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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Quantitative Published: August 23, 2013 doi: 10.3791/50677
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California, San Francisco, 2Graduate Program in Biomedical Sciences, University of California, San Francisco

Summary

Neutrophile Einhaltung der aktivierten Endothel an den Standorten der Infektion ist ein integraler Bestandteil des Gastgebers Entzündungsreaktion. Beschrieben in diesem Bericht ist ein neutrophilen Bindungs-Assay, die für das erlaubt

Abstract

Die vaskuläre Endothel spielt eine wesentliche Rolle bei der entzündlichen Reaktion. In der akuten Phase der Entzündung werden Endothelzellen (ECs) von Host-Vermittler oder direkt durch konservierte mikrobielle Komponenten oder Host-derived Gefahr Moleküle aktiviert. Activated ECs express Zytokine, Chemokine und Adhäsionsmoleküle, mobilisieren, aktivieren und behalten Leukozyten an den Ort der Infektion oder Verletzung. Neutrophile sind die ersten Leukozyten, um anzukommen, und sich an das Endothel durch eine Vielzahl von Adhäsionsmolekülen auf den Oberflächen der beiden Zellen. Die wichtigsten Funktionen von Neutrophilen sind direkt beseitigen mikrobiellen Bedrohungen, die Förderung der Rekrutierung von anderen Leukozyten durch die Freisetzung von zusätzlichen Faktoren, und initiieren Wundheilung. Daher ist die Einstellung und Befestigung des Endothels ein kritischer Schritt in der Einleitung der entzündlichen Reaktion. In diesem Bericht beschreiben wir eine in-vitro-Assay mit neutrophilen AdhäsionCalcein primären humanen Neutrophilen AM-markierten, um das Ausmaß der mikrovaskulären endothelialen Zell-Aktivierung unter statischen Bedingungen zu quantifizieren. Dieses Verfahren hat den zusätzlichen Vorteil, dass die gleichen Proben mittels Fluoreszenz-Spektrophotometrie quantifiziert auch direkt visualisiert werden mittels Fluoreszenzmikroskopie für eine qualitative Bewertung der Neutrophilen-Bindung.

Introduction

Da das vaskuläre Endothel ist in direktem Kontakt mit dem zirkulierenden Blut wird in ausgezeichneter Lage, eine schnelle Entzündungsreaktion während der Infektion oder Verletzung zu initiieren. Endothelzellen (ECs) express pattern recognition receptors, die eine Vielzahl von konservierten bakteriellen Komponenten und Gefahr Moleküle erkennen und Rezeptoren für Host Entzündungsmediatoren wie TNFa. Die Aktivierung dieser Rezeptoren führt ECs, Zytokine (z. B. IL-6, IL-8, CXCL1 und CCL2) sezernieren, und Adhäsionsmoleküle (zB E / P-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1) in ihrer Zelloberfläche 1 hochreguliert , 2. Diese Moleküle alle erleichtern die Lokalisierung von Leukozyten an Stellen der Infektion und Verletzungen, um das Heer der Infektionserreger zu löschen und die Reparatur von Gewebe 3,4 initiieren. Neutrophilen Die Reaktion auf eine Infektion beinhaltet eine gut koordinierte Zusammenspiel zwischen dem vaskulären Endothel und dem antwortenden Neutrophilen. Nach Aktivierung EG, IL-8 abgesondert und bildet einen intravaskulären Gradienten auf das Endothel, die Neutrophilen erlaubt, nach Hause, um den Ort der Infektion oder Verletzung 5,6. E / P-Selektine vermitteln Neutrophilen-Abscheidung und-rollen durch relativ schwache Assoziationen mit glycomolecules auf der neutrophilen Zelloberfläche. Diese Wechselwirkungen, zusammen mit IL-8-Bindung an seinen verwandten Rezeptoren, erleichtern die robust, Integrin-vermittelte Bindung und eventuellen Verhaftung von Neutrophilen am Endothel Zelloberfläche 7-10. Nach Verhaftung kann Neutrophile wandern aus dem Gefäßsystem zu den Austragungsorten der Infektion direkt eliminieren Krankheitserreger erzeugen Neutrophilen extrazellulären Fallen, um die Verbreitung von Krankheitserregern zu verhindern, die Wundheilung fördern und lassen weitere Faktoren, die andere Leukozyten wie Monozyten, Makrophagen und dendritischen rekrutieren Zellen 11-17.

