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Biology

में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की पहचान Published: December 5, 2013 doi: 10.3791/50968
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Neuroscience Center of Excellence, Louisiana State University Health Sciences Center

Summary

ड्रोसोफिला लेकिन नहीं में गहराई से जैव रासायनिक विश्लेषण की इसकी उपयुक्तता के लिए, अपने शक्तिशाली आनुवंशिक हेरफेर के लिए प्रसिद्ध है. यहाँ हम मक्खी दिमाग से ब्याज की किसी भी प्रोटीन की बातचीत के भागीदारों की पहचान करने के लिए एक नल आधारित प्रक्रिया मौजूद है. यह प्रक्रिया संभावित अनुसंधान के नए रास्ते के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.

Abstract

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर (फल मक्खी) का उपयोग किया जेनेटिक स्क्रीन जैविक विज्ञान के अग्रिम में कई मील का पत्थर खोजों बना दिया है. हालांकि, आनुवांशिक विश्लेषण से प्राप्त ज्ञान का विस्तार करने के उद्देश्य से जैव रासायनिक स्क्रीन का उपयोग केवल हाल ही में पता लगाया था. यहाँ हम प्रोटीन जटिल शुद्ध करने के लिए एक विधि का वर्णन है कि वयस्क मक्खी सिर से ब्याज की किसी भी प्रोटीन के साथ एसोसिएट्स. इस विधि vivo में मक्खी न्यूरॉन्स में मिलकर एक आत्मीयता शुद्धि (नल) टैग के साथ जुड़े हुए चारा प्रोटीन व्यक्त करने के लिए ड्रोसोफिला Gal4/UAS प्रणाली का लाभ लेता है, और फिर मूल रूप में स्थापित करने के लिए एक समान एक नल प्रक्रिया का उपयोग कर शुद्धि के दो दौर लागू करता है बातचीत के दौरान प्रोटीन जटिल शुद्ध करने के लिए खमीर 1. इस प्रक्रिया के अंत में, कई प्रोटीन परिसरों का एक मिश्रण जिसका आणविक पहचान मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा निर्धारित किया जा सकता प्राप्त की है. उम्मीदवार प्रोटीन की मान्यता आर से लाभ होगाesource और मक्खियों में नुकसान के समारोह पढ़ाई प्रदर्शन करने में आसानी. समान दृष्टिकोण अन्य मक्खी ऊतकों को लागू किया जा सकता है. हम उड़ मॉडल प्रणाली में आनुवंशिक जोड़तोड़ और इस प्रोटिओमिक दृष्टिकोण के संयोजन तंत्रिका जीव विज्ञान के क्षेत्र में और परे मूलभूत समस्याओं से निपटने के लिए जबरदस्त क्षमता रखती है कि विश्वास करते हैं.

Introduction

एक विशेष जैविक प्रक्रिया मध्यस्थता आणविक मार्ग है कि या नेटवर्क को परिभाषित करने के लिए जैव चिकित्सा अनुसंधान का अंतिम लक्ष्य होता है. फ्लाई जेनेटिकविदों विशेष रूप से साथ समानांतर में, एक साथ काम करते हैं, या नदी के ऊपर या ब्याज की एक जीन के बहाव के कारकों की पहचान करने के लिए, आनुवंशिक स्क्रीन (बढ़ाने और शमन स्क्रीन दोनों) संशोधक, आगे आनुवंशिकी पर भारी निर्भर है. हालांकि, आगे आनुवंशिकी स्क्रीन अक्सर बार जब उत्परिवर्तित, जिसका नुकसान समारोह के ही स्कोर करने के लिए मेहनत कर रहे हैं कि सूक्ष्म दोष उत्पन्न कार्यात्मक अतिरेक और मुआवजे के साथ प्रारंभिक विकास चरणों में मारक, या जीन के कारण है, जो आवश्यक जीन की पहचान करने में विफल. इस कठिनाई को दूर करने के लिए एक तरह से प्रत्यक्ष प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के लिए स्क्रीन है. एक दशक से अधिक के लिए, आदि खमीर दो संकर, फेज प्रदर्शन, रासायनिक पार से जोड़ने, सह आईपी मिलकर संबंध शुद्धीकरण (नल), सहित जैव रासायनिक विधियों, की बढ़ती सूची. प्रोटीन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैप्रोटीन बातचीत. इन तरीकों में से प्रत्येक शक्तियों और संवेदनशीलता और विशिष्टता के लिए संबंध में कमजोरियों का अपना स्थापित किया है. उनमें से, नल विधि, लगभग शारीरिक शर्तों के तहत शारीरिक संपर्क का पता लगाने के लिए अनुमति देता है विशिष्टता और स्थिरता 2 को बरकरार रखता है और 3,4 विश्लेषण करती उच्च throughput के लिए विस्तार करने की क्षमता भी शामिल है.

