Summary
Denne metode beskriver brugen af klik kemi til at måle ændringer i værtscelle transskription efter infektion med Rift Valley fever virus (RVFV) stamme MP-12. Resultaterne kan visualiseres kvalitativt via fluorescensmikroskopi eller opnået kvantitativt gennem flowcytometri. Denne metode kan tilpasses til brug med andre vira.
Abstract
Mange RNA-vira har udviklet evnen til at inhibere værtscelle transskription som et middel til at omgå cellulære forsvar. Til undersøgelse af disse vira, er det derfor vigtigt at have en hurtig og pålidelig måde at måle transkriptionel aktivitet i inficerede celler. Traditionelt har transkription blevet målt enten ved inkorporering af radioaktive nucleosider såsom 3H-uridin efterfulgt af detektion via autoradiografi eller scintillationstælling eller inkorporering af halogenerede uridin analoger såsom 5-bromouridine (BRU) efterfulgt af detektion via immunfarvning. Anvendelse af radioaktive isotoper, imidlertid kræver specialiseret udstyr og er ikke mulig i en række laboratoriet indstillinger, mens påvisning af Bru kan være besværlige og kan lide af lav følsomhed.
Den nyligt udviklede klik kemi, som indebærer en kobber-katalyseret triazole dannelse fra en azid og en alkyn, giver nu en hurtig og highly følsom alternativ til disse to metoder. Klik kemi er en totrins proces, hvor spirende RNA først mærkes ved inkorporering af uridin analogen 5-ethynyluridine (EU), efterfulgt af detektion af mærket med et fluorescerende azid. Disse azider er tilgængelige som forskellige fluoroforer, der giver mulighed for en bred vifte af muligheder for visualisering.
Denne protokol beskriver en metode til at måle transkriptionel suppression i celler inficeret med Rift Valley fever virus (RVFV) stamme MP-12 under anvendelse af klik kemi. Samtidig er ekspression af virale proteiner i disse celler bestemt ved klassisk intracellulær immunfarvning. Trin 1 til 4 detalje en metode til at visualisere transkriptionel suppression via fluorescensmikroskopi, mens trin 5 til 8 detalje en metode til at kvantificere transkriptionel suppression via flowcytometri. Denne protokol er let at tilpasse til brug sammen med andre vira.
Introduction
Traditionelt har transkriptionel aktivitet blevet målt ved inkorporering af enten radioaktive (3 H-uridin) 1 eller halogenerede (BRU) 2 nukleosider i spirende RNA. Disse uridin analoger er taget op af celler, omdannet til uridin-trifosfat (UTP) gennem nukleosid bjærgning vej, og derefter indarbejdes i nysyntetiseret RNA. 3H-uridin kan påvises ved autoradiografi, hvilket kan være tidskrævende eller scintillation optælling, som kræver specialiseret udstyr. Endvidere kan anvendelse af radioaktive isotoper ikke være praktisk i en række laboratoriet indstillinger, herunder høj indeslutning biosikkerhed laboratorier. Bru kan påvises ved immunfarvning med anti-BRU-antistoffer, hvilket kan kræve barske permeabilisering at sikre adgang af antistoffet til kernen eller delvis denaturering af RNA, som RNA sekundær struktur kan være en sterisk hindring for antistofbinding.
_content "> protokollen beskrevet her udnytter den nyligt udviklede klik kemi 3 at måle transkriptionel aktivitet i celler inficeret med RVFV stamme MP-12. klik kemi bygger på yderst selektiv og effektiv kobber (I)-katalyseret cycloadditionsreaktion mellem en alkyn og et azid del 4,5. I denne protokol, er spirende RNA i inficerede celler mærkes først gennem inkorporering af Uridin analog EU. I et andet trin, er indarbejdede EU opdaget ved reaktion med en fluorescerende azid. De vigtigste fordele ved denne metode er (1) at det ikke kræver anvendelse af radioaktive isotoper og (2) at det ikke kræver barske permeabilisering eller denaturering af RNA. Med en molekylvægt på mindre end 50 Da, adgang for de fluorescerende azid ikke hindres af utilstrækkelig permeabilization eller RNA sekundær struktur. Desuden er forskerne ikke begrænset i deres valg af primære antistoffer, når man kombinerer påvisning af RNA med en klasseical immunfarvning for virale proteiner.To forskellige fremgangsmåder er beskrevet i denne protokol: en til at visualisere transkription via fluorescensmikroskopi (trin 1-4), og én til kvantificering transkription gennem flowcytometri (trin 5-8). Begge disse metoder kombinere mærkning af spirende RNA med et intracellulært immunfarvning for virale proteiner, hvilket muliggør en korrelation mellem transkriptionel aktivitet og virusinfektion på en celle til celle-basis.