Beschrieben in diesem Bericht ist ein in vitro-Methode, um die Einhaltung der neutrophilen MicroV quantifizierenascular ECs nach Aktivierung durch den Host Entzündungsmediatoren TNF. Dieser Test wurde entwickelt, um die Aktivierung von Endothelzellen und nicht für Neutrophile zu bewerten. Primäre humane Neutrophile sind zunächst getrennt mit Dichtegradiententrennung, und werden dann mit Calcein acetoxymethyl (AM) markiert. Esterasen innerhalb der lebenden Zellen hydrolysieren Calcein AM zu stark fluoreszierenden Calcein Molekül mit einer Anregung von 492-495 nm und die Emission von 513-516 nm 18. Die Fluoreszenz-markierten Neutrophilen werden dann mit EC Monoschichten inkubiert und nicht-adhärente Neutrophile werden anschließend entfernt. Die Fluoreszenz der verbleibenden gebundenen Neutrophilen wird dann unter Verwendung eines Fluoreszenz-Spektralphotometer, berechnet und als Prozentsatz der gesamten Neutrophilen Fluoreszenz Eingang pro Vertiefung. Dieses Verfahren hat den zusätzlichen Vorteil, dass die gebundenen Calcein-markierten Neutrophilen in Spektrofotometrie direkt verwendet werden kann, visualisiert mittels Fluoreszenzmikroskopie, um eine qualitative aus EG ac lesen gebenMotivation. Da dieser Test unter statischen Bedingungen durchgeführt wird, werden nur die ersten Ereignisse, die sehr in der neutrophilen Adhäsionskaskade auftreten beurteilt werden. Dies wird in diesem Bericht mit E-Selektin blockierende Antikörper gegen diese Neutrophilen Einhaltung TNF-behandelten menschlichen Lunge mikrovaskulären EC (HMVEC-Lung) Monoschichten wird drastisch reduziert, wenn die Interaktion mit E-Selektin gestört zeigen bestätigt.

Neben TNF, haben wir erfolgreich diesen Test verwendet werden, um das Ausmaß der menschlichen Nabelschnur-EC (HUVEC) Aktivierung durch den Toll-like-Rezeptor-1/2-Agonisten peptidoglycan Lipoprotein-assoziierte (PAL), Murein-Lipoprotein (MLP) und Pam3Cys und bestimmen HMVEC-Lung Aktivierung durch Pam3Cys 19,20. Darüber hinaus haben wir erfolgreich verwendet diesen Test mit Kinase-Inhibitoren und nach RNAi-vermittelter Knockdown von Oberfläche und zytoplasmatische Proteine ​​in HMVEC-Lung, was darauf hindeutet, dass diese Methode kompatibel mit einer Vielzahl von biochemischen und ist screening Assays 20. Zusammenfassend stellt dieser Test ein leicht, reproduzierbar, funktioneller Weise zu verwenden, um das Ausmaß der EG-Aktivierung durch Entzündungsmediatoren in vitro zu übersetzen.

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Protocol

1. Plating und Wartung von mikrovaskulären Endothelzellen

  1. Auftauen und das Wachstum Ihres mikrovaskulären Endothelzellen nach den Herstellern mitgelieferten Anleitung. In diesem Protokoll wurden die Zellen in EGM-2 MV Medien (Lonza) gewachsen, und es wird empfohlen, dass alle Versuche innerhalb von zwei Wochen nach dem Auftauen eine Variation aufgrund Durchgang Nummer minimieren durchgeführt werden. Unsere Experimente mit HMVEC-Lung zwischen Passagen 4 bis 9 durchgeführt.
  2. Tag 1: Wenn die Zellen 80-90% Konfluenz erreichen, trypsinize und resuspendieren bei 120.000 Zellen pro ml. Teller 36.000 Zellen (0,3 ml) pro Well in 48-Well-, Polystyrol Gewebekulturplatte (n). Fügen Vertiefungen HMVEC die nicht mit Neutrophilen inkubiert werden, um eine Ablesung zu erhalten Hintergrundfluoreszenz. Es sei denn, bei der 48-Well-Platten speziell für Fluoreszenz-Assays, alternierenden Reihen oder Spalten entworfen wird minimieren Licht Kontamination von benachbarten Brunnen. HINWEIS: Wells kann vorher mit Poly-Lysine, Kollagen oder Fibronektin.
  3. Tag 2: In frischem Medium.
  4. 3. Tag: Nach Phasenkontrast-Mikroskopie, bestätigen die Zellen gesund sind (dh "Kopfsteinpflaster" Aussehen und wenig Zelltrümmer), und sie sind zu 100% konfluent (Abbildung 1). Wenn die Zellen nicht zu 100% konfluent, verändern die Medien jeden Tag, bis sie bereit sind.
  5. Sobald die HMVEC Monoschichten bereit für die Behandlung sind, waschen Sie die Zellen einmal mit ausgewogener Hank-Salzlösung (HBSS) und fügen Sie 0,3 ml frisches EGM-2 MV Medien oder Medien, die entzündliche Agonisten in die entsprechenden Vertiefungen. In diesem Protokoll die HMVEC-Lung wurden mit TNF behandelt [100 ng / ml] (PeproTech, New Jersey) für 3 Stunden, da dies eine gut beschriebene Aktivator des ECs 21. HINWEIS: Es wird empfohlen, dass Sie Zeit Ihres Experiments, so dass Ihre aktivierten HMVEC Zellen (Schritt 4.1) und Calcein markierten Neutrophilen (Schritt 3.5) Uhr bereit sind, in der gleichen Zeit zu verwenden. Es führt uns ca. 2,5 Stunden zu isolieren und zu beschriften neutrophils.