नल विधि मूल रूप से Rigautand सहयोगियों 1 द्वारा खमीर में विकसित किया गया था. इस विधि में, ब्याज की एक प्रोटीन एक नल टैग के साथ व्यक्त किया है. एक प्रोटीन आईजीजी को बांधता है कि एक डोमेन और एक calmodulin बाध्यकारी डोमेन: नल टैग दो स्वतंत्र आत्मीयता बाध्यकारी डोमेन बंदरगाहों. दो डोमेन एक TEV (तंबाकू नक़्क़ाशी वायरस) दरार साइट से अलग होती है. आत्मीयता purifications के दो स्वतंत्र राउंड पर्याप्त अविशिष्ट बंधनों को कम करने और विशिष्ट बाइंडिंग 1 को समृद्ध करने के लिए इस तरह के एक संयोजन की अनुमति देता है. इस उदाहरण के लिए, नल विधि एक बहुत शक्तिशाली metho हैएक्सोजेनस प्रोटीन overexpressing सामान्य रूप से अपने अंतर्जात समकक्ष के साथ जटिल नहीं है कि प्रोटीन के साथ संबद्ध करने के लिए इसे और अधिक खतरा बना सकता है, किसी दिए गए प्रोटीन की विवो बातचीत में पहचान करने के लिए डी. इसके विकास के बाद से, नल विधि सेल संस्कृति आधारित प्रणालियों 5,6 और अन्य में vivo मॉडल प्रणाली 6-9 सहित कई अन्य प्रणालियों, में लागू किया गया है. यहाँ हम ड्रोसोफिला में नल विधि का अनुकूलन का वर्णन. हम पहले ब्याज की जीन के एन या सी टर्मिनल या तो नल टैग की क्लोनिंग और फ्यूजन की सुविधा के लिए pUAST-NTAP और pUAST-CTAP वैक्टर उत्पन्न करते हैं. यूएएस नल टैग transgene तो एक neuronal GAL4 ड्राइवर 10 के नियंत्रण में तंत्रिका तंत्र में व्यक्त किया है. अगला, वयस्क मक्खी प्रमुखों की एक बड़ी संख्या में तंत्रिका कोशिकाओं के उच्च सामग्री है और आकार अंतर के आधार पर ठंड के बाद शरीर के अन्य भागों से अलग करने के लिए आसान कर रहे हैं, जो एकत्र किया जाएगा. वयस्क सिर homogenized और मंजूरी दे दी हैं खY अनुक्रमिक centrifugations, और सतह पर तैरनेवाला नीचे वर्णित एक नल प्रक्रिया के अधीन है.

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Protocol

1. यूएएस नल टैग ट्रांसजेनिक मक्खियों उत्पन्न

  1. PUAST नल टैग डीएनए निर्माणों उत्पन्न करें.
    1. (एन या सी टर्मिनस) चारा प्रोटीन का नल टैग प्रोटीन की संरचना / समारोह पर आधारित है, के लिए जुड़े हुए किया जाना चाहिए जो पक्ष पर फैसला किया है. अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें.
    2. क्रमशः, एन या सी टर्मिनल टैग यूएएस नल transgenes उत्पन्न करने के लिए pUAST-NTAP या pUAST-CTAP वैक्टर के कई क्लोनिंग साइटों (एमसीएस) में ब्याज की जीन की सीडीएनए कोडिंग क्षेत्र Subclone. विस्तृत नक्शे और प्रयोग करने योग्य प्रतिबंध साइटों और पढ़ने फ्रेम के लिए चित्रा 1 देखें.
  2. यूएएस नल टैग ट्रांसजेनिक मक्खियों उत्पन्न करें.
    1. पी तत्व की मध्यस्थता प्रविष्टि 11 का उपयोग कर मानक प्रोटोकॉल का पालन ट्रांसजेनिक मक्खियों उत्पन्न करें. इंजेक्शन सेवाओं की एक संख्या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं.
    2. प्रत्येक व्यक्ति ट्रांसजेनिक लाइन के लिए neuronal GAL4 ड्राइवर (यानी BG380-GAL4) क्रॉस और प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर का निर्धारणपश्चिमी (Peroxidase विरोधी Peroxidase एंटीबॉडी के साथ) धब्बा और / या (एंटी नल एंटीबॉडी के साथ) immunostaining के द्वारा प्रत्येक पंक्ति की. सामान्य में, अंतर्जात प्रोटीन के करीब है कि एक प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर के साथ एक ट्रांसजेनिक लाइन नल प्रक्रियाओं के लिए सिफारिश की है. अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें.
    3. ब्याज की जीन के नुकसान के समारोह म्यूटेंट उपलब्ध हैं यदि नल टैग transgenes की कार्यक्षमता की पुष्टि करने के लिए बचाव प्रयोगों PerformGAL4/UAS-based. काफी निम्नलिखित नल प्रयोगों के लिए उत्परिवर्ती phenotypes बचाव कर सकते हैं कि एक transgene चुनें.

