Abstract
תאים כמדרדרים תיוג רשתית גנגליון (RGCs) יכולים לבודד somata RGCs ממוות באתרים, זה הפך להיות תקן הזהב לספירת RGCs בהישרדות RGCs וניסויים התחדשות. מחקרים רבים שבוצעו בבעלי חיים יונקים, כדי לחקור הישרדות RGCs לאחר פציעת עצב ראייה. עם זאת, תיוג מדרדר של RGCs בדג זברה מבוגר עדיין לא דיווח, אם כי יכולות כמה שיטות חלופיות לספור מספרי תא בשכבות רשתית גנגליון תא (RGCL). בהתחשב בגודל הקטן של גולגולת דג הזברה המבוגר והסיכון הגבוה למוות לאחר הקידוח בגולגולת, אנחנו פותחים את הגולגולת בעזרת חומצת תחריט ולאטום את החור עם קשר ריפוי אור, אשר באופן משמעותי יכול לשפר את שיעור ההישרדות. לאחר ספיגת הצבעים במשך 5 ימים, כמעט כל RGCs מסומנים. כמו בשיטה זו לא צריכה transect עצב הראייה, שהוא אין לו תחליף במחקר של הישרדות RGCs לאחר למחוץ עצב ראייה בדג זברה מבוגר. הנה, אנחנו מציגיםצעד אחר צעד בשיטה זו ולספק תוצאות נציג.
Introduction
כמו שיש לי דג הזברה מבוגר יכולת חזקה כדי להתחדש אקסונים לאחר פציעת עצב הראייה 1, שיטה נכונה כדי לספור את כל RGCs הוא חיוני כדי להעריך הישרדות RGCs והתחדשות 2. בהתבסס על השיטות של RGCs תיוג המדרדר ב3 יונקים ודגי זהב - 5, בנינו השיטה לתייג RGCs מtectum בדג זברה מבוגר. לדג זברה מבוגר, יש לציין שתי בעיות טכניות קריטיות: הגולגולת של דג הזברה מבוגר היא קטנה מאוד 6; הם חיים בסביבת מים. כאן, אנו מטפלים בגולגולת עם etchant אשר ממזערת את הסיכונים הקשורים לקידוח 5. לאחר מכן, אנו לאטום את החור עם קשר ריפוי אור אשר משפר את סיכויי ההישרדות של בעלי חיים לאחר ניתוח.
בעבר, כמה טכניקות אחרות אומצו לספור מספר RGCs בדרכים עקיפות. הוא מכתים בסעיפי רשתית תוויות לכל סוגי תאים ב7 RGCL. תיוג נוגדן בכל retina, כגון איון-1, יכול גם לתייג תאי amacrine 8. למרות תווית מדרדר מגדם עצב הראייה יכולה לתייג כל RGCs ברשתית, זה לא יכול להיות מאומץ במודל ההתאהבות משום שהיא גורמת לפגיעה נוספת לעצב הראייה. ניצול של תווית מדרדר מtectum, יש לנו חקר הישרדות RGCs והתחדשות בדוחק עצב ראייה. תוצאות מראות כי כמעט כל RGCs שרד ומעל 90% מRGCs מחדש לtectum בשבוע הראשון במודל ההתאהבות 9.
כדי לתייג בהצלחה את כל RGCs, רסק DiI נבחר לאחר השוואה עם מספר צבעים מסחריים אחרים 10. ראשית, הוא נועד בעיקר לתיוג רקמות בגוף החי. שנית, זה צבע lipophilic שלא ניתן לנטרל במים. בנוסף, הקרינה זו יכולה להימשך זמן רב מה שהופך אותו למועמד מצוין למחקר הישרדות RGCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. לבנות מנגנון הניתוח
הערה: כדי להבטיח את הדג נשאר בחיים במהלך ואחרי מבצע, אתיל פתרון הרדמה בטפטוף methanesulfonate 3-aminobenzoate (MS-222, או Tricaine) בריכוז מחצית (0.015%) עם מהירות של 1 טיפה / sec דרך פיו של הדג באמצעות מערכת טפטוף homebuilt מוצגת באיור 1.