2. Neutrophile Isolation mit Polymorphprep

  1. Isolieren Neutrophilen, wie zuvor beschrieben 22, oder mit einem ready-made Dichtegradientenlösung zu polymorphkernigen Granulozyten aus Vollblut zu isolieren. Der Einsatz Polymorphprep nach dem Protokoll von Nuzzi ea 2007 Ergebnisse in Ausbeuten von ca. 2-3 x 10 6 Neutrophile pro ml Vollblut 23. Hinweis: Um eine übermäßige Erythrozyten-Lyse, ein Dextran Sedimentation zu vermeiden, um rote Blutkörperchen zu entfernen, kann vor Dichtegradientenzentrifugation 24 durchgeführt werden.
  2. Bringen Sie die Polymorphprep Dichtegradientenlösung auf RT.
  3. Sammeln 30 ml Vollblut eines gesunden menschlichen Freiwilligen in Gegenwart eines Antikoagulans wie Heparin, Citrat oder EDTA. Das Blut sollte innerhalb von 2 Stunden verwendet werden, und hielt zwischen 18-22 ° C.
  4. Schicht 5 ml Vollblut in 5 ml der Dichtegradient-Lösung in einem 15 ml konischen Röhrchen (Abbildung 2A). Vermeiden Änderung Volumina von Blut und die Dichtegradientenlösung da dies die anschließende Zentrifugation Bedingungen ändern kann.
  5. Zentrifugation bei 450 × g für 30 min bei 18-22 ° C. Vergewissern Sie sich, langsam zu beschleunigen und auf der Zentrifuge (dh schalten Sie die Zentrifuge Bremse), und das Gleichgewicht der Rohre gut um Vibrationen zu vermeiden zu helfen, reduzieren die Aktivierung der Neutrophilen und verhindern, dass die Vermischung der Schichten. Längere Zentrifugationszeiten oder höher Zentrifugalkraft wird in der unteren Schicht Leukozyten, die neutrophilen Granulozyten enthält führen, um weiter nach unten wandern in Richtung zu den pelletierten roten Blutkörperchen.
  6. Absaugen des Plasmas und oberen Leukozyten enthaltende Bande PBMCs die Kontamination der Schicht, die Neutrophilen (2B) zu verhindern.
  7. Verwenden Sie einen 1-2 ml serologische Pipette, um die untere Schicht, die Neutrophile Leukozyten zu entfernen. Kombinieren der Neutrophilen-Schichten in 30 ml PBS (ohne Ca 2 + und Mg 2 +) in einem 50 mlkonischen Rohr.
  8. Bringen Sie die Lautstärke von bis zu 50 ml mit PBS (ohne Ca 2 + und Mg 2 +) und Zentrifuge bei 450 g für 10 min bei 18-22 ° C.

Hinweis: Die Schritte 2.9 und 2.10 sind optional, aber sehr zu empfehlen.

  1. Saugen Sie den Überstand. Resuspendieren der Neutrophilen in 8 ml sterilem Wasser für 30 Sekunden, um rote Blutkörperchen zu lysieren, sofort fügen Sie die Zellsuspension in 2 ml 5x PBS (ohne Ca 2 + und Mg 2 +) und vorsichtig von Hand mischen. NICHT inkubieren Zellen in Wasser für mehr als 30 Sekunden da erhebliche Neutrophilen Tod auftreten können.
  2. Zentrifugation bei 250 × g für 5 min bei 18-22 ° C.
  3. Die Zellen werden einmal mit 10 ml PBS (ohne Ca 2 + und Mg 2 +) und erneut zentrifugiert bei 250 × g für 5 min bei 18-22 ° C.
  4. Resuspendieren der Neutrophilen in 10 ml RPMI-1640 (ohne Phenolrot) und zählen die lebenden Zellen unter Verwendung des TrypanblauFärbeausschlussverfahren Verfahren. Vermeiden längere Zelldichten größer als 5 x 10 6 pro ml, da dies zu einer Aktivierung der Neutrophilen führen kann.