2. नल प्रक्रिया के लिए नमूने तैयार

  1. एक neuronal GAL4 ड्राइवर (जैसे BG380-Gal4) और मक्खी नमूने के विस्तार को कम करने के क्रम में चुना नल टैग transgene दोनों वहन करती है कि एक मक्खी शेयर उत्पन्न करें. GAL4 ड्राइवर और ऊपर संयोजन अस्तित्व और विकास के नुकसान का कारण बनता है जब दुर्लभ मामलों में यूएएस transgene पार की F1 progenies लीजिए. </ ली>
  2. छोटे पैमाने के नमूने लेने और टैप टैग प्रोटीन solubilizing के लिए सेल हालत अनुकूलन.
    1. Nonionic डिटर्जेंट एनपी 40 (0.1-1%), NaDOC (0.1-1%) और ट्राइटन X-100 (0.05-0.5%) के संयोजन का उपयोग सेल बफ़र्स की एक श्रृंखला बनाने. अधिक जानकारी के लिए 1 टेबल और चर्चा देखें.
    2. एक सीओ 2 पैड के शीर्ष पर, मक्खियों व्यक्त नल transgene से 20 वयस्क सिर काटना और प्रत्येक lysis बफर हालत का परीक्षण करने के लिए एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में उन्हें इकट्ठा करने के लिए # 5 संदंश का उपयोग करें.
    3. ट्यूब को 100 उल परीक्षण lysis बफर जोड़ें और एक और 100 उल परीक्षण बफर जोड़ने तो, ऊपर पथपाकर द्वारा और एक प्लास्टिक मूसल के साथ नीचे सिर homogenize.
    4. 10 मिनट (4 डिग्री सेल्सियस) के लिए 21,500 XG पर सिर lysate स्पिन, और centrifugation के बाद सतह पर तैरनेवाला और गोली अलग. क्रमशः सतह पर तैरनेवाला के 30 उल करने के लिए गोली और 10 उल 4x एसडीएस लदान बफर करने के लिए 25 उल 2x एसडीएस लदान बफर जोड़ें.
    5. 5 मिनट के लिए दो नमूने उबाल लें और पक्ष द्वारा उन्हें विश्लेषणसाइड पीएपी एंटीबॉडी के साथ एसडीएस पृष्ठ और बाद वेस्टर्न ब्लाट का उपयोग कर. गोली बनाम सतह पर तैरनेवाला में नल प्रोटीन के स्तर के अनुपात से विलेयता निर्धारित करते हैं.
  3. बड़े पैमाने में नमूना तैयार
    1. विस्तार और वयस्क मक्खियों इकट्ठा.
      1. बोतलों में neuronal-GAL4/UAS-TAP-transgene शेयर विस्तार और संचयी 250 बोतलें तक हर 3 दिन के संग्रह के लिए उपयोग किया जाता है बोतलें फ्लिप.
      2. लीजिए 1-3 दिन पुरानी वयस्क 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में मक्खियों, तुरंत गहरी फ्रीज मक्खियों को तरल नाइट्रोजन में ट्यूब डाल दिया. एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में मक्खियों की दुकान. मक्खियों की मात्रा 50 मिलीग्राम ट्यूब के 2/3 से अधिक नहीं होना चाहिए ध्यान दें.
    2. (पाउडर सूखी बर्फ की चोटी पर इस चरण पर कार्यवाई) मक्खी सिर ले लीजिए.
      1. Prechilled sieves और -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से मोर्टार और मूसल बाहर ले जाओ और आदर्श एक बड़े बर्फ बाल्टी के अंदर, सूखी बर्फ पर डाल दिया. वें पर एक नहीं, 25 के साथ दो संयुक्त राज्य अमेरिका मानक परीक्षण sieves ढेरई ऊपर और नीचे नहीं 40.
      2. जमे हुए मक्खियों बाहर ले जाओ और उन्हें तरल नाइट्रोजन में ड्रॉप और के बारे में 10 मिनट के लिए वहाँ में मक्खियों रखना. भंवर या शरीर से सिर, पैर, और पंखों को तोड़ने के लिए सख्ती ट्यूब हिला.
      3. शीर्ष चलनी के लिए मिश्रण डालो, और एक साथ दोनों चलनी दबाए हुए तो सख्ती चलनी हिला. Sieving के बाद, निकायों, शीर्ष चलनी पर रहने सिर नीचे चलनी पर बनाए रखा जाएगा मक्खी, और पैर, पंख, और अन्य मलबे सूखी बर्फ गिर जाएगी होगा. दो चलनी अलग करें और ध्यान से ठंड मोर्टार के लिए उड़ान भरने सिर हस्तांतरण.
    3. मक्खी सिर homogenize
      1. सूखी बर्फ के शीर्ष पर, बर्फ पर prechilled किया गया था कि एक 15 मिलीलीटर कांच Dounce ऊतक चक्की पाउडर हस्तांतरण तो, ख़स्ता कणों को मोर्टार और मूसल के साथ सिर पीस.
      2. सिर नमूना इसे में डाल दिया गया था और इससे पहले के बाद चक्की का वजन को मापने, और फिर कितना सिर samp गणनाLe वजन का होता है. मक्खी सिर की 6-15 ग्राम की कुल प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर के हिसाब से एडजस्ट प्रत्येक नल प्रयोग के लिए पर्याप्त होगा. मूसल ऊपर और नीचे करने के लिए यह आसान है जब तक पाउडर को ठंडा homogenization बफर के 15 मिलीलीटर (2.2 कदम में अनुकूलित lysis बफर) जोड़ें और फिर बड़ी निकासी मूसल के साथ स्ट्रोक. हर समय बर्फ पर कांच की चक्की रखें.
    4. नल के लिए सतह पर तैरनेवाला तैयार करें
      1. ~ 50,000 XG (4 डिग्री सेल्सियस) पर 20 मिनट के लिए एक उच्च गति अपकेंद्रित्र ट्यूब और स्पिन के लिए homogenate स्थानांतरण. एक नए उच्च गति अपकेंद्रित्र ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला और centrifugation एक और बार दोहराएँ.
      2. Ultracentrifuge एक ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला और आगे सतह पर तैरनेवाला खाली करने के लिए एक 40 मिनट ~ 250,000 XG स्पिन प्रदर्शन करते हैं. सतह पर तैरनेवाला ultracentrifugation के बाद मिलकर आत्मीयता शोधन प्रक्रियाओं के लिए तैयार है.

3. नल शोधन निम्न वर्गों Seraphin प्रयोगशाला नल से प्राप्त किए गए protocol 12 (http://web.as.uky.edu/Biology/faculty/rymond/BIO%20510/Bertran%20Seraphin%27s%20TAP%20page.pdf )