- להפוך את התיבה כפי שמוצג באיור 1 א (אורך הוא 28 סנטימטר, רוחב הוא 10 סנטימטר, גובה הוא 5 ס"מ), לשים ספוג (אורך הוא 6 סנטימטר, רוחב הוא 9 סנטימטר, גובה הוא 4 ס"מ) באמצע ולפתוח פער עליו.
- לעשות משטח כדורי חלק בסופו של המחט עם קשר אור ריפוי (איור 1), אשר לאחר מכן ניתן יהיה מוכנס לתוך הפה הדגים. ודא שהמשטח של המחט הוא חלקה כדי למנוע את פיו של הדג מלהיות פגום.
- מוסיף את מחצית הריכוז של MS-222 (קאמרי עזב, אורך הוא 6 סנטימטר, רוחב הוא 10 גמ ', גובה הוא 8 סנטימטר) ומלוח (קאמרי נכון, אורך הוא 4 סנטימטר, רוחב הוא 10 סנטימטר, גובה הוא 8 סנטימטר) למאגרים כפי שמוצג באיור 1 ג. הערה: MS-222 טריים מומלץ.
- הרדימי דגים ב0.03% MS-222 למשך 2 דקות.
- מניחים את הדגים בפער של הספוג ולתקן את הדגים עם שני זוגות של סיכות, מוכנסים מאחורי סנפיר החזה וליד נקבוביות הביוב, בהתאמה 11.
- חבר פיו של הדג, MS-222, ומים גידול בצינור סוג T כפי שמוצג באיור 1 ג.
- הפעל את הצינור המחובר לMS-222.
2. RGCs ייבל מדרדר מTectum הימני
הערה: לפני ההתחלה, לחטא את כל המנגנונים עם 70-75% אתנול, להבטיח כי אין אתנול נשאר.
- רוסינג: מעט להסיר את העור על כל הגולגולת עם sclerectome (תצוגה הגבי של הגולגולת מוצגת ב2A דמויות ו2B
- פינוי: לשטוף את הגולגולת עם מי מלח ולאחר מכן לייבש אותו עם הנורה שטיפת אוזן.
- קורוזיה ראשונית: שיתוק של הגולגולת עם etchant עבור 10 שניות.
- פינוי: לנגב לחלוטין משם etchant עם מקלון צמר גפן ולאחר מכן לשטוף את האזור עם מי מלח ולייבש אותו.
- הגנה: כדי להגן על הגולגולת באזורים אחרים מלבד tectum תקין מפני קורוזיה עודפת, לכסות אזורים אלה עם קשר ריפוי אור ולאחר מכן לרפא אותה על ידי חשיפה לאור כחול עם illuminant הנייד.
- קורוזיה מלאה: לשים etchant בתחום tectum תקין המרכזי שוב לתחריט מלא למשך 2 דקות. הערה: מאחר וגולגולות של דגים בוגרים הן מסוידים, קורוזיה תיקח זמן רב יותר.
- פינוי: לנגב לחלוטין משם etchant עם מקלון צמר גפן ולאחר מכן לשטוף את האזור עם מי מלח ולייבש אותו שוב.
- פתיחת גולגולת: להסיר בזהירות את גולגולת malacic (איור 2 ג) עם מלקחיים לחשוף 2D tectum ימינה (איור
- פינוי: לנגב את הריר ומשתפך דם מהחור עם חתיכות של gelfoam ולשטוף אותו עם מי מלח עד שדימום פסק.
- מיקום דיי: לשים את הצבע (דבק רקמות תיוג) על tectum ימין כולו ולכסות אותו עם gelfoam.
- הפרדה: לכסות את החור עם סולם סטרילי מאותו בעלי החיים.
- איטום: אג"ח ריפוי אור המקום על הסולם ולאחר מכן לרפא אותה באור כחול שוב ל40 שניות.
- תחייה: לשטוף את פני השטח של האג"ח ולהחיות את החיה עם מי מלח.
