crescita di tre colture PLBR e curve esponenziali risultanti (parti riprodotte con autorizzazione della Royal Society of Chemistry)13. http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H. (B) Immagini a intervalli di tempo di una colonia in crescita di C. glutamicum.

Figura 7. Analisi basata sul PBLR dell'eterogeneità della popolazione. Viene mostrato C. glutamicum che esprime una fusione yfp-tetR sotto il controllo del promotore Ptac (pEKEx2-yfp-tetR) in assenza dell'induttore IPTG. (A) Flusso di lavoro sperimentale; (B) Tre microcolonie isogeniche che mostrano eterogeneità tra colonie e tra cellule; (C) Distribuzione della fluorescenza a livello di singola cellula all'interno delle rispettive microcolonie.

Figura 8. Immagini al microscopio elettronico a scansione di diversi PLBR. Immagini SEM che mostrano gli ingressi per la semina per l'ottimizzazione dell'efficienza di intrappolamento. (A) Ingressi per la semina più piccoli (B) Ingressi per la semina più grandi (C) Ingressi per la semina più ampi e “aperti” (D) Due ingressi per la semina.

Passo	Problema	Causa possibile	Soluzione
Fabbricazione del wafer	Bolle d'aria intrappolate nell'SU-8 durante la cottura soft	Aumento della temperatura troppo rapido	Cuocere a 95 °C e 65 °C più volte
Fabbricazione del wafer	Strutture SU-8 scomparse o interrotte	Procedura di fabbricazione non ottimale; stress meccanico nelle strutture SU-8	Ottimizzare parametri come tempo di cottura e tempo di esposizione
Fabbricazione del wafer	Strati SU-8 troppo bassi, troppo alti o con spessore non uniforme	Problema durante la deposizione a centrifuga	Verificare i parametri della centrifuga e del portacampioni
Assemblaggio e incollaggio del chip	Collasso dei PLBR	Parametri di incollaggio del PDMS non ottimali	Regolare potenza, tempo di esposizione al plasma e tempo di cottura dopo l'incollaggio
Assemblaggio e incollaggio del chip	Strutture sporche e particelle nei PLBR	Il chip non è stato pulito correttamente	Utilizzare nastro adesivo per la pulizia della superficie
Assemblaggio e incollaggio del chip	Adesione insufficiente tra PDMS e vetro	Parametri di incollaggio non ottimali o pulizia insufficiente	Verificare le impostazioni del plasma ad ossigeno
Esperimento microfluidico	Perdita di fluido	Il foro di ingresso/uscita non è stato perforato correttamente	Ottimizzare il processo di perforazione
Esperimento microfluidico	Molte piccole particelle di PDMS durante il riempimento	Il foro non è stato perforato correttamente	Ottimizzare il processo di perforazione
Esperimento microfluidico, aspetto biologico	Assenza di crescita cellulare	Residui di solvente dal procedimento di pulizia	Sciacquare il chip più a fondo prima del caricamento cellulare o lasciare evaporare il solvente prima dell'incollaggio
Esperimento microfluidico, aspetto biologico	Variazione dei tassi di crescita	Diverse cause possibili	Verificare la precultura e la temperatura
Esperimento microfluidico, aspetto biologico	Modifiche della morfologia cellulare durante la coltivazione	Limitazioni nutrizionali o variazione di temperatura	Verificare l'incubatore e il flusso
Esperimento microfluidico, aspetto tecnico	Deriva di posizione durante la microscopia a intervalli	Fluttuazioni di temperatura	Verificare il profilo di temperatura prima degli esperimenti fino a eliminare le oscillazioni
Esperimento microfluidico, aspetto tecnico	Perdita di cellule durante la coltivazione	Altezza del reattore leggermente troppo elevata	Ottimizzare l'altezza del reattore
Esperimento microfluidico, aspetto tecnico	Assenza di intrappolamento	Altezza del reattore troppo bassa	Ottimizzare l'altezza del reattore

Tabella 1. Risoluzione dei problemi. Questa tabella riassume aspetti critici, errori comuni e possibili soluzioni durante il lavoro sperimentale.

Discussione

Abbiamo descritto la fabbricazione, la configurazione sperimentale e le relative procedure operative di un dispositivo PDMS microfluidico contenente diversi (PLBR) per l'analisi di batteri su singola cellula.

La microfabbricazione con tecniche di litografia morbida consente di regolare rapidamente le dimensioni del dispositivo per varie dimensioni e morfologie di batteri. Attualmente stiamo ottimizzando il bioreattore picoliter per quanto riguarda la coltivazione di diversi organismi microbici e la produttività della coltivazione. Al fine di aumentare l'efficienza di intrappolamento, anche la geometria del reattore è in fase di ottimizzazione. La Figura 8 mostra quattro nuovi dispositivi PLBR attualmente convalidati. In tutte le figure il canale di semina è stato ridisegnato per quanto riguarda la larghezza e la forma. In pratica, questo sembra avere un effetto sul numero di cellule che sono intrappolate, ma necessita di ulteriori indagini. Miglioramenti significativi per quanto riguarda l'efficienza di intrappolamento sono stati ottenuti anche grazie all'incorporazione di ulteriori canali di trabocco che hanno portato a un flusso convettivo più elevato attraverso il reattore e a un maggior numero di celle intrappolate. Tuttavia, allo stesso tempo, aumenta il rischio di dilavamento delle cellule durante la coltivazione.