  1. आईजीजी मनका संबंध शुद्धीकरण प्रदर्शन करना
    1. नमूने centrifuged किया जा रहा है, जबकि आईजीजी sepharose मोती तैयार करें. 10 मिलीलीटर ठंड आईजीजी धोने बफर के साथ एक 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में 400 μl आईजीजी मनका 3x धो लें. प्रत्येक धोने के लिए, 2 मिनट के लिए धीरे ट्यूब रॉक, और फिर एक और 2 मिनट के लिए 1000 XG पर मोतियों नीचे स्पिन. तीसरे धोने के अंत में, बफर हटाने और ट्यूब में केवल मोती छोड़ दें.
    2. ध्यान आईजीजी मोती युक्त 15 मिलीलीटर ट्यूब में मंजूरी दे दी सतह पर तैरनेवाला (~ 15 मिलीलीटर) हस्तांतरण. 2 घंटे के लिए एक nutator पर 4 डिग्री सेल्सियस पर माला और मस्तिष्क lysate मिश्रण सेते हैं.
    3. ठंडे कमरे में लगभग 15 मिलीलीटर कुल मात्रा के साथ एक साफ और खाली सूक्ष्म स्तंभ की स्थापना की. तेजी से स्तंभ में मिश्रण गिरने से आईजीजी मनका मिश्रण लोड, किसी भी फंसाने के लिए नहीं की कोशिशहवा स्तंभ के अंदर बुलबुले. मोती धीरे धीरे गुरुत्वाकर्षण प्रवाह द्वारा निकास के लिए स्तंभ और बफर में बसने की अनुमति दें.
    4. मस्तिष्क lysate के सभी बसे आईजीजी स्तंभ के माध्यम से प्रवाहित होने के बाद ठंड आईजीजी धोने बफर के 10 एमएल के साथ अच्छी तरह से स्तंभ धो लें. धोने 2x दोहराएँ. नोट: हवा में मनका सूखी हैं कभी नहीं.
  2. TEV दरार प्रदर्शन करना
    1. तीसरे धोने के बाद, 10 मिलीलीटर TEV दरार बफर के साथ फिर से स्तंभ धो लो. यह कदम TEV दरार के लिए चारा जटिल sequestrates कि आईजीजी मनका तैयार करता है.
    2. TEV बफर के अंतिम ड्रॉप, बाहर ड्रिप प्रवाह को ब्लॉक करने के लिए स्तंभ के नीचे एक टोपी डाल, स्तंभ को TEV एंजाइम की 130 इकाइयों युक्त 1.3 मिलीलीटर TEV बफर जोड़ने, और फिर सुरक्षित रूप से शीर्ष टोपी के बारे में सही से पहले स्तंभ. स्तंभ दोनों सिरों पर अच्छी तरह से सील कर दिया जाता है सुनिश्चित करें.
    3. TEV एंजाइम TEV साइट पर पेप्टाइड फोड़ना और प्रोटीन जटिल whi जारी करने के लिए अनुमति देने के लिए 2 घंटे के लिए 18 डिग्री सेल्सियस पर स्तंभ घुमाएँLe प्रोटीन पीछे आईजीजी sepharose मोतियों के लिए बाध्य डोमेन पेप्टाइड छोड़ने.
  3. Calmodulin मनका संबंध शुद्धीकरण प्रदर्शन करना
    1. आईजीजी मोती TEV एंजाइम के साथ incubated हैं जबकि Calmodulin मोती तैयार. बफर बंधन ठंड Calmodulin के 10 एमएल के साथ, एक 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब 3x में हर बार 200 μl Calmodulin मोती धो लें. प्रत्येक धोने के लिए, धीरे से एक nutator पर 2 मिनट के लिए ट्यूब रॉक, और फिर 2 मिनट के लिए 1000 XG पर मोतियों नीचे स्पिन. तीसरे धोने के अंत में, सभी बफर बाहर ले और ट्यूब में केवल मोती छोड़ दें.
    2. TEV ऊष्मायन (कदम 3.2.3) के अंत में, वापस ठंड के कमरे में आईजीजी स्तंभ लौट सकते हैं और सीधे सेट. मोती 10 मिनट के लिए व्यवस्थित करते हैं.
    3. शीर्ष टोपी और फिर नीचे टोपी निकालें, और उसके बाद एक 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में 1.3 मिलीलीटर TEV दरार उत्पाद इकट्ठा. बफर पूरी तरह से नाली हैं. स्तंभ की मृत मात्रा बाहर धक्का स्तंभ के लिए एक अतिरिक्त 200 μl TEV बफर जोड़ें, एफ इकट्ठाएक ही ट्यूब में कम बाहर.
    4. ऊपर एकत्र 1.5 मिलीलीटर TEV दरार उत्पाद के लिए बफर और 4.5 μl एम 1 2 CaCl बाध्यकारी Calmodulin के 4.5 मिलीलीटर जोड़ें. 2 CaCl TEV बफर में EDTA टाइट्रेट लिए कार्य करता है. Calmodulin मोती युक्त ट्यूब को 6 मिलीग्राम मिश्रण स्थानांतरण और 1 घंटे के लिए एक nutator पर 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब बारी बारी से.
    5. ठंडे कमरे में लगभग 10 मिलीलीटर कुल मात्रा के साथ एक और साफ और खाली सूक्ष्म स्तंभ की स्थापना की. कॉलम को Calmodulin मनका मिश्रण लोड और इसे गंभीरता से पलायन करने की अनुमति देते हैं.
    6. सभी समाधान बसे Calmodulin स्तंभ के माध्यम से बह गया है, बफर बंधन ठंड Calmodulin के 10 एमएल के साथ स्तंभ दो बार, प्रत्येक धोने. नोट: Calmodulin मोती परेशान करने से बचने और धोने के दौरान यथासंभव फ्लैट मोतियों की सतह रखने की कोशिश.
  4. Calmodulin स्तंभ से चारा जटिल Elute.
    राइट धोने के बाद, 200 μl ठंड Calmodu के पांच भागों के साथ Calmodulin स्तंभ eluteलिन क्षालन बफर. प्रत्येक अंश के लिए, धीरे स्तंभ को क्षालन बफर के 200 μl जोड़ने और एक चिह्नित 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब के साथ eluate इकट्ठा. इस 4x दोहराएँ.
  5. एसडीएस पृष्ठ से प्रोटीन जटिल विश्लेषण
    1. पाँच भिन्न (लगभग 30 μl) में से प्रत्येक से एक छोटे से विभाज्य ले लो और एसडीएस लदान बफर जोड़ें. 5 मिनट के लिए नमूने उबाल लें और एक ढाल (4-15%) एसडीएस पृष्ठ जेल में प्रोटीन आणविक मार्कर के साथ नमूने पक्ष द्वारा साइड लोड.
    2. नमूने पूरी तरह से जेल में हल करने के बाद, वैद्युतकणसंचलन रोकने के लिए और इस तरह 13 धुंधला 'ब्लू चांदी' के रूप में किसी भी जी-250-आधारित संवेदनशील कोलाइडयन Coomassie धुंधला प्रक्रियाओं के साथ जेल दाग. यह बाद में मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के साथ पूरी तरह से संगत नहीं है क्योंकि चांदी धुंधला बेहतर वैकल्पिक लेकिन नहीं है. इस तरह शुद्ध प्रोटीन परिसर के आणविक पहचान को उजागर करने के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री के रूप में आगे के विश्लेषण के लिए एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में eluate के बाकी स्टोर. एसईई चर्चा.