Forfatterne har med succes brugt protokollen beskrevet her at bestemme transskriptionel aktivitet i celler inficeret med RVFV stamme MP-12 6 celler inficeret med forskellige MP-12 mutanter 7,8, 9 og celler inficeret med Toscana-virus (TOSV) 10.. Protokollen beskrevet her, kan let tilpasses til anvendelse med forskellige vira og har potentialet til at blive modificeret til at omfatte immunfluorescensfarvning af specifikke virale eller cellulære proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Analyse af transkription ved fluorescensmikroskopi
1.. Inficere celler med MP-12 og Label Gryende RNA med EU
- Place 12-mm runde dækglas i 12-brønds vævskulturplade, et dækglas per brønd.
Bemærk: Hvis cellerne har problemer overholde dækglas, frakke med poly-L-lysin (MW ≥ 70.000), før anbringelse i brønde. Til dette formål nedsænkes dækglas i en steril 0,1 mg / ml opløsning i H2O af poly-L-lysin i 5 min. Skyl dækglas med sterilt H 2 O og lufttørre i mindst 2 timer.
- Til frø 293 celler på dækglas, 5 x 10 4 celler tilsættes i 1 ml vækstmedium (DMEM indeholdende 10% føtalt bovint serum, 100 U / ml penicillin og 100 mg / ml streptomycin) pr godt. Inkuber i en fugtig inkubator ved 37 ° C og 5% CO 2 O / N.
- Inficere celler med MP-12 ved en multiplicitet af infektion (MOI) på 3.. Omfatte mindst to inficerede brønde: en af de to brønde vil fungere som ikke-inficerede kontrol, vil det andet blive behandlet med actinomycin D (ActD) ved trin 1.5 som en kontrol for transkriptionel undertrykkelse. Fjern vækstmedium og fortyndes virusstamopløsningen således at den samlede mængde tilsat til hver brønd er 200 ml. Der inkuberes i 1 time i en fugtig inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
Bemærk: I stedet for at inficere celler, kan cellerne også transficeret med plasmid-DNA eller in vitro syntetiseret RNA, der koder en specifik viral protein. Til dette formål celler transfektion med passende kemisk transfektionsreagens i henhold til producentens anvisninger, og fortsæt til trin 1,5 ved 16 timer efter transfektion. Det er tilrådeligt at optimere transfektions betingelser og inkubationstid før RNA mærkning og fiksering.
- Fjern inokulum og der tilsættes 1 ml frisk vækstmedium per brønd. Inkuber ved 37 ° C i 15 timer.
- Ved 15 timer efter infektion (HPI), udskift vækstmedium med medium indeholdende 1 mM EU. Til en af de mock-inficerede brønde, tilsættes også 5 ug / ml ActD. Dette vil tjene som kontrol for transcriptional undertrykkelse, da ActD hæmmer DNA-afhængig RNA-syntese. Returnere cellerne til inkubatoren.
- Ved 16 HPI, fjern medium og vask dækglassene gang med 1 ml PBS (KCl 0,20 g / L, KH 2 PO 4 0,20 g / L, NaCl 8,00 g / L, Na 2 HPO 4 1,15 g / l, pH 7,4) brønd. Lave celler ved tilsætning af 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA) per brønd og inkubering i 30 minutter ved stuetemperatur.
Bemærk: At forberede 4% PFA fiksering opløsning opløses 10 g paraformaldehyd i 150 ml H 2 O opvarmes til 60 ° C på en opvarmet magnetomrører. Tilsæt 500 pi 1M NaOH og fortsætte med at røre indtil opløsningen bliver klar. Filter PFA opløsningen gennem et papirfilter for at fjerne partikler og tilsæt 62,5 ml phosphatbuffer (77 mM NaH 2 PO 4, 287 mM Na 2 HPO 4, pH 7,4). Tilføj H2O op til et samlet volumen på 250 ml. Fryse ved -20 ° C i engangsmaterialer portioner.