3. Neutrophile Labeling mit Calcein AM

  1. 6 x 10 5 Neutrophilen pro Vertiefung einer 48-Well-Platte verwendet.
  2. Nach dem Zählen, übertragen Sie die resuspendierten Zellen in eine 50 ml konischen Röhrchen und verdünnen die Neutrophilen auf 2-4 x 10 6 Zellen pro ml mit Phenolrot-freiem RPMI-1640.
  3. In Calcein AM Stammlösung bis 3 um (dh 2,98 ul Calcein AM stock (1 mg / ml) pro ml Medium) und gut mischen durch leichtes schnippen die Röhre. Mehr als 5 um Calcein AM wird in Leck aus den Neutrophilen führen. Hinweis: Non-fluoreszierendem Calcein AM wird innerhalb der Zellen durch endogene Esterasen gespalten, um das stark fluoreszierende Molekül Calcein (dh tote Zellen nicht fluoreszieren) zu produzieren.
  4. Decken Sie die Röhrchen mit Alufolie und Inkubation for 30 min bei 37 ° C im Dunkeln. Hinweis: Längere Inkubationszeiten in mehr Calcein führen freigesetzt aus den Neutrophilen im Laufe der Adhäsionsassay.
  5. Zentrifugation bei 450 × g für 5 min bei 18-22 ° C und wäscht die Neutrophilen 2x mit 10 ml RPMI-1640 (ohne Phenolrot, vorgewärmt auf 37 ° C). Nach Resuspendieren der Zellen für die zweite waschen, zuerst über die Neutrophilen obwohl eine 40 uM Sterilfilter Klumpen zu entfernen und dann zentrifugiert erneut bei 450 xg für 5 min bei 18-22 ° C.
  6. Resuspendieren der Neutrophilen in RPMI 1640 (ohne Phenolrot, vorgewärmt auf 37 ° C) mit 2 x 10 6 pro ml Neutrophilen.

4. Neutrophile Binding Assay

  1. Waschen Sie die HMVEC Monoschichten 3x mit 0,5 ml steril filtriert (0,22 um) RPMI 1640 (ohne Phenolrot) mit 3% BSA pro Well.
  2. Saugen Sie die Medien, und fügen Sie 6 x 10 5 Calcein-markierten Neutrophilen (0,3 ml Zellsuspension) Oder 0,3 ml RPMI 1640 (ohne Phenolrot) ohne Neutrophilen, in die entsprechenden Vertiefungen der 48-Well-Platte. Hinweis: Dies ist das Äquivalent von 8 x 10 5 Neutrophilen pro cm 2.
  3. Inkubation für 20 min bei 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator.
  4. Insgesamt Neutrophile Fluoreszenz (Vorwäsche): Messen Sie die Fluoreszenzintensität jeder Vertiefung mit einer Anregungswellenlänge von 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 520 nm (Fluoresceinfilter set) in einem FLUOstar, oder gleichwertig, Spektralphotometer. Diesen Schritt unmittelbar vor der Inkubation Endpunkt Anmerkung: In diesem Protokoll Calcein Anregung und Detektion des emittierten Lichts wurden von der Oberseite der nicht abgedeckten Vertiefungen durchgeführt, aber beide können auch aus dem Boden der Vertiefungen vorgenommen werden..
  5. Waschen der Vertiefungen mit HMVEC Monoschichten und Neutrophilen 5x mit 0,5 ml pro Vertiefung von PBS (w / Ca 2 + und Mg 2 +). Entfernen Sie die Medien und Waschungendurch Umdrehen der Platte, und klopfte sanft auf Küchenpapier entfernen Sie die restliche Flüssigkeit.
  6. In wieder 0,3 ml RPMI 1640 (ohne Phenolrot) pro Vertiefung.
  7. Adherent Neutrophile Fluoreszenz (POST wash): Messen Sie die Fluoreszenzintensität jedes gut wie in Schritt 4.4.
  8. Bestimmen Sie die Einhaltung Prozent und relative Einhaltung pro Well:

Hinweis: In diesem Stadium, Bilder der Calcein-markierten Neutrophilen kann unter Verwendung eines Fluoreszenz-Mikroskop mit Standard-fähig Fluorescein Filtern ausgestattet, erhalten werden. Die Bilder in Abbildung 4 wurden an einem Olympus IX51 inversen Mikroskop mit einer Kamera Retiga 2000R (Q Imaging) mit Q-Capture-Software Pro7 (Q Imaging) ausgestattet erhalten.

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Representative Results

Um eine zuverlässige, reproduzierbare Ergebnisse mit einem Neutrophilen Bindungs-Assay erhalten, ist es wichtig, dass die Gesundheit und das Konfluenz der mikrovaskulären Endothelzellen optimal am Tag des Tests sind, wie bei HMVEC-Lung in Abbildung 1 dargestellt. Darüber hinaus ist es unerlässlich, dass niedrige Durchgang Nummer mikrovaskulären ECs verwendet werden (dh weniger als 9 Stellen), und entsprechend, empfehlen wir die Durchführung aller Experimente innerhalb von zwei Wochen nach dem Auftauen. Die Gesundheit der Neutrophilen ist auch von größter Bedeutung, zumal Calcein AM nicht an das fluoreszierende Molekül Calcein metabolisiert werden, wenn die Zellen in irgendeiner Weise bestehen. Wir verwenden die Trypanblauausschluß Verfahren, und nicht mit dem Test fortzufahren, wenn ein erheblicher Anteil der Zellen tot (dh gebeizt) sind.