- סיעוד ורבייה: שמור את הדגים ב28.5 ° בינוני עובר C (ZFIN) במשך 5 ימים ולהאכיל 2 פעמים / יום. אין לכלול דגי צבע שלו אינו מסוגל להישאר בtectum במשך 5 ימים בניסוי. הערה: הפתרון בינוני עובר (EM) הוא חיוני להישרדות דגים והטמפרטורה היא גורם מפתח עבור תיוג DiI.
3. Wholemounting רשתית והדמיה
- מניחים את הדגים בשדה חשוך במשך שעה 2 לפני הרשתית שlemount.
- להרדים את הדגים במי קרח.
- לנקב חור במרווח של קרנית ולגרום כוס העין על ידי הסרת הקרנית עם מספריים ונוס.
- הסר את העדשה ולאחר מכן לשטוף את מרכז הרשתית עם קר כקרח 1x PBS.
- לשטוף את הפער בין רשתית ולובן עין עם קר כקרח 1x PBS עד שלא פיגמנט שנשאר.
- חותכים את עצב הראייה בדיסק.
- שמור את שכבת RGC כלפי מעלה ומחזיק את הרשתית עם כפית מתוצרת עצמי זכוכית (3A דמויות ו3B). גם טפטפת יכול לשמש כדי להעביר את הרשתית.
- שים את הרשתית בירידה של גליצרין 30% הקפוא בשקופית עם שכבת RGC כלפי מעלה (איור 3 ג).
- הסר את גליצרין ולאחר מכן לשטח את הרשתית בשקופית הזכוכית לפני חיתוך רשתית לארבעה רביעים (איור 3D). שמירה על הרשתית פרשה עם שכבת RGC כלפי מעלה תהיה מועילה לשיטוח הרשתית.
- לטפטף גליצרין 50% קרח על tהוא הרשתית כדי לשטוף את שברים של פיגמנט.
- הסר את גליצרין ולאחר מכן שחרר 20 μl של גליצרין 75% קרח על הרשתית.
- כסה את המדגם עם 1.8 סנטימטר coverslip ריבוע x 1.8 סנטימטר.
- לאטום את coverslip עם לק. הדמיה מיידית של הרשתית מומלצת.
- תמונה ללא שרג הרשתית כולה תחת עדשת אובייקט 20X (NA = 0.70) עם DP72 CCD (כל תמונה היא 1360 x 1,024 פיקסלים). לכל שדה יש שלושה מוקדים שונים.
- להאריך את עומקו של כל שדה בכלי של "עומק השדה מורחב" בתוכנה.
- להרכיב רשתית וירטואלית עם הפונקציה של מיזוג תמונות.
- בחר שלושה תחומי 680 x 512 פיקסלים (אזור בפועל הוא 350 מיקרומטר ידי 264 מיקרומטר, 0.092 2 מ"מ) בכל כיוון של הרשתית לנתח צפיפות של RGCs ממוצעת (איור 4 א).
- השג את האזור עם הפונקציה של מדידות - ליצור תכונת מצולע בתמונהתוכנה.
- לחשב את המספר הכולל של RGCs ידי המשוואה "מספר RGCs = אזור x הגורל" 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כמו להראות דמויות 4B-D, מספר DiI + התאים הוא שני שלישים מDAPI תאים + בRGCL. ברשתית נורמלית, תמונת מונטאז' של רשתית כולה (איור 4E) מראה כי DiI + RGCs מופצות על פני כל הרשתית אבל ברשתית מחדש (איור 4F), כRGCs באזור המרכז לא מחדש ליעד שלהם ב בשבוע הראשון, הם לא יכלו להיות מתויגים.