- Vask en gang med 1 ml PBS per brønd. Ingen inkubationstiden er påkrævet for denne og alle efterfølgende vaske trin. Fortsæt straks til trin 2.
Bemærk: Det er vigtigt straks at gå videre med klik reaktion, da RNA degenererer, hvis de opbevares på dette stadium i længere tid, et tab af RNA fluorescenssignal kan allerede observeres, hvis cellerne holdes i 1 time ved 4 ° C . Tilsvarende, hvis prder danner en tidsforløbsforsøg være sikker på at mærke, fix, og plette alle prøver på samme tid.
2.. Klik Reaction Detect mærkede RNA
- Permeabilisere celler ved tilsætning af 1 ml 0,2% Triton X-100 i PBS. Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur.
Bemærk: Alle løsninger, der anvendes i trin 2,1-2,3 nødt til at være nukleasefrit.
- Der vaskes tre gange med 1 ml PBS per brønd.
- Fjern dækglas fra 12-brønds plade og overføres til fugtigt kammer. Dæk hver dækglasset med 50-100 ul klik farvning opløsning (100 mM Tris pH 8,5, 1 mM CuSO4, 20 uM fluorescerende azidgrupper [excitation / emission maksimum: 590/617 nm], 100 mM ascorbinsyre) hver. Der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur i mørke.
Bemærk: For at samle fugtigt kammer, linje bunden af en cellekultur eller petriskål med en diameter på 10 cm med plast paraffin film. Linje indersiden af kanten af dish med fugtige papirservietter. Placer dækglas på plast paraffin film.
Bemærk: Vær forsigtig med ikke at lade dækglas tørre ud i løbet af denne eller andre skridt i protokollen. Det er bedst at tilføje farvningsopløsningen til hver dækglas direkte efter det er blevet placeret i den fugtige kammer.
Bemærk: Forbered klik farvningsopløsningen frisk umiddelbart forud for dette skridt. Stamopløsninger af 1,5 M Tris, pH 8,5, 100 mM CuSO4, og 500 mM ascorbinsyre kan opbevares ved 4 ° C. Men kassere ascorbinsyre stamopløsning, der har slået gul.
Bemærk: Sørg for at vælge en fluorophor, der matcher de filtre på din fluorescerende mikroskop.
- Fjern dækglas fra fugtkammer og anbringes i en frisk 12-brønds plade og vaskes tre gange med 1 ml PBS per brønd.
Bemærk: Hvis der ikke debeskyttelse af virale proteiner ønskes, dækglas kan monteres og filmede efter dette trin (fortsæt til trin 3.3).
3.. Immunofluorescens at opdage Angivelse af virale proteiner
- Tilsæt 1 ml blokeringsbuffer (3% (w / v) bovint serumalbumin (BSA) i PBS) til hver brønd og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Fjern dækglas fra 12-brønds plade, overførsel til fugtigt kammer og dæk med 50-100 ul primært antistof (anti-RVFV, en slags gave fra Dr. RB Tesh, UTMB) fortyndet med blokerende buffer (1:500). Der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur i mørke.
Bemærk: Når tilpasse dette protokol til brug med en anden virus, bestemme den optimale fortynding til din primære antistof først.
Bemærkning: Alternativt kan dette trin udføres O / N ved 4 ° C i mørke.
- Fjern dækglas fra fugtkammer og sted tilbage i 12-brønds plade og vasktre gange med 1 ml PBS per brønd.
- Fjern dækglas fra 12-godt sted, anbringes i fugtigt kammer og dæk med 50-100 ul sekundært antistof (anti-mus IgG konjugeret til fluorescerende farvestof [excitation / emission maksimum: 495/519 nm]) fortyndet med blokerende buffer (1: 500). Der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur i mørke.
Bemærk: Sørg for at vælge et sekundært antistof, der kan genkende din primære antistof og matcher filtrene på din fluorescerende mikroskop.
Bemærk: Hvis det ønskes, kan 200 ng / ml DAPI hvormed det sekundære antistof fortynding at visualisere cellekerner.