Es gibt mehrere Möglichkeiten, um Neutrophile isolieren, einschließlich Dichtegradienten und Antigen basierenden Spalte Trennverfahren, und einemdiese sollten für dieses Verfahren ausreichen. Wir entschieden uns, die Polymorphprep ready-made Dichtegradientenlösung von Axis-Shield verwenden. Wie in 2 zu sehen ist, sind die PBMCs in der oberen Schicht, wobei die Neutrophilen in der unteren Schicht nach dem Zentrifugieren. Die PBMC Schicht wird abgesaugt, um eine Verunreinigung der Granulozyten auf ihre Entfernung zu vermeiden. Es ist wichtig zu beachten, dass Schritt 2.9, in denen Wasser hinzugefügt, um alle verbleibenden roten Blutkörperchen zu lysieren, optional ist. Doch während es ideal ist, um alle verunreinigenden Erythrozyten zu entfernen, ist es entscheidend, dass die Neutrophilen nicht in reinem Wasser sitzen für mehr als die 30 Sekunden nach dem erheblichen Tod auftreten können.

Schließlich werden die Neutrophilen mit Calcein AM für 30 Minuten gewaschen und im vorgewärmten (37 ° C) RPMI-1640-Medium (ohne Phenolrot) resuspendiert inkubiert. Es ist wichtig, Medium ohne Phenolrot, die mit der Fluoreszenzmessung stören können. Die Zahl der neutrophils in die Vertiefungen gegeben ist eher willkürlich, vorausgesetzt, dass die Fluoreszenz-Messungen vor und nach dem Waschen im linearen Bereich des Spektrophotometers sind, und die Unterschiede zwischen den Behandlungen, die entweder fördern oder zu verhindern Neutrophilen Einhaltung kann reproduzierbar ermittelt (siehe unten). Wir finden, dass die Fluoreszenz OD 520nm im linearen Bereich ist, wenn 10.000 bis 1.000.000 markierten Neutrophilen analysiert (Abbildung 3A). Interessanterweise finden wir auch, dass die Einhaltung Prozent mehr als Neutrophilen an HMVEC-Lung Monoschichten mit TNFa behandelt werden hinzugefügt erhöht [100 ng / ml] für 3 Stunden (3B). Wir entschieden uns, die HMVEC-Lung und Calcein-markierten Neutrophilen zusammen inkubieren 20 min, da finden wir, dass der Prozentsatz der Haftung nicht wesentlich nach diesem Zeitpunkt (Daten nicht gezeigt) zu erhöhen. Zu beachten ist, in diesem Test verwendeten wir standard, glasklarem Polystyrol 48-Well-Platten und festgestellt, dass das Niveau der Fluoreszenz cross-over Lesungen zwischen ter Brunnen nicht mehr als 0,5% der gesamten Fluoreszenz-Eingang (Daten nicht gezeigt) betragen. Dennoch empfehlen wir die Verwendung von 48-Well-Platten absichtlich für Fluoreszenz-Spektralphotometer Lesungen für empfindlichere Experimente, wenn verfügbar, oder zumindest, Gestaltung Ihrer Experiment Cross-over-Lesungen zu minimieren (siehe Schritt 1.2).

Um zu zeigen, dass die Anzahl von Neutrophilen in die Vertiefungen gegeben und nicht willkürlich ist, solange die Anzahl aufgenommen innerhalb des linearen Bereichs des Spektrometers ist, führten wir eine Neutrophilen-Adhäsion Assay mit TNF behandelten HMVEC-Lung in Gegenwart oder Abwesenheit des p38 MAPK-Inhibitor BIRB7906 mit unterschiedlichen Eingangs-Mengen von Neutrophilen (dh 40.000 / well, 200.000 / gut oder 1.000.000 / well) 25. p38-MAPK wurde zuvor gezeigt, dass die für E-Selektin-Expression in humanen TNF-behandelten ECs und seine Hemmung sollte daher reduziert Neutrophilen Bindung an TNF-aktivierten HMVEC-Lung26. In der Tat ist das, was wir (3C) zu beobachten. Obwohl wir, dass die Einhaltung Prozent mehr als Neutrophilen hinzugefügt werden erhöht, und die prozentuale Haftung zwischen Experimente unterscheiden, aufgrund verschiedener Faktoren wie der Donor-Variationen, die Qualität der Neutrophilen und die Dichte HMVEC bei Konfluenz die relative Einhaltung zwischen Bedingungen relativ konstant bleibt in jeder unabhängigen Experiment unabhängig von der Anzahl von Neutrophilen hinzugefügt (3C und Daten nicht gezeigt). Diese Daten verdeutlichen auch, warum es besser ist, die Haftung in Bezug auf Daten als positive Kontrolle für die inter-experimentellen Konsistenz anzuzeigen.