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Representative Results

यहाँ हम मक्खी के मस्तिष्क में Highwire बातचीत प्रोटीन की पहचान करने में हमारे प्रयास प्रदर्शित करता है. Highwire (HIW) और उसके कशेरुकी और अकशेरुकी homologues तंत्रिका तंत्र 14 के विकास और मरम्मत कि विनियमित विशाल ubiquitin ligases हैं. वे अत्यधिक संरक्षित कार्यात्मक डोमेन के एक नंबर का हिस्सा. हालांकि, उनके आणविक कार्रवाई पूरी तरह से स्पष्ट नहीं हैं. कृमि में किए गए कार्य, मक्खी और माउस मौजूदा काम कर मॉडल के लिए नेतृत्व कि एक E3 ligase के रूप में और के माध्यम से समय और सेल प्रकार विशिष्ट neuronal कार्यों को नियंत्रित करता है जो एक बहु सबयूनिट ubiquitination जटिल, के गठन की सुविधा के लिए एक मचान प्रोटीन के रूप में HIW कार्यों विभिन्न cofactors के साथ बातचीत और विभिन्न ubiquitin substrates को निशाना बनाने का संयोजन. HIW जुड़े ubiquitination परिसर की पहचान करने के लिए, हम पहले HIW उत्परिवर्ती phenotype 15 लोगों को बचाने में पूरी तरह कार्यात्मक है कि एक एन टर्मिनल में चिह्नित यूएएस नल HIW transgene उत्पन्न. वयस्क FL के बारे में 10 ग्रामकेवल नल या नल HIW ट्रांसजेनिक प्रोटीन व्यक्त कि y सिर एकत्र की है और जैसा कि ऊपर वर्णित पक्ष द्वारा नल प्रक्रियाओं पक्ष के अधीन थे. दोनों purifications से अंतिम eluates एसडीएस पृष्ठ और फिर चांदी धुंधला द्वारा विश्लेषण किया गया. मास स्पेक्ट्रोमेट्री ड्रोसोफिला FSN (DFsn, एक एफ बॉक्स प्रोटीन) और Rae1 (चित्रा 2) सहित, केवल नल HIW नमूने में प्रोटीन की एक सूची की पहचान की. बाद में आनुवंशिक और जैव रासायनिक विश्लेषण HIW और DFsn synaptic संरचना और समारोह 16 को विनियमित करने के एससीएफ तरह E3 ubiquitin ligase परिसर के रूप में एक साथ काम करने से पता चला कि, और इन विवो में HIW साथ Rae1 एसोसिएट्स और synaptic अतिवृद्धि 17 restrains. Rae1 का यह कार्य कम से कम आंशिक रूप से चुनिंदा synaptic विकास 17 के दौरान HIW प्रोटीन बहुतायत है कि नियंत्रण एक उपन्यास तंत्र का पता चलता है जो autophagic गिरावट, से HIW की रक्षा के माध्यम से HIW प्रोटीन स्थिरता को बढ़ावा देने के लिए अपनी क्षमता से हासिल की है.


चित्रा 1. नल टैग ट्रांसजेनिक मक्खियों पैदा करने के लिए वैक्टर. (ए) pUAST-NTAP के नक्शे का निर्माण. (बी) pUAST-CTAP के नक्शे का निर्माण. दोनों निर्माणों में कई क्लोनिंग साइटों (एमसीएस) एकल कटौती प्रतिबंध साइटों लाल रंग के साथ प्रस्तुत कर रहे हैं, जहां एक वर्ग, के साथ चिह्नित हैं. (सी) नल टैग के पढ़ने के फ्रेम के साथ नल वैक्टर के कई क्लोनिंग साइटों दिखा प्राथमिक अनुक्रम. PUAST-NTAP एक और pUAST-NTAP 2: subcloning की सुविधा के लिए, दो और NTAP निर्माणों मूल pUAST-NTAP से उत्पन्न कर रहे हैं. एक साथ तीन NTAP एमसीएस के उपयोग को समायोजित करने के लिए सभी तीन संभव पढ़ने फ्रेम को शामिल किया गया निर्माण करती है. सभी वैक्टर मूल रूप में उत्पन्न NTAP या CTAP टुकड़े का उपयोग कर निर्माण कर रहे हैंSeraphin लैब 1. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
. नल शुद्धि से मक्खी दिमाग से Highwire बातचीत प्रोटीन की चित्रा 2 शुद्धीकरण नल व्यक्त मक्खियों से वयस्क सिर. तंत्रिका तंत्र में (BG380-GAL4; यूएएस नल) या नल HIW (यूएएस नल HIW BG380-GAL4) क्रमशः,, एकत्र homogenized, और नल शुद्धि के अधीन हैं. अंतिम eluates चांदी धुंधला द्वारा पीछा किया एक आयामी एसडीएस पृष्ठ जेल से विश्लेषण किया गया. तीर सिर चारा प्रोटीन HIW इंगित करता है और तारांकन दरार TeV की वजह से एक छोटा नल प्रोटीन इंगित करता है. नल HIW नमूने में प्रोटीन की एक सूची जन द्वारा पहचाने जाते हैंHSC-70, β-ट्यूबिलिन, Rae1 और DFsn (तीर द्वारा संकेत) सहित स्पेक्ट्रोमेट्री,. यह आंकड़ा तिआन एट अल. 17 की चित्रा 1 ए से संशोधित किया गया है बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