- Fjern dækglas fra fugtkammer og sted tilbage i 12-brønds plade og vaskes tre gange med 1 ml PBS per brønd.
- Monter dækglas ved at placere en dråbe (ca. 15 ul) af Fluoromount-G på et objektglas. Dyp dækglasset i H 2 O, fjerne overskydende H 2 O ved at røre the side mod et stykke køkkenrulle, og sted celle nedad i dråbe Fluoromount-G. Lufttørre i 5 min.
Bemærk: Hvis billeddannelse på en omvendt mikroskop, tillade Fluoromount-G at størkne ved 4 ° CO / N eller anbringe dækglas til mikroskoppræparatglasset ved at forsegle kanten med gennemsigtigt neglelak.
Bemærk: Slides kan afbildes straks eller opbevares ved 4 ° C i mørke i op til en uge.
4.. Erhvervelse af data
- Billede ved hjælp af et fluorescerende mikroskop.
Bemærk: Sørg for at vælge passende fluorforer der kan visualiseres ved hjælp af din mikroskop. For reference, er følgende fluoroforerne og filter sæt, der anvendes til at erhverve de billeder, der vises i denne publikation.
DAPI:
Excitationsfilter: BP 330-385
Dikromatiske spejl: 400 DM
Emission filter: LP 420
Dikromatiske spejl: DM 505
Emission filter: LP 510
Fluorofor med en excitations / emission maksimalt 590/617:
Excitationsfilter: BP 545-580
Dikromatiske spejl: DM 600
Emission filter: LP 610
Analyse af transkription ved flowcytometri
5.. Inficere celler med MP-12 og Label Gryende RNA med EU
- Frø 293 celler i 6-brønds vævskulturplade i vækstmedium (DMEM indeholdende 10% føtalt bovint serum, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin). Inkuber i en fugtig inkubator ved 37 ° C og 5% CO2, indtil cellerne har nået 80 - 100% konfluens.
- Inficere celler med MP-12 ved en moi på 3.. Omfatte mindst to ikke-inficerede brønde: en af de to brønde vil tjene som inficerede kontrol, vil det andet blive behandlet med ActD på trin5.4. Fjern vækstmedium og fortyndes virusstamopløsningen således at den samlede mængde tilsat til hver brønd er 400 pi. Der inkuberes i 1 time i en fugtig inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Fjern inokulum og der tilsættes 2 ml frisk vækstmedium per brønd. Inkuber ved 37 ° C i 12 timer.
Bemærk: Hvis tilpasse denne protokol til brug med en anden virus, er det tilrådeligt at udføre et tidsforløb eksperiment for at bestemme den optimale tidspunkt til mærkning og høst. Oprette denne tidsforløbet således at infektionen tider er forskudt, og alle prøver kan mærkes, høstes og farves samtidig.
- Ved 12 HPI, udskifte vækstmedium med medium indeholdende 0,5 mM EU. Til en af de mock-inficerede brønde, tilsættes også 5 ug / ml ActD. Dette vil tjene som kontrol for transcriptional undertrykkelse, da ActD hæmmer DNA-afhængig RNA-syntese. Returnere cellerne til inkubatoren.
- Ved 13 HPI, vask celler når with PBS og høst ved trypsinisering af celler. Vask høstede celler tre gange med PBS indeholdende 1 mM EDTA (PBS-EDTA).
Bemærk: Under dette og de efterfølgende skridt ikke centrifugeres cellerne hurtigere end 500 - 1.000 xg for at forhindre cell brud. Centrifuger celler til 1 - 2 min til sediment.
Bemærk: Hvis en overflade immunfarvning er planlagt efter klik reaktion, høst ved hjælp af en gummi-politimand eller engangs celleskraber i stedet.
- Lave celler ved at resuspendere dem i 1 ml 4% PFA og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur. Se trin 1.6 for vejledning om, hvordan man forbereder 4% PFA.
- Vask en gang med 1 ml PBS-EDTA per brønd. Fortsæt straks til trin 6..
Bemærk: Det er vigtigt straks at gå videre med klik reaktion, da RNA degenererer, hvis de opbevares på dette stadium i længere tid. Tilsvarende, hvis udføre en tid course eksperiment, skal du sørge for at mærke, fix og plette alle prøver på samme tid.