Um zu illustrieren, wie dieser Test funktioniert, führten wir eine Neutrophilen Adhäsionsassay mit TNF-behandelten HMVEC-Lung vorinkubiert entweder mit Kontroll-Antikörper oder eine E-Selektin blockierenden Antikörper. E-Selektin auf dem EG-Oberfläche nach der Behandlung mit TNF und fängt neutr ausgedrücktophils aus dem Gefäßsystem über elektrostatische Wechselwirkungen mit glycomolecules präsentieren auf der Neutrophilen-Oberfläche 1,27. Als numerisch in 4A gezeigt, graphisch in Figur 4B und optisch in 4C, die TNF-behandelten HMVEC-Lung mit der E-Selectin-Antikörper gebunden ~ 75% weniger als der Neutrophilen TNF behandelten HMVEC-Lung vorinkubiert vorinkubiert mit Kontroll-IgG. Dies legt nahe, E-Selektin spielt eine wichtige Rolle in Anbindehaltung Neutrophilen an HMVEC-Lung in unserem statischen Adhäsionsassay.

Abbildung 1
Abbildung 1. Beispiel für gesunde, konfluenten Monoschichten HMVEC-Lung. Beachten Sie die "Kopfsteinpflaster" Aussehen und insgesamt Konfluenz der Monoschichten. Die Bilder wurden bei 10-facher Vergrößerung und 4X auf einem Fisher Scientific Micromaster invertierten Digitaleingang Lupe genommen. Abbildung 2
Abbildung 2. Vollblut und Polymorphprep vor der Zentrifugation geschichtet (A) getrennt und nach Zentrifugation (B). Beachten Sie, dass nach der Zentrifugation werden die PBMCs eine deutliche obere Band zu bilden, während die polymorphkernigen Granulozyten (Neutrophile) eine deutliche untere Band zu bilden.

Abbildung 3
Abbildung 3. Die Beziehung zwischen Neutrophilen Anzahl und Fluoreszenz OD 520nm ist linear; die prozentuale Adhäsion von Neutrophilen an TNF-behandelten HMVEC-Lung steigt mehr Neutrophile werden hinzugefügt; p38-MAPK fördert Neutrophilen Einhaltung TNF-aktivierten HMVEC-Lung Monoschichten (A) Grafik. Darstellung der linear Beziehung zwischen Fluoreszenz OD 520nm und Neutrophilen-Zahlen über zwei Größenordnungen. Ein R2 Wert von 0,996, einen linearen Beziehung zwischen Anzahl und Neutrophilen Fluoreszenz OD 520nm bei 10.000 bis 1.000.000 Neutrophilen untersucht werden. (B) Grafische Darstellung der prozentualen Festhalten, wenn eine unterschiedliche Anzahl von Calcein-markierten Neutrophilen zugegeben unbehandelten oder TNF-behandelten ( 100 ng / ml;. 3 hr) HMVEC-Lung Monoschichten in 48-Well-Platten (C) HMVEC-Lung wurden die Monolayer mit der p38-MAPK-Inhibitor BIRB796 (10 mM) (Axon Medchem) oder DMSO (Kontrolle) vorinkubiert 1 Stunde vor der TNFa (100 ng / ml) Behandlung für 3 Stunden, während in der kontinuierlichen Präsenz von BIRB796 (10 mM). Die relative Haftung wurde wie in Schritt 4.8 berechnet. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. GraphPad Prism ungepaarten t-Test wurde für die statistische Analyse (n = 3) (TNF-behandelten vs TNF-behandelten zzgl. BIRB796) verwendet. p-Wert ** <0,01; *** &# 60;. 0.001 Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Fig. 4
Abbildung 4. E-Selektin fördert die Einhaltung von Neutrophilen an TNF-behandelten HMVEC-Lung. HMVEC-Lung wurden mit TNF behandelt [100 ng / ml] für 3 Stunden. Nach dem Waschen der HMVEC-Lung mit RPMI 1640 mit 3% BSA (Schritt 4.1), entweder Schafe IgG [50 ug / ml] (5-001-A, R & D Systems) oder E-Selektin polyklonalen Antikörper (PAB) [50 mg / ml] (AF724, R & D Systems) wurden in die entsprechenden Vertiefungen für 20 min zugegeben. Die HMVEC-Lung Monoschichten wurden dann noch einmal mit RPMI-1640 gewaschen, bevor 6 x 10 5 Neutrophile wurden pro Vertiefung für weitere 20 min zugegeben. (A) Die Berechnungen, um die prozentuale und relative Einhaltung bestimmen gezeigt. CalceinLichtemission bei OD 520 nm gemessen. Hintergrund OD 520nm Durchschnitt aus HMVEC-Lung in Abwesenheit von TNF Behandlung und Neutrophilen abgeleitet. (B) Grafische Darstellung der relativen Prozent Einhaltung von Calcein-markierten Neutrophilen zu unbehandelten oder TNF-behandelten HMVEC-Lung Monoschichten nach Vorinkubation entweder mit Kontrolle IgG oder E-Selectin blockieren pAb. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. GraphPad Prism ungepaarten t-Test wurde für die statistische Analyse (n = 3). Berechnet p-Wert betrug <0,001. (C) Bilder von Calcein-markierten Neutrophilen gebunden zu unbehandelten und TNF-behandelten HMVEC-Lung Monoschichten entweder mit Kontroll-IgG oder E-Selektin pAb vorinkubiert. Ein Beispiel auch mit 6 x 10 5 Neutrophilen vor dem Waschen mit PBS gezeigt (Vorwäsche). Translucent Lichtmikroskopie Bilder werden in der rechten Spalte dargestellt, während Fluoreszenz-Bildern des gleichen Bereich der Referenz, mit einem Fluoresceinfilter, sind in der linken Spalte gezeigt eingestellt. Die Bilder wurden bei 10-facher Vergrößerung auf einem Olympus IX51 inversen Mikroskop mit einer Kamera Retiga 2000R (Q Imaging) ausgestattet gemacht. Vorwäsche = total Neutrophilen Fluoreszenz OD 520nm (Schritt 4.4); POST wash = anhaftenden Neutrophilen Fluoreszenz OD 520nm (Schritt 4.7); PMN - polymorphkernigen Granulozyten; avg - Durchschnitt; IgG - Schaf IgG Kontrolle; E-sel/α-E-selectin - E-Selectin blockieren pAb. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