<टीडी>
बफर रचना टिप्पणियां
Lysis बफर 50 मिमी Tris-एचसीएल 7.5 पीएच नोट: 1) डीटीटी और प्रोटीज और एंटीबॉडी inhibitors बस का उपयोग करने से पहले जोड़ें.
125 मिमी NaCl 2) यहाँ दिखा 0.5% NP40 साथ एक lysis बफर है. Nonionic डिटर्जेंट पर संशोधन के लिए चर्चा देखें.
5% ग्लिसरॉल
0.5% NP40
1.5 मिमी 2 MgCl
25 मिमी NAF
0.2 मिमी डीटीटी
(निम्नलिखित प्रोटीज और एंटीबॉडी inhibitors हैं)
1 मिमी ना 3 वीओ 4
0.05 मिमी एमजी-115
1 मिमी PMSF
Protease अवरोध मिश्रण (सिग्मा P8340)
Protease अवरोध कॉकटेल (रॉश 04693159001)
आईजीजी धोने बफर 10 मिमी Tris-सीएल पीएच 8.0 (0.5 मिलीलीटर एम शेयर 2 के)
150 मिमी NaCl (5 मीटर शेयर के 3 मिलीलीटर)
0.1% NP40 (10% शेयर के 1.0 मिलीलीटर)
एच 2 0 से 100 एमएल अंतिम
TEV दरार बफर 10 मिमी Tris-सीएल पीएच 8.0 (0.5 मिलीलीटर एम शेयर 2 के) टिप्पणी: उपयोग करने से पहले डीटीटी जोड़ें.
150 मिमी NaCl (5 मीटर शेयर के 3 मिलीलीटर)
0.1% NP40 (10% शेयर के 1.0 मिलीलीटर)
0.5 मिमी EDTA (0.5 एम शेयर के 100 μl)
1 मिमी डीटीटी (एम 1 शेयर के 100 μl)
एच 2 ओ से 100 एमएल अंतिम
Calmodulin बाध्यकारी बफर 10 मिमी β-mercaptoethanol (शेयर के 69.7 μl)
10 मिमी Tris-सीएल पीएच 8.0 (0.5 मिलीलीटर एम शेयर 2 के)
150 मिमी NaCl (5 मीटर शेयर के 3 मिलीलीटर)
1 मिमी मिलीग्राम एसीटेट (एम 1 शेयर के 100 μl)
1 मिमी imidazole (एम 1 शेयर के 100 μl)
2 मिमी 2 CaCl (एम 1 शेयर के 200 μl)
0.1% NP40 (10% शेयर के 1 मिलीलीटर)
एच 2 ओ से 100 एमएल अंतिम
Calmodulin क्षालन बफर 10 मिमी β-mercaptoethanol (शेयर के 69.7 μl)
10 मिमी Tris-सीएल पीएच 8.0 (0.5 मिलीलीटर एम शेयर 2 के)
150 मिमी NaCl (5 मीटर शेयर के 3 मिलीलीटर)
1 मिमी मिलीग्राम एसीटेट (एम 1 शेयर के 100 μl)
1 मिमी imidazole (एम 1 शेयर के 100 μl)
10 मिमी EGTA (0.5 एम स्टॉक के 2 मिलीलीटर)
0.1% NP40 (10% शेयर के 1 मिलीलीटर)
एच 2 ओ से 100 एमएल अंतिम

तालिका 1. बफ़र्स की संरचना है.

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Discussion

अग्रानुक्रम आत्मीयता शुद्धि (नल) विधि दो स्वतंत्र संबंध शुद्धीकरण कदम के माध्यम से अलगाव और प्रोटीन परिसरों के संवर्धन की अनुमति देता है कि एक दोहरी शुद्धि प्रोटोकॉल प्रदान करता है. नल टैग की डिजाइन इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत किया है क्या करने के लिए सीमित नहीं है बफर की स्थिति के अनुसार समायोजित कर रहे हैं, अन्य प्रोटीन बाध्यकारी डोमेन और रूपांकनों भी लागू कर रहे हैं. अन्य नल टैग का एक अच्छा उदाहरण जी एस नल टैग, एक जी प्रोटीन का एक संयोजन और सुसंस्कृत स्तनधारी सेल लाइनों 18 में शुद्ध प्रोटीन जटिल के उद्देश्य से गिउलिओ Superti-Furga समूह द्वारा बनाया गया एक streptavidin बाध्यकारी मूल भाव है. जी एस नल बाद ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं और भ्रूण 19 में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया गया था. बेली एट अल. द्वारा हाल ही में जौव प्रकाशन जी एस नल प्रक्रिया सेल संस्कृति lysate 20 के साथ प्रदर्शन किया गया था कि कैसे प्रदर्शन किया. यहाँ हम (ड्रोसोफिला तंत्रिका ऊतकों में नल टैग का उपयोग प्रस्तुत विज्ञापनबड़े पैमाने पर प्रोटिओमिक स्क्रीनिंग के लिए ULT सिर). इस प्रोटोकॉल संभवतः इस तरह के भ्रूण के रूप में बड़े पैमाने पर नमूना संग्रह की अनुमति है कि अन्य ऊतकों, के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. शीर्ष चलनी (कदम 2.3.2.3) पर एकत्र वयस्क शरीर भी एक बहुत ही चुनौतीपूर्ण काम हो सकता है, जो नल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. lysis बफर संशोधित और अधिक से अधिक पाचन तंत्र में मौजूद है और पहले शोधन प्रक्रिया में काफी proteases करने के लिए प्रोटीन का समय जोखिम को कम करने के क्रम में छोटा किया जा बड़े पैमाने पर proteases को बाधित करने के लिए वातानुकूलित किया जाना चाहिए. विभिन्न नल टैग अलग handlings और आत्मीयता purifications के लिए बफर स्थितियों की आवश्यकता है, नल के लिए सामान्य सिद्धांतों वही कर रहे हैं. हम नल परिणामों की गुणवत्ता को प्रभावित करेगा कि मामलों पर चर्चा के नीचे.