6.. Klik Reaktion på Detect mærkede RNA
- Permeabilisere celler ved resuspendering i 0,5 ml 0,2% Triton X-100 i PBS. Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur.
Bemærk: Alle løsninger, der anvendes i trin 6,1-6,3 nødt til at være nukleasefrit.
Bemærk: Hvis celler ikke gør sediment korrekt under dette trin, øger centrifugering tid til 5 min. Sedimentation adfærd vil forbedre når Cellerne suspenderes i FACS-puffer (trin 6.4).
- Vask en gang med 1 ml PBS.
Bemærk: Brug ikke EDTA i dette trin, da dette vil chelatere Cu 2 +-ioner er nødvendige for klik reaktion.
- Resuspender cellerne i 200 ul klik farvningsopløsning (100 mM Tris, pH 8,5, 1 mM CuSO4, 200 nM azid mærket med fluorescerende farvestof [excgrænsning / emission maksimum: 650/665 nm], 100 mM ascorbinsyre). Der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur i mørke.
Bemærk: Forbered klik farvningsopløsningen frisk umiddelbart forud for dette skridt. Stamopløsninger af 1,5 M Tris, pH 8,5, 100 mM CuSO4, og 500 mM ascorbinsyre kan opbevares ved 4 ° C. Men kassere ascorbinsyre stamopløsning, der har slået gul.
Bemærk: Hvis cellerne klumper sig sammen under dette trin, resuspender ved pipettering op og ned adskillige gange.
Bemærk: Sørg for at vælge en fluorophor, der kan påvises ved dit flowcytometer.
Bemærk: Også forberede en prøve af inficerede celler, som ikke udsættes for et klik farvningsproceduren, og disse vil være behov for kalibrering af flowcytometeret. Enten bruge halvdelen af de inficerede celler eller omfatte en supplerende smittet godt på trin 5.2. Disse control celler vil blive immunfarvet på trin 7.1.
- Vaskes to gange med FACS-buffer (PBS indeholdende 1 mM EDTA og 0,5% (w / v) BSA).
Bemærk: Hvis der ikke immunfarvning af virale proteiner ønskes, kan cellerne analyseres straks (gå til trin 8).
7.. Immunofluorescens at opdage Angivelse af virale proteiner
- Resuspender celler i 200 pi primære antistof (anti-RVFV) fortyndet i FACS-buffer (1:10.000) og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur i mørke.
Bemærkning: Alternativt kan dette trin udføres O / N ved 4 ° C i mørke.
Bemærk: Også forberede en prøve af ikke-inficerede celler, som blev udsat for et klik farvningsproceduren men vil ikke blive immunfarvet, vil disse være behov for kalibrering af flowcytometeret. Enten bruge halvdelen af de mock inficerede celler eller inkludere en ekstra inficerede godt påtrin 5.2.
Bemærk: Når tilpasse dette protokol til brug med en anden virus, bestemme den optimale fortynding til din primære antistof først.
- Vask cellerne to gange i FACS-buffer.
- Resuspender celler i 200 pi sekundært antistof (anti-muse IgG konjugeret til fluorescerende farvestof [excitation / emission maksimum: 495/519 nm]) fortyndet i FACS-buffer (1:1000) og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur i mørke.
- Vask cellerne en gang i FACS-buffer.
Bemærk: På dette punkt kan celler opbevares O / N ved 4 ° C i mørke.
8.. Erhvervelse af data
- Resuspender celler i 500 pi FACS buffer, overførsel til 5 ml polystyrenrør og analysere ved hjælp af et flowcytometer. Brug MP-12-inficerede celler (ingen klik reaktion, anti-RVFV farvning kun) og mock-inficerede celler (klik reaktion kun) at kalibrere instrumentet.
Ikkee: Sørg for at vælge passende fluorforer, der kan påvises ved dit instrument. For reference, er følgende laser linjer og filter sæt anvendes til at erhverve de data, der vises i denne publikation.