איור 1. מנגנון הניתוח המשמש לתיוג מדרדר של RGC. (א) השתמש בספוג () כדי לתקן את הדגים. פלטפורמת ההפעלה (האורך היא 28 סנטימטר, רוחב הוא 10 סנטימטר, גובה הוא 5 סנטימטר) וצינור עירוי מחובר באמצעות מחט מתכת (ב). מים עודפים מאוחסנים בחלל (ג). (ב) תקריב למחט המתכת. ראשו של המחט הוא עטוף עם קשר ריפוי אור (ד). מאגרים (ג) משמשים לאחסון MS-222 (ה, אורך הוא 6 סנטימטר, רוחב הוא 10 סנטימטר, גובה הוא 8 סנטימטר) ומלוח (f, אורך הוא 4 סנטימטר, רוחב הוא 10 סנטימטר, גובה הוא 8 סנטימטר), בהתאמה. צינור העירוי (ז) מחבר את המאגר ואת מחט המתכת.
איור 2. תצוגה הגבי של הגולגולת של דג הזברה מבוגר. () גולגולת שלמה לפני רוסינג. הקו המקווקו הצהוב מסמן את tectum; הקו המקווקו האדום מסמן את telencephalon; והקו המקווקו הירוק מסמן את המוח הקטן. (ב ') גולגולת לאחר העור הוסר. (ג) לאחר קורוזיה עם etchant, הגולגולת היא malacic ואזור קעור הוא הצביע על ידי מלקחיים (לבן *). (ד') tectum הימני חשוף לאחר הגולגולת מוסרת. קנה מידה היא 500 & #956; מ '.
איור 3. צעדי מפתח של wholemounting רשתית. () כף זכוכית Homebuilt לגורף רשתית, תמונה תחתונה מראה את ההשקפה שלמה. (ב) החזק את הרשתית עם "הכפית" (המסומנות בקו מקווקו). (ג) הובלת הרשתית לגליצרין 30% קר כקרח. ( D) חותכים את הרשתית ל4 רבעונים; חץ מציין את הכיוון של חיתוך. ברים סולם () 1 מ"מ; מיקרומטר (BD) 500.
F igure 4. הדגימה של RGCs לספור ברשתית וירטואלית. () תצוגה סכמטית של הרשתית יש ארבעה תחומים (N, D, V, שדה T) וכל אחד מהם יששלושה שדות שמוצגים בקופסא לבנה. שים לב לדיסק האופטי ממוקם בדרך כלל בכיוון הגחון ובזמן (נקודה שחורה). DiI (ב ') שכותרתו RGCs. תמונה מוזגה גרעין שכותרת DAPI (C). (ד') של RGCs וגרעין. תמונת Montage (E) של כל רשתית בדג זברה רגילה. (F) תמונת Montage מראה רשתית מחדש לאחר פציעת עצב ראייה. האזור המרכזי של הרשתית לא מסומן כמו RGCs לא מחדש למטרות שלהם בשבוע הראשון. קיצורים: N = האף, D = גב, V = הגחון, T = זמן. סולם ברים: 30 מיקרומטר (BD); 500 מיקרומטר (E, F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תיוג מדרדר של RGCs חשוב לחקור הישרדות RGCs בבעלי חיים יונקים, אבל זה לא נעשה שימוש בדג זברה. השיטות חלופיות, הוא מכתים 7 ומכתים נוגדן 8, אינם סטנדרטים זהב לספירת מספר RGCs, וקווים מהונדסים עם כל RGCs כותרת טרם נבנו 12, 13. בסרטון הזה, אנו מציגים שיטת מדרדר RGCs תווית ברשתית של דג הזברה מבוגר. למרות שכ -1% מהאקסונים להקרין לנורת חוש הריח או תחומים אחרים 14, שיטה זו יכולה לתייג כמעט כל RGCs ברשתית.
כמו דג הזברה הן שבירה מכדי לשאת בניזקי הגוף, פותח את הגולגולת של דג הזברה מבוגר עם אזמל חתך 3 או תרגיל 5, 15 עלולים לגרום למוות. ריכוך הגולגולת עם etchant יכול למזער את הנזק למוח. על ידי איטום החור עם קשר ריפוי אור ולתקן אותו תחת אור הכחול,רוב הדגים לשרוד לאחר ניתוח. זה לוקח רק 12-15 דקות כדי לבצע את הניתוח תחת מבצע מיומן, שהוא יותר נוח ויעיל בהשוואה לחולדות ובעלי חיים יונקים אחרים 5.