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Discussion

Die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Neutrophilen / Mikrogefäßendothelzellen Zelladhäsionsassay sind: 1) der niedrigen Passage-Nummer (<9), gesunde Endothelzellen Verwenden; 2) Pflege der isolierten Neutrophilen bei einer geringen Dichte (dh <5 x 10 6 Zellen / ml) und mit ihnen innerhalb von zwei Stunden der Isolation, und 3) Fastidious Waschen der Calcein AM-markierten Neutrophilen und die Nutzung der Calcein AM-markierten Neutrophilen rechtzeitig EG Verschmutzung und Verlust von Calcein aus den Neutrophilen zu minimieren, bzw. .

Wir fügen 8 x 10 5 Neutrophilen pro cm 2 Gewebekulturvertiefung Oberfläche (dh 600.000 Neutrophilen pro Vertiefung einer 48-Well-Platte). Wir finden, dass eine Eingabe von 600.000 Neutrophilen im linearen Bereich der Spektralphotometer ist und zuverlässig reproduziert Daten, wenn die relative Anhaftungen gemessen werden. Allerdings ist eine sehr ähnliche Abnahme in Neutrophilen verbindlich in die beobachtetp38-MAPK-Hemmtest (3C) bei 40.000, 200.000 oder 1.000.000 Neutrophilen pro Vertiefung zugegeben werden, was darauf hindeutet, dass weniger als 600.000 Neutrophilen verwendet werden können.

Das Protokoll beschrieben nur beurteilt das Ausmaß der endothelialen Aktivierung seit der Neutrophilen selbst nicht voraktiviert, oder in irgendeiner Weise behandelt, was natürlich eine Option, wenn Ihre speziellen Test es erfordert. Wir zeigen, dass die Expression von E-Selektin auf TNFa-behandelt HMVEC-Lung ist für die Befestigung der Neutrophilen in diesem Test wichtig, im Einklang mit früheren Beobachtungen 27. Die elektrostatische Bindung von E-Selektin auf glycomolecules auf dem Neutrophilen Oberfläche sind relativ schwach, aber unter Strömungsbedingungen, diese Wechselwirkungen sind gedacht, um die hoch-affine Integrin-vermittelten Anlagen zwischen Neutrophilen und ECs 1,7-10 induzieren. Daher kann dieser Test eher ein Indikator für die ersten Schritte in der Entzündung, dass are notwendig Neutrophilen aus dem Gefäßsystem zu erfassen. Dennoch haben wir festgestellt, dass unsere Ergebnisse mit TNF in diesem Bericht erhalten sehr ähnlich, wenn nicht identisch mit denen unter Verwendung eines Flow Modul (Daten nicht gezeigt) waren, die die Ergebnisse dieser statischen Assay sind physiologisch relevant und schlägt vor, dass dieser Test ist besonders nützlich für Forscher, die keinen Zugang zu einem Flusssystem.