Fluorfor med et anslag / emission spektrum af 495/519:
Laser: 488 nm
Filter: 530/30
Fluorfor med et anslag / emission spektrum af 650/665:
Laser: 640 nm
Filter: 670/20
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
NSS protein RVFV (familie Bunyaviridae, slægten Phlebovirus) 11 inhiberer værtscelle generel transkription gennem to særskilte mekanismer: (I) ved at sekvestrere p44-underenheden af den basale transskriptionsfaktor TFIIH 11 og (ii) ved at fremme proteasomalaktivitet nedbrydning af p62 underenheden af TFIIH 6.. Den RVFV MP-12 vaccinestamme 13 er blevet anvendt til eksperimenterne beskrevet i denne protokol, da MP-12 stammen kan håndteres i en biosikkerhed niveau 2 laboratoriet og er udelukket fra select agent reglen i USA, som gælder for andre vilde- skriv RVFV stammer. NSS protein MP-12 stammen er fuldt funktionel og bevarer evnen til at undertrykke vært transkription 6.. Den virus rMP12-C13type, der bærer en sletning omfatter 69% af NSS genet 14, er medtaget som en kontrol virus mangler alle NSS funktioner, herunder evnen til at undertrykke værtscelle transskription.
Figur 3A viser kvantitative data opnået ved flowcytometri. Dataene repræsenteret scatter plots med fluorescerende signal for EU inkorporering i spirende RNA plottet på y-aksen og at for anti-RVFV farvning afbildet på x-aksen. Kvadrant portene blev indstillet således, at størstedelen af mock-inficerede celler blev placeret i den øverste venstre kvadrant, blev størstedelen af ActD behandlede celler beliggende i den nederste venstre kvadrant, og størstedelen af inficerede celler var beliggende i den højre halvdel af plottet . Når celler blev inficeret med MP-12, 81,5% af totale celler, eller 93% af anti-RVFV positive celler, udviste reduceret transkriptionel aktivitet. I modsætning hertil when-celler blev inficeret med rMP12-C13type, 91,6% af totale celler, eller 97% af anti-RVFV positive celler viste transkriptionel aktivitet, som var sammenlignelig med mock-inficerede celler. Figur 3B afbilder de samme data som figur 3A i form et histogram til fluorescens-RNA mærkning med EU inkorporering.
Figur 1. Fluorescensmikroskopi af celler inficeret med MP-12 og rMP12-C13type. 293 celler blev mock inficeret eller inficeret med enten MP-12 eller NSS deletionsmutanten RMP-12-C13type. Mellem 15 og 16 HPI blev celler mærket med 1 mM EU. Som en kontrol for transkriptionel suppression blev mock-inficerede celler behandlet med 5 mg / ml ActD takt med EU behandling. Kerner er visualiseret gennem DAPI farvning (blå), ekspression af virale proteiner visualiseres ved farvning med anti-RVFV antistoffer (grøn), og RNA er visualisered ved påvisning af den inkorporerede EU med azid mærket med fluorescerende farvestof (excitation / emission maksimum: 590/617 nm) (rød).
Figur 2. Fluorescensmikroskopi af celler transficeret med in vitro syntetiseret RNA til enten GFP eller MP-12 NSS. 293-celler var mock transficeret eller transficeret med in vitro syntetiseret RNA koder for enten GFP eller MP-12 NSS. Mellem 15 og 16 timer posttransfection, blev cellerne mærket med 1 mM EU. Som en kontrol for transkriptionel suppression blev mock-transficerede celler behandlet med 5 mg / ml ActD takt med EU behandling. Ekspressionen af GFP er visualiseret ved farvning med et anti-GFP-antistof (GI), ekspressionen af NSS er visualiseret ved farvning med anti-RVFV antistoffer (AF, km) efterfulgt af anti-muse IgG konjugeret til fluorescerende farvestof (excitation / emission størst muligm: 495/519 nm) (grøn) og RNA er visualiseres ved påvisning af inkorporerede EU med azid mærket med fluorescerende farvestof (excitation / emission maksimum: 590/617 nm) (rød).