דבק רקמות תיוג DiI הוא צבע lipophilic. בהשוואה לגבישים או microinjection של תמיסות מרוכזות DiI, זה משפר את חדירת הצבע לתוך הרקמות, תיוג אקסונים הן על ומתחת לפני השטח. בנוסף, הקרינה יכולה להימשך פרק זמן ארוך 10. מצד השני, צבע זה נספג על ידי מסלול תחבורה פסיבי, ולכן יש צורך להשאיר את הצבע בtectum במשך לפחות 5 ימים לתיוג מלא.
דג הזברה הוא אורגניזם מודל מצוין של התחדשות ויזואלי. בשעת 7 ימים לאחר למחוץ עצב ראייה, כמעט כל RGCs האקסון להתחדש לtectum, אבל רק מחצית RGCs להתחדש במודל לחתוך עצב הראייה 9. שיטה זו היא דרך אידיאלית כדי לחקור RGCשל הישרדות והתחדשות לאחר למחוץ עצב ראייה, אשר יכול למנוע פגיעה נוספת בעצב הראייה.
יש לנו הצגתי את פרוטוקול מלא לRGCs תיוג המדרדר בהצלחה בדג זברה מבוגר ומדידת מספר RGCs ברשתית wholemount. בנוסף, על ידי שימוש באג"ח ריפוי אור, אנו מגדילים את שיעור ההישרדות של דג הזברה, אשר עושה בשיטה זו יעילה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MS222 | Sigma Aldrich, USA | E10521 | |
| DiI | Invitrogen, USA | N22880 | |
| Light curing bond | Heraeus Kulzer, Germany | Durafill bond | |
| Gluma Etch | Heraeus Kulzer, Germany | Gluma Etch 35 Gel | |
| Blue LED | Shenruo Medical Equipment Co., China | Power Blue Light Curing Unit |
References
- Wyatt, C., et al. Analysis of the astray/robo2 zebrafish mutant reveals that degenerating tracts do not provide strong guidance cues for regenerating optic axons. J Neurosci. 30, 13838-13849 (2010).
- Grieshaber, P., Lagreze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. J Neurosci Methods. 192, 233-239 (2010).
- Schwalb, J. M., et al. Two factors secreted by the goldfish optic nerve induce retinal ganglion cells to regenerate axons in culture. J Neurosci. 15, 5514-5525 (1995).
- Watanabe, M., Inukai, N., Fukuda, Y. Survival of retinal ganglion cells after transection of the optic nerve in adult cats: a quantitative study within two weeks. Vis Neurosci. 18, 137-145 (2001).
- Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus. J Vis Exp. , (2008).
- Bakken, T. E., Stevens, C. F. Visual system scaling in teleost fish. J Comp Neurol. 520, 142-153 (2012).
- Zhou, L. X., Wang, Z. R. Changes in number and distribution of retinal ganglion cells after optic nerve crush in zebrafish. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 35, 159-162 (2002).
- Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
- Zou, S., Tian, C., Ge, S., Hu, B. Neurogenesis of retinal ganglion cells is not essential to visual functional recovery after optic nerve injury in adult zebrafish. PLoS One. 8, (2013).
- Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: a comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117, 167-172 (2002).
- Zou, S. Q., et al. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J Vis Exp. , (2010).
- Tokuoka, H., Yoshida, T., Matsuda, N., Mishina, M. Regulation by glycogen synthase kinase-3beta of the arborization field and maturation of retinotectal projection in zebrafish. J Neurosci. 22, 10324-10332 (2002).
- Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection. Development. 132, 2955-2967 (2005).
- Li, L., Dowling, J. E. Disruption of the olfactoretinal centrifugal pathway may relate to the visual system defect in night blindness b mutant zebrafish. Journal of Neuroscience. 20, 1883-1892 (2000).
- Kassing, V., Engelmann, J., Kurtz, R. Monitoring of Single-Cell Responses in the Optic Tectum of Adult Zebrafish with Dextran-Coupled Calcium Dyes Delivered via Local Electroporation. PLoS One. 8, (2013).