Variationen der beschriebenen Assay mit Calcein als Nachweis Fluorophor wurden erstmals 1993 beschrieben 28,29. Wichtig fanden diese ersten Berichte, dass Calcein hatte keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen und hatte die geringste Wirkung auf die Zellfunktion in Adhäsionsassays zu anderen Fluorescein abgeleitete Farbstoffe 29,30 verglichen. Es wurde auch berichtet, dass die Zellzahl linear in Bezug auf Intensität der Fluoreszenz, im Einklang mit dem, was wir beobachten (Abbildung 3A) 28 ist. Erste Berichte auch hervorgehoben, dass eineHauptvorteil der fluorometrischen Assays ist, dass sie erfordern keine radioaktiven Markierung (zB 111 In oder 51 Cr) der gereinigten Leukozyten 31-33. Die Vorteile und Konsistenzen mit Calcein AM-markierten Zellen über radioaktiv markierten Zellen wurden gründlich diskutiert zuvor 28,29,34. Obwohl wir Calcein AM, um die Neutrophilen in unseren Tests, mehrere andere Zelle permeant Farbstoffe, die Esterasesubstrate sind verfügbar beschriften. Zum Beispiel verkauft Life Technologies CellTrace Calcein rot-orange (C34852), Calcein violett (C34858) und Calcein blau (C34853), die begeistern / bei verschiedenen Wellenlängen emittieren. Die verschiedenen Farbstoffe haben jeweils ihre Vor-und Nachteile. Zum Beispiel hat das Calcein AM rot-orange Farbstoff aus intrinsischer Fluoreszenz vor der Hydrolyse 18.

Wir verwenden diese Methode, um inflammatorischen Aktivierung des Endothels als Reaktion auf bakterielle und endogenen Faktoren (wie TNFa) zu studieren, und thuns verwenden HMVECs von Leichen, die erweitert werden können in ausreichender Menge, um den Test mit entsprechenden Kontrollen zu tun gesammelt und genug Wiederholungen, um statistische Analysen durchzuführen. Denkbar wäre dieser Assay auch als Instrument zur Endothelzellen basierenden Krankheitsprozessen, die Leukozyten-Bindung an den mikrovaskulären Endothel beinhaltet die Untersuchung verwendet werden. Beispiele für Erkrankungen, die untersucht mit HMVECs von Patienten könnte, umfassen chronische obstruktive Lungenerkrankung (COPD), Sepsis, entzündliche Darmerkrankung, Vaskulitiden, wie anti-neutrophilen cytoplasmatischen Autoantikörpern (ANCA)-assoziierten Vaskulitiden und Gehirn Gefäßmalformationen 35-40 . Zum Beispiel könnte HMVECs von Menschen mit Vaskulitiden oder Sepsis post-mortem oder möglicherweise von Patienten mit Endothelzellen basierenden Krankheitsprozessen, die eine Biopsie oder chirurgischen Resektion eines Organs, und ihre Bindung an Neutrophile unter verschiedenen Bedingungen geprüft unterzogen wurden gesammelt. Dies erfordert jedoch ausreichend AssayMengen HMVECs zu Monolayers zu bilden, und somit werden HMVECs expandiert und nach mehreren Durchgängen. Dieser Prozess der Expansion kann auf phänotypische Veränderungen in den ECs, die müssen berücksichtigt bei der Gestaltung Studien mit primären ECs von Patienten mit EC-basierten Erkrankungen eingenommen werden würde. Dennoch ermöglicht die Vielseitigkeit dieses Assays es zu viele andere Anhänger und Leukozyten Zelltypen angepasst werden. In der Tat haben diese Assay oder Varianten davon, erfolgreich mit anderen Endothel-Zellen-Typen verwendet, und primären Zellen und Zelllinien, wie Monozyten, THP-1, Jurkat, HL-60 und U937 28,31,41. Dieser Test hat sich rasch, einfach durchzuführen, reproduzierbar und sehr empfindlich, und deshalb ist ein sehr nützliches Werkzeug zur Endothelzellaktivierung von Entzündungsmediatoren erkennen.

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Disclosures

Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der UCSF Abteilung Anästhesie und perioperative Pflege unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HMVEC-Lung Lonza CC-2527
EGM-2 MV Lonza CC-3202
HBSS Life Technologies 14175-095 Can be substituted with any vendor
48-well Tissue Culture Plates BD Falcon 353078
PBS (without phenol red) UCSF Cell Culture Facility CCFAL001 Can be substituted with any vendor
D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red) UCSF Cell Culture Facility CCFAL003 Can be substituted with any vendor
RPMI-1640 (without phenol red) Life Technologies 11835-030
Polymorphprep Axis-Shield 1114683
calcein AM Life Technologies C3099 (0.995 mM) stock soln
Trypan Blue Solution Sigma-Aldrich T8154
40 μM filters VWR 21008-949 Can be substituted with any vendor
FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer BMG LABTECH -

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Wilhelmsen, K., Farrar, K., Hellman, J. Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions. J. Vis. Exp. (78), e50677, doi:10.3791/50677 (2013).

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