Figur 3. (A) Flowcytometrisk analyse af celler inficeret med MP-12 eller rMP12-C13type. Celler var mock inficeret eller inficeret med enten MP-12 eller rMP12-C13type. Mellem 12 og 13 HPI blev celler mærket med 0,5 mM EU. Som en kontrol for transkriptionel suppression blev mock-transficerede celler behandlet med 5 ug / ml ActD takt med EU behandling. Ekspression af virale proteiner visualiseres ved farvning med anti-RVFV antistoffer efterfulgt af et sekundært antistof mærket med fluorescerende farvestof (excitation / emission maksimum: 495/519 nm) (anti-RVFV) og RNA er visualiseret ved påvisning af den inkorporerede EU med azid mærket med fluorescerende farvestof (excitation / emission maksimum: 650/665 nm) (RNA). DATen er repræsenteret som et scatter plot. (B) Repræsentation af de samme data vist i A som et histogram. Fluorescensintensitet for EU inkorporering plottes på x-aksen er celletallet plottet på y-aksen. Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den angivne protokol beskriver en metode til at måle effekten af virusinfektion på værtscelle transskription via inkorporering af Uridin analoge EU til spirende RNA. Denne fremgangsmåde har flere fordele i forhold til tidligere metoder: det er hurtig, følsom, og det ikke er afhængige af anvendelsen af radioaktive isotoper. Endvidere kan fremgangsmåden tilpasses til opnåelse af kvalitative data igennem fluorescensmikroskopi eller kvantitative data via flowcytometri med i det væsentlige de samme reagenser. Når det kombineres med immunfluorescensfarvning for virale antigener, denne metode giver også forskeren at skelne smittet fra inficerede celler.
Det er vigtigt at bemærke, at denne metode også etiketter nyligt syntetiserede RNA i samme tempo, som det mærker vært udskrifter en ulempe, som deles med andre metoder afhængige 3H-uridin eller Bru inkorporering. I det mindste i tilfælde af RVFV MP-12-infektion, har vi imidlertid fundet, at amoUNT af værts transkripter langt opvejer den mængde af virale transkripter, og dermed indflydelse viralt RNA på total RNA målt ved dette assay er ubetydelig. Når tilpasning denne protokol til brug med et andet virus, kan forskerne ønsker at identificere virustranskripter enten gennem deres lokalisering, gennem behandling af inficerede celler med ActD, eller selv fluorescerende in situ-hybridisering (FISH) 15. Hvis virusset replikerer i cytoplasma, såsom MP-12, så viralt RNA kan let skelnes fra cellulært RNA, som stadig hovedsagelig indeholdt i kernen efter 1 time af mærkning. Inficerede celler kan også behandles med ActD at undertrykke værtscelle transkription mens viral RNA-syntese upåvirket. ActD funktioner ved binding til dobbeltstrengede DNA 16 og derfor kun inhiberer dna-afhængig transskription, men har ingen effekt på viral RNA-afhængige RNA-polymeraser.
Når du udfører denne protokol, er det vigtigt at undgåforurening med nukleaser mellem permeabiliseringen og klik mærkning reaktion, som EU mærkede RNA stadig følsom over for nedbrydning af RNaser 3.. Endvidere bør forskerne øjeblikkeligt går til klik mærkning reaktion, som længere inkuberingstider mellem fiksering og klik mærkning reaktion, selv ved 4 ° C, føre til nedbrydning af RNA og i sidste ende resultere i et tab af RNA fluorescenssignal. Dette er af særlig bekymring, når du udfører tidsforløbet eksperimenter, forskere bør udforme deres eksperimenter, så alle celler kan mærkes, fikseret og farvet på samme tid. Heldigvis RNA fluorescenssignal forbliver stabil efter klikket mærkning reaktion, så protokollen kan nemt blive stoppet efter dette trin.
Endelig forskerne nødt til at holde for øje, at cytopatisk effekt (CPE), forårsaget af mange vira negativt påvirker cellulær RNA-syntese selv i mangel af en særlig transkriptionel undertrykkelse. Deter derfor vigtigt at måle transkriptionel aktivitet på et tidspunkt efter infektion, når cellerne er stadig levedygtige. Hvis en mutantvirus er tilgængelig som mangler evnen til at undertrykke transkription, såsom RMP-12-C13type (figur 1 og 3), kan dette være et godt værktøj til at bestemme det optimale tidspunkt for måling transkription.
Når man planlægger et stort antal forsøg, kan forskerne ønsker at overveje direkte mærkning af deres primære antistof med en fluorochrom 17, hvorved behovet for et sekundært antistof og reducere den tid, der kræves til påvisning af virale antigener.