नल दृष्टिकोण की सफलता सही transgene पैदा करने पर निर्भर करता है. सबसे पहले, नल टैग ही इसकी क्षमता बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है जो चारा प्रोटीन के सम्पूर्ण रचना में परिवर्तन नहीं करना चाहिएअपनी शारीरिक बंधन भागीदारों के साथ बातचीत करने के लिए. इस प्रकार, यह जहां ब्याज की जीन के लिए टैप टैग फ्यूज करने के लिए तय करने के लिए महत्वपूर्ण है. निर्णय प्रोटीन की पिछले अध्ययनों, इसकी संरचना या कार्यात्मक epitode टैग transgenes के बारे में विशेष रूप से जानकारी के आधार पर बनाया जा सकता है. मामले में इस तरह की जानकारी समानांतर में एन या सी टर्मिनल पर चारा प्रोटीन टैगिंग, अनुपलब्ध है की सिफारिश की है. तब कार्यात्मक बचाव प्रयोगों में इस्तेमाल किया जाना चाहिए जो transgene निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है. दूसरा, ट्रांसजेनिक प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर अंतर्जात प्रोटीन के करीब होना चाहिए. Gal4/UAS प्रणाली सामान्य रूप से झूठी सकारात्मक वृद्धि या कारण हो सकता है जो या तो अंतर्जात प्रोटीन, की तुलना में अलग अलग समय पर और एक बहुत उच्च स्तर पर transgene की अभिव्यक्ति ड्राइव के रूप में यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है प्रोटीन बातचीत का प्रोफाइल बदल कि अप्रत्याशित परिणाम कोशिकाओं में नेटवर्क. उदाहरण के लिए, overexpressing मचान प्रोटीन caus सकता हैई प्रमुख नकारात्मक प्रभाव और ऐसे kinases के रूप में enzymatic गतिविधियों, कि अधिकारी overexpressing प्रोटीन, बार बार बदले में उन लोगों के साथ बातचीत करने के लिए उनके अंतर्जात बंधन भागीदारों की क्षमता को प्रभावित कर सकता है, जो दोनों के लाभ के समारोह प्रभाव, कारण. इस प्रकार, Gal4/UAS प्रणाली हित के जीन की अभिव्यक्ति के समय और स्तर केवल सामान्य परिस्थितियों में उपस्थित कि अंतर्जात बातचीत के संरक्षण के लिए महत्वपूर्ण है, जब से बचा जाना चाहिए. इसके बजाय, नल टैग transgene की अभिव्यक्ति का अपना प्रमोटर के तहत नियंत्रित किया जाना चाहिए. यह अंतर्जात प्रमोटर अनुक्रम साथ यूएएस अनुक्रम की जगह से या ब्याज 21 के जीन की पूरी स्थलों में शामिल है कि एक जीनोमिक डीएनए टुकड़ा में exonal अनुक्रम के साथ फ्रेम में नल अनुक्रम fusing द्वारा या तो हासिल किया जा सकता है. कुछ मामलों में, नल प्रयोग इंक के लिए अंतर्जात प्रोटीन से प्रतिस्पर्धा को कम करने के लिए ब्याज की जीन के समारोह उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि का एक नुकसान में किया जा सकता हैmultiprotein परिसरों में orporating. इस उदाहरण के लिए, एक प्रोटीन अशक्त पृष्ठभूमि, यदि उपलब्ध है, पूरी तरह से अंतर्जात प्रोटीन को खत्म करने के लिए आदर्श स्थिति प्रदान करता है. आनुवंशिक उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि का उपयोग हमेशा उच्च गुणवत्ता के साथ परिणाम प्राप्त होने की संभावना बढ़ जाएगी.

चारा प्रोटीन की विलेयता सफलता के लिए एक और महत्वपूर्ण कारक है. Nonionic डिटर्जेंट सामान्य रूप से प्लाज्मा झिल्ली भंग करने और मनोवैज्ञानिक वातावरण के करीब है कि एक स्थिति में घुलनशील और बरकरार प्रोटीन जटिल, बनाए रखने के लिए lysis बफर में उपयोग किया जाता है. हालांकि ब्याज की प्रोटीन झिल्ली से एकीकृत या प्रोटीन जुड़े हैं या नहीं, पर निर्भर करता है, nonionic डिटर्जेंट की संरचना और एकाग्रता चारा प्रोटीन solubilizing के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है. 0.1-0.3% NP40 साइटोसोलिक प्रोटीन solubilize को अक्सर पर्याप्त है. झिल्ली प्रोटीन के लिए, NP40 का एक संयोजन (0.1-1%), NaDOC (0.1-1%), और Triton एक्स 100 (0.05-0.5%) कभी कभी solubi के लिए आवश्यक हैLize और टैप प्रयोग के लिए पर्याप्त प्रोटीन समृद्ध. एक कड़े lysis बफर कमजोर प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत को बाधित करते हैं हालांकि, बाद से, एक संतुलन एक ही समय में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के बहुमत संरक्षित कर रहे हैं, जबकि पर्याप्त घुलनशील चारा प्रोटीन के नमूने में मौजूद हैं, जिनमें तक पहुँच जाने की जरूरत है. एक सामान्य सिद्धांत हमेशा सबसे कम एकाग्रता के साथ डिटर्जेंट के fewest प्रकार का उपयोग करने की कोशिश करता है.

समस्या निवारण की सुविधा के लिए, यह अत्यधिक दो purifications के हर कदम से नमूने के एक छोटे से विभाज्य बचाने के लिए सिफारिश की है. Aliquots पर बाद में एसडीएस पृष्ठ और प्रोटीन धुंधला / पश्चिमी विश्लेषण चारा प्रोटीन के स्तर को और खास प्रोटीन प्रजातियों की अनुक्रमिक संवर्धन नजर रखी जा करने की अनुमति. चारा प्रोटीन की अचानक कमी TEV दरार के बाद प्रवाह के बाहर (चरण 3.3.3) का विभाज्य में खोजा गया था अगर उदाहरण के लिए, यह चारा प्रोटीन आईजीजी मनका धोने (कदम 3.1.4) के दौरान खो गए थे कि संभावना है . एक possible कारण आईजीजी धोने बफर के अपर्याप्त डिटर्जेंट रचना हो सकती है. आईजीजी धोने बफर में डिटर्जेंट की संरचना और एकाग्रता पर एक तेज गिरावट (0.1% एनपी 40 केवल) lysis बफर की तुलना में है. चारा प्रोटीन इन परिवर्तनों के प्रति संवेदनशील हो और मोती पर आईजीजी आधा भाग से अलग हो सकता है. Lysis बफर के प्रति आईजीजी धोने समायोजित करना समस्या को सुलझाने में मदद कर सकते हैं. कम होने की संभावना है, हालांकि वैकल्पिक रूप से, TEV दरार (3.2 कदम) आईजीजी मोतियों से चारा युक्त जटिल जारी करने के लिए पर्याप्त काम नहीं हो सकता है. एक दूसरे के निरीक्षण के लायक कदम TEV बफर (कदम 3.2.1) और एंजाइम की गतिविधि के साथ आईजीजी मोतियों का संतुलन हैं, mishandling एंजाइम दबाना सकता है.