Il dispositivo è un'interessante alternativa alle coltivazioni su macroscala che sono state utilizzate per decenni per studiare i processi di crescita e produzione a livello di singola cellula. Tuttavia, ha alcuni requisiti importanti: per il monitoraggio parallelo di diversi bioreattori picolitri è necessaria una configurazione microscopica ad alta risoluzione e completamente motorizzata con compensazione della deriva del fuoco. Inoltre, è necessario un sistema di incubazione per mantenere costante la temperatura di coltivazione desiderata durante le misurazioni.

Raggiungiamo un tasso di successo del 95% nella fabbricazione di dispositivi. I problemi principali sono legati all'inefficienza dell'incollaggio PDMS-vetro, al collasso del tetto PDMS o alla perdita di fluido (vedere la Tabella 1 per la risoluzione dei problemi più gravi). Sebbene il lavoro sperimentale sia svolto parzialmente in condizioni non sterili, raramente vediamo contaminazione durante gli esperimenti, a causa del sistema fluidico chiuso. I dispositivi microfluidici PDMS sono otticamente trasparenti, quindi possono essere utilizzati per l'imaging in vivo ad alta risoluzione. Sebbene il PDMS sembri essere perfetto per l'applicazione, ha un'elevata affinità per le molecole idrofobiche, rendendo limitato l'uso di solventi ampiamente utilizzati nei processi biocatalitici a cellule intere. Tuttavia, sono disponibili rivestimenti adatti per adattare il protocollo a questo tipo di applicazioni.

Il PLBR proposto è adatto per l'analisi spazio-temporale di eventi cellulari e persino subcellulari di vari tipi di batteri. Uno dei principali vantaggi dell'approccio attuale risiede nella capacità di quantificare direttamente la crescita delle microcolonie in contrasto con i metodi convenzionali. Inoltre, il PLBR consente la coltura in condizioni definite e costanti. Poiché il sistema facilita l'uso di piccole quantità di reagenti o materiali, offre il vantaggio di essere economico, personalizzabile e adatto a un'elevata produttività. Nei metodi tradizionali si considerano i valori medi dell'intera popolazione quando si analizza la coltivazione microbica. Inoltre, i metodi esistenti richiedono il campionamento manuale che può portare alla degradazione dei campioni e quindi a errori nella misurazione. Il PLBR offre nuove prospettive per lo sviluppo di bioprocessi e l'analisi dell'eterogeneità della popolazione in microbiologia. Il PLBR è uno strumento promettente per varie applicazioni nell'ambito dello sviluppo di bioprocessi e potrebbe essere applicato in vari campi di ricerca, ad esempio l'analisi dell'eterogeneità cellula-cellula, l'analisi di specifici cluster cellulari all'interno di linee cellulari, lo screening di ceppi di produzione microbica e l'indagine in tempo reale dei fenotipi cellulari.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Wafer di silicio diametro 100 mm, P/BOR < 100>	Si-MAT, materiali siliconici, Germania
Photoresist SU-8 2000.5	Micro Resist Technology GmbH, Germania
Photoresist SU-8 2010	Micro Resist Technology GmbH, Germania
SU-8 Sviluppatore mr DEV-600	Micro Resist Technology GmbH, Germania
Kit elastomero siliconico Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184	Dow Corning; Farnell GmbH, Germania
Aghi per l'erogazione Punte di precisione  27 G; ID = 0,2 mm, OD = 0,42 mm	Nordson EFD Deutschland, Germania
Lastre di vetro D263 T eco, 30 mm x 25 mm x 0,17 mm	Schott AG, Germania
Perforatrice AKA 5130-B-90	Harris Uni-Core
Tubing Tygon S-54-HL, ID = 0,25 mm, OD = 0,76 mm	Saint Gobain; VWR International GmbH, Germania
Siringhe monouso – Omnifix Spritzen BRAUN Omnifix 40 Duo, 1 ml	B. Braun Melsungen AG, Germania	552-183143
Siringhe, siringhe in vetro sterili da 1 ml	INNOVATIVE LABOR SYSTEME GMBH (ILS), Germania
Chemicals
(NH4)2SO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, Germania
Urea	Carl Roth GmbH + Co. KG, Germania
KH2PO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, Germania
K2HPO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, Germania
MgSO4• 7H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Germania
MOPS	Carl Roth GmbH + Co. KG, Germania
FeSO4• 7H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Germania
MnSO4• H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Germania
ZnSO4• 7H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Germania
CuSO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, Germania
NiCl2• 6H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Germania
CaCl2	Carl Roth GmbH + Co. KG, Germania
Biotina	Carl Roth GmbH + Co. KG, Germania
Acido procatechiico	Carl Roth GmbH + Co. KG, Germania
Glucosio-Monoidrato	Carl Roth GmbH + Co. KG, Germania
BHI	Becton, Dickinson
Cells
Corynebacterium glutamicum ATTC 13032	DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Germania
Escherichia coli MG 1655	DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Germania
Equipment
Wafer Cleaner SSEC 3300	Solid State Equipment LLC
Spin Coater SPIN150 -NPP	SPS Europe B.V.
Allineatore di maschere MA-6	Karl Suess
Hot Plate HP30A - 2	Torrey Pines Scientific
Laboratory forno Memmert UN 200	Memmert
Plasma Cleaner FEMTO	Diener Electronics, Germania
neMESYS pompe a siringa	Cetoni GmbH, Germania
Agitatore magnetico CB 162	Stuart	VWR 442-0304
Microscopio Nikon Eclipse Ti	Nikon Microscopia
Microscopio incubuator	Pecon GmbH, Germania
Centrifuga minispin plus " linea nera"	Eppendorf	9776501
Fotometro Biofotometro plus	Eppendorf	6132000008
Agitatore per pallone/incubatore 3031	GFL - Gesellschaft fü r Labortechnik mbH, Germania
Profilometro, Dektak 150 Stilo Profiler	Veeco