Sammenfattende tilvejebringer denne protokol en hurtig og pålidelig måde at måle effekten af virusinfektion på værtscelle transkription. Det kan nemt tilpasses til brug med forskellige virus, og har potentiale til at blive ændret til at omfatte immunostainings for specifikke virale eller cellulære proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi takker RB Tesh for at levere musen polyklonale anti-RVFV antiserum og M. Griffin i UTMB Flowcytometri Core Facility for hjælp med flowcytometri. Dette arbejde blev støttet af 5 U54 AI057156 gennem det vestlige Regional Center of Excellence, NIH tilskud R01 AI08764301, og finansiering fra Sealy Center for Vaccine Development hos UTMB.BK blev støttet af James W. McLaughlin Fellowship Fund på UTMB.OL blev støttet af en Maurice R. Hilleman Early-Stage Career Investigator Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-ethynyl-uridine | Berry Associates | PY 7563 | dissolve in DMSO for 100 mM stock |
| 12-mm round coverslips | Fisherbrand | 12-545-82 | |
| 5 ml polystyrene tubes | BD Biosciences | 352058 | |
| Actinomycin D (ActD) | Sigma | 9415 | dissolve in DMSO for 10 mM stock |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A-11029 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz | sc-2323 | |
| CuSO4 | Sigma | C-8027 | dissolve in H2O for 100 mM stock |
| DAPI | Sigma | D-9542 | dissolve in H2O for 5 mg/ml stock |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | |
| fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled) | Invitrogen | A10270 | |
| fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled) | Invitrogen | A10277 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A-5960 | dissolve in H2O for 500 mM |
| paper filter | VWRbrand | 28333-087 | |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| poly-L-lysine (MW ≥ 70000) | Sigma | P1274 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Trizma base | Sigma | T-1503 | dissolve in H2O for 1.5 M stock, pH 8.5 |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| Fluorescence Microscope | e.g. Olympus IX71 | ||
| Flow Cytometer | e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa |
References
- Fakan, S. Structural support for RNA synthesis in the cell nucleus. Methods Achiev. Exp. Pathol. 12, 105-140 (1986).
- Jensen, P. O., Larsen, J., Christiansen, J., Larsen, J. K. Flow cytometric measurement of RNA synthesis using bromouridine labelling and bromodeoxyuridine antibodies. Cytometry. 14, 455-458 (1993).
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 15779-15784 (2008).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 41, 2596-2599 (2002).
- Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).
- Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. NSs protein of rift valley fever virus promotes posttranslational downregulation of the TFIIH subunit p62. J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).
- Kalveram, B., et al. Rift Valley fever virus NSs inhibits host transcription independently of the degradation of dsRNA-dependent protein kinase PKR. Virology. , (2012).
- Head, J. A., Kalveram, B., Ikegami, T. Functional analysis of Rift Valley fever virus NSs encoding a partial truncation. PLoS One. 7, e45730 (2012).
- Lihoradova, O. A., et al. Characterization of Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain Encoding NSs of Punta Toro Virus or Sandfly Fever Sicilian Virus. PLoS Negl Trop Dis. 7, e2181 (2013).
- Kalveram, B., Ikegami, T. Toscana Virus NSs Protein Promotes Degradation of Double-Stranded RNA-Dependent Protein Kinase. J. Virol. , (2013).
- Schmaljohn, C., Nichol, S. In Fields Virology. Knipe, D. M., et al. , Lippincott Williams and Wilkins. 1741-1789 (2007).
- Le May, N., et al. TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus. Cell. 116, 541-550 (2004).
- Caplen, H., Peters, C. J., Bishop, D. H. Mutagen-directed attenuation of Rift Valley fever virus as a method for vaccine development. J. Gen. Virol. 66, 2271-2277 (1985).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious Rift Valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene. J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).
- Vyboh, K., Ajamian, L., Mouland, A. J. Detection of viral RNA by fluorescence in situ hybridization (FISH). J. Vis. Exp. , e4002 (2012).
- Reich, E., Goldberg, I. H.
- Holmes, K. L., Lantz, L. M., Russ, W. Conjugation of fluorochromes to monoclonal antibodies. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 4 (Unit 4 2), (2001).
