L'adesione dei neutrofili all'endotelio attivato nei siti di infezione è una componente integrale della risposta infiammatoria dell'ospite. Descritto in questo rapporto è un saggio di legame dei neutrofili che permette la In vitro Quantificazione di neutrofilo umana primaria legame alle cellule endoteliali attivate da mediatori infiammatori in condizioni statiche.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'endotelio vascolare svolge un ruolo fondamentale nella risposta infiammatoria. Durante la fase acuta dell'infiammazione, cellule endoteliali (EC) sono attivati da mediatori ospitanti o direttamente da componenti microbici conservati o molecole pericolo ospite-derivati. Attivati ecs esprimere citochine, chemochine e molecole di adesione che mobilitano, attivano e mantengono leucociti nel sito di infezione o lesioni. Neutrofili sono i primi ad arrivare leucociti, e aderire alla endotelio attraverso una varietà di molecole di adesione presenti sulle superfici di entrambe le celle. Le principali funzioni di neutrofili sono eliminare direttamente minacce microbiche, promuovere l'assunzione di altri leucociti attraverso il rilascio di fattori aggiuntivi, e avviare riparazione della ferita. Pertanto, il loro reclutamento e attaccamento alla endotelio è un passaggio fondamentale nell'iniziazione della risposta infiammatoria. In questo rapporto, descriviamo un test di adesione in vitro usando neutrofilicalceina AM-etichettato neutrofili umani primari per quantificare il grado di attivazione delle cellule endoteliali microvascolari in condizioni statiche. Questo metodo ha il vantaggio aggiuntivo che gli stessi campioni quantizzati mediante spettrofotometria a fluorescenza possono anche essere visualizzati direttamente utilizzando la microscopia a fluorescenza per una valutazione più qualitativa di legame neutrofili.
Introduzione
Poiché l'endotelio vascolare è in contatto diretto con il sangue circolante, esso è sitato ad iniziare una risposta infiammatoria rapido durante infezioni o lesioni. Le cellule endoteliali (EC) recettori di pattern recognition espresso che riconoscono una varietà di componenti batteriche conservati e molecole pericolo, e recettori per Host mediatori infiammatori, come TNFa. Attivazione di questi recettori induce EC per secernere citochine (es IL-6, IL-8, CXCL1 e CCL2), e per upregulate molecole di adesione (ad esempio E / P-selectina, VCAM-1 e ICAM-1) alla loro superficie cellulare 1 , 2. Queste molecole tutto facilitano la localizzaz....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Placcatura e manutenzione di microvascolari cellule endoteliali
- Scongelare e far crescere le cellule endoteliali microvascolari secondo i produttori fornite istruzioni. In questo protocollo, le cellule sono state coltivate in EGM-2 MV multimediale (Lonza), e si raccomanda che tutti gli esperimenti vengono eseguiti entro due settimane lo scongelamento per ridurre al minimo qualsiasi variazione dovuta al numero di passaggio. I nostri esperimenti con HMVEC-Lung vengono eseguiti tra passaggi 4-9.
- Giorno 1: Quando le cellule raggiungono 80-90% di confluenza, trypsinize e sospendere nuovamente a 120.000 cellule per ml. Piastra 36.000 cellule (0,3 ml....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Per ottenere risultati affidabili e riproducibili usando un saggio di legame neutrofili, è essenziale che la salute e la confluenza delle cellule endoteliali microvascolari sono ottimali nel giorno del saggio, come illustrato con HMVEC-Lung in Figura 1. Inoltre, è indispensabile che passaggio basso numero microvascolare EC vengono utilizzati (cioè meno di 9 brani), e di conseguenza, si consiglia di eseguire tutti gli esperimenti entro due settimane di scongelamento. La salute dei neutrofili è i.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Le fasi più critiche per una neutrofili di successo / endoteliale microvascolare saggio di adesione cellulare sono: 1) Uso di basso numero di passaggio (<9), cellule endoteliali sane; 2) Il mantenimento dei neutrofili isolati a bassa densità (cioè <5 x 10 6 cellule / ml) e il loro utilizzo in due ore di isolamento, e 3) il lavaggio Fastidious dei neutrofili calceina AM-etichettati e l'uso dei neutrofili calceina AM-etichettati in modo tempestivo per ridurre al minimo la contaminazione CE e .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento UCSF di Cura Anestesia e perioperatoria.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| HMVEC-Lung | Lonza | CC-2527 | |
| EGM-2 MV | Lonza | CC-3202 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-095 | Può essere sostituito con qualsiasi fornitore |
| Piastre per colture tissutali a 48 pozzetti | BD Falcon | 353078 | |
| PBS (senza rosso fenolo) | Impianto di coltura cellulare UCSF | CCFAL001 | Può essere sostituito con qualsiasi fornitore |
| D-PBS (senza Ca2+ e Mg2+ e rosso fenolo) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | Può essere sostituito con qualsiasi fornitore |
| RPMI-1640 (senza rosso fenolo) | Life Technologies | 11835-030 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield | 1114683 | |
| calcein AM | Life Technologies | C3099 | (0,995 mM) stock soln |
| Trypan Soluzione Blu | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 40 μ Filtri M | VWR | 21008-949 | Può essere sostituito con qualsiasi fornitore |
| Spettrofotometro FLUOstar OPTIMA | BMG LABTECH | - |
Riferimenti
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Collins, T., et al.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