यहां तक ​​कि दो कदम शुद्धि के साथ, अभी भी अंतिम नल शुद्ध परिसर में nonspecifically उपस्थित नीचे खींच रहे हैं कि झूठी सकारात्मक और प्रोटीन नहीं होगा कि ध्यान में रखें. पर, उन अविशिष्ट बातचीत की पहचान करने के लिए एक ही रास्ता हैकम से कम आंशिक रूप से, नल शुद्धि प्रयोगों में नल टैग-transgene साथ समानांतर में नल केवल transgene का उपयोग कर एक नियंत्रण नल शामिल करने के लिए है. नल केवल प्रक्रिया में पहचान प्रोटीन नल transgene शुद्धि में पहचान की सूची से हटा दिया जाना चाहिए.

एक सफल नल संभावित vivo में ब्याज की प्रोटीन के साथ जुड़े रहे हैं कि प्रोटीन का एक मिश्रण शुद्ध होगा. अगले कदम के लिए इन प्रोटीनों की आणविक पहचान है, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री आमतौर पर इस उद्देश्य के लिए प्रयोग किया जाता है. एसडीएस पृष्ठ से परिणाम और प्रयोग की जरूरतों पर निर्भर करता है, शुद्ध प्रोटीन परिसर में आणविक पहचान निम्नलिखित दो तरीकों से निर्धारित किया जा सकता है: 1) प्रत्येक व्यक्ति प्रोटीन बैंड जेल से बाहर कटौती और एक कम करने के लिए अधीन किया जा सकता है जटिलता LC-MS/MS, या 2) शिखर प्रोटीन सामग्री (सामान्य रूप से दूसरे क्षालन) होता है कि Elute अंश सीधे मध्यम जटिलता LC-MS/MS के अधीन किया जा सकता है. इस तरह के एक शॉट गन पीroteomic दृष्टिकोण संभवतः एमएस उपकरण 22 के गतिशील रेंज पर निर्भर करता है, परिसर में सभी प्रोटीन की पहचान करेगा.

फल मक्खी - संक्षेप में, हम एक आनुवंशिक मॉडल जीव के तंत्रिका ऊतकों में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की पहचान करने के लिए एक तरीका मौजूद है. मक्खी के लिए टैप पद्धति लागू करने के फायदों में से एक नंबर रहे हैं: 1) फल मक्खियों एक छोटे जीवन चक्र है, तो यह अपेक्षाकृत जल्दी और ट्रांसजेनिक मक्खियों उत्पन्न करने के लिए और बड़ी मात्रा में ऊतकों को प्राप्त करना आसान है, दोनों नल के लिए महत्वपूर्ण हैं दृष्टिकोण, 2) मक्खी जीनोम पूरी तरह से एनोटेट और मानव रोग के कारण जीन का 70% होता है, और 3) सबसे महत्वपूर्ण बात, यह कार्यात्मक मान्य है और मक्खियों में प्रोटीन बातचीत के उम्मीदवार को चिह्नित करने के लिए आसान है. इस तरह के अध्ययन के लिए उपयोगी ट्रांसजेनिक आधारित आरएनएआई संग्रह के रूप में किसी जीन के लक्षण वर्णन के लिए मक्खी अनुसंधान समुदाय में उपलब्ध व्यापक संसाधन हैं ऊतक विशेष हानि के समारोह जीन का एक बहुमत कीएस, जीन loci के सबसे अधिक है, साथ ही साथ सीडीएनए क्लोन और लाभ के समारोह के अध्ययन के लिए उपयोगी transgenes के लिए उत्परिवर्ती और कमी alleles. हम उड़ान भरने नल विधि मक्खी प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल उपकरण बॉक्स के लिए एक मूल्यवान इसके अतिरिक्त होगा कि विश्वास करते हैं. भविष्य परिप्रेक्ष्य में, इस विधि विशिष्ट स्थितियों और उत्तेजनाओं के जवाब में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत नेटवर्क में परिवर्तन करने के लिए स्क्रीन मक्खी व्यवहार मानदंड और मानव रोग मॉडल के साथ जोड़ा जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम हमें खमीर नल अभिव्यक्ति plasmids भेजने के लिए EUROSARF धन्यवाद. हम भी रयान Labadens से संपादकीय मदद के लिए आभारी हैं. इस काम CW पर एक एनआईएच / NINDS अनुदान (R01NS070962) द्वारा समर्थित किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
U.S.A. standard test sieve No. 25 Fisher Scientific 04-881-18
U.S.A. standard test sieve No. 40 Fisher Scientific 04-881-21
 Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml Kimble Chase 885300-0015
IgG sepharose beads Pharmacia 17-0969-01
Econo-column 0.7 cm x 20 cm Bio-Rad 737-4721
Econo-column 0.5 cm x 15 cm Bio-Rad 737-4716
Calmodulin beads Stratagene 214303
Coors Mortar and Pestle CoorsTek 60311
AcTEV Protease Invitrogen 12575-015
Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836153001
Protease Inhibitor Mix Sigma P8340

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References

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बायोकैमिस्ट्री अंक 82, Gal4/UAS प्रणाली ट्रांसजेनिक मिलकर संबंध शुद्धीकरण प्रोटीन प्रोटीन बातचीत प्रोटिओमिक्स
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Tian, X., Zhu, M., Li, L., Wu, C.… More

Tian, X., Zhu, M., Li, L., Wu, C. Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP). J. Vis. Exp. (82), e50968, doi:10.3791/50968 (2013).

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