Abstract
Som bakåtsträvande märkning retinal ganglion celler (RGC) kan isolera RGC somata från att dö platser, har det blivit den gyllene standarden för att räkna RGC i RGC överlevnad och regenereringsexperiment. Många studier har utförts på däggdjur till forskning RGC överlevnad efter synnerven skada. Emellertid retrograd märkning av RGC i vuxna zebrafisk har ännu inte rapporterats, även om vissa alternativa metoder kan räkna cellantal i retinala ganglioncellskikt (RGCL). Med tanke på den begränsade storleken på den vuxna zebrafisk skallen och den stora risken för död efter borrning på skallen, öppnar vi skallen med hjälp av syraetsning och täta hålet med en ljushärdning obligation, som avsevärt skulle kunna förbättra överlevnaden. Efter att absorbera färgämnen i 5 dagar, har nästan alla RGC märkta. Eftersom denna metod inte behöver för tvärsnitt av synnerven, det är oersättlig i forskningen av RGC överlevnad efter synnerven krossa i vuxen zebrafisk. Här presenterar vimetoden steg för steg och ger representativa resultat.
Introduction
Som vuxen zebrafisk har en stark förmåga att regenerera axoner efter synnerven skada 1, en lämplig metod för att räkna hela RGC är viktigt att utvärdera RGC överlevnad och regeneration 2. Baserat på de metoder för bakåtsträvande märkning RGC i däggdjurs-och guldfiskar 3-5, konstruerade vi den metod för att märka RGC: er från tectum i vuxen zebrafisk. För vuxna zebrafisk, bör två viktiga tekniska problem noteras: skallen av vuxna zebrafisk är mycket liten 6; de lever i en vattenmiljö. Här behandlar vi skallen med etsningsmedel som minimerar riskerna i samband med borrning 5. Sedan vi täta hålet med ljushärdning obligation som förbättrar djurens överlevnad efter operation.
Tidigare har flera andra metoder som antagits för att räkna RGC nummer i indirekta sätt. HE-färgning i näthinnan sektioner etiketter alla typer av celler i RGCL 7. Antikropps märkning i hela retina såsom islet-1, kan också märka amakrina celler 8. Även retrograd etikett från synnerven stubben kan märka alla RGC i näthinnan, kan det inte antas i trängseln modellen eftersom det orsakar extra skada på synnerven. Med utnyttjande av retrograd etikett från tectum, har vi undersökt RGC överlevnad och regeneration i synnerven krossa. Resultaten visar att nästan alla RGC överlevt och över 90% av RGC regener till tectum vid den första veckan i krossmodellen 9.
För att framgångsrikt kunna märka alla RGC var Dil pasta valt efter jämförelse med ett antal andra kommersiella färgämnen 10. För det första är det speciellt konstruerad för in vivo vävnad märkning. Det andra är det ett lipofilt färgämne, som inte kan diffundera i vatten. Dessutom kan denna fluorescens kvarstå under en lång tid, vilket gör den till en utmärkt kandidat för RGC överlevnad forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Konstruera Kirurgi Apparatus
OBS: För att säkerställa att fisken är fortfarande vid liv under och efter operationen, dropp anestesi lösning etyl 3-aminobensoat metansulfonat (MS-222, eller Tricaine) på en halv koncentration (0,015%) med en hastighet av 1 droppe / sekund genom fiskens mun med användning av en hembyggd dropp system som visas i figur 1.
- Gör en ruta som visas i figur 1 A (längd är 28 cm, bredd 10 cm, höjd är 5 cm), satte en svamp (längd är 6 cm, bredd 9 cm, höjd är 4 cm) i mitten och öppna en gapet på den.
- Gör en mjuk klotformig yta på änden av nålen med ljushärdning bindning (Figur 1B) som sedan kommer att införas i fisken mun. Se till att ytan av nålen är slät för att förhindra fiskens mun skadas.
- Tillsätt hälften koncentrationen av MS-222 (vänster kammare, är längd 6 cm, 10 c breddm, är höjd 8 cm) och koksaltlösning (höger kammare, är längd 4 cm, bredd 10 cm, höjd är 8 cm) till reservoarerna som visas i figur 1C. OBS: Fresh MS-222 rekommenderas.
- Bedöva fisk i 0,03% MS-222 i 2 min.
- Placera fisken i gapet av svampen och fixera fisk med två par stift, insatta bakom bröstfenan och bredvid svabbprover från kloak por, respektive 11.
- Anslut fiskens mun, MS-222, och uppfödnings vatten med en T-typ röret såsom visas i fig. 1C.
- Slå på röret anslutet till MS-222.
2. Retrograde Label RGC: er från höger Tectum
OBS: Före början, desinficera alla apparater med 70-75% etanol, se till att ingen etanol kvarstår.
- Rossing: liten bort huden över hela skallen med sclerectome (dorsal vy av skallen är visad i figurerna 2A och 2B
- Clearing: tvätta skallen med koksaltlösning och sedan torka den med örat tvätt glödlampa.
- Initial korrosion: korrodera skallen med etsningsmedel för 10 sek.
- Clearing: Torka helt bort etsmedlet med en bomullspinne och sedan tvätta med koksaltlösning och torka den.
- Skydd: För att skydda skallen på andra områden förutom höger tectum från överskotts korrosion, täcker dessa områden med ljushärdning bond och sedan bota det med exponering för blått ljus med bärbar ljuskälla.
- Komplett korrosions: sätta etsningsmedel i den centrala delen av den högra tectum igen för fullständig etsning i 2 min. OBS: Eftersom skallar av äldre fisk är förkalkade, kommer korrosion att ta längre tid.
- Clearing: Torka helt bort etsmedlet med en bomullspinne och sedan tvätta med koksaltlösning och torka den igen.
- Skull öppning: försiktigt bort malacic skallen (figur 2C) med pincett för att exponera rätt tectum (Figur 2D
- Clearing: torka av slem och blod effusing från hålet med bitar av gelfoam och tvätta den med koksaltlösning tills blödningen har slutat.
- Dye placering: sätta färgen (tissue-märkning pasta) på hela högra tectum och täck den med gelfoam.
- Segregerande: täcka hålet med en steril skala från samma djur.
- Tätning: placera ljushärdning obligation på vågen och sedan bota den med blått ljus igen under 40 sekunder.
- Revival: Tvätta ytan av obligationen och återuppliva djuret med koksaltlösning.
- Vård och uppfödning: Förvara fisken på 28,5 ° C embryo medium (ZFIN) i 5 dagar och foder 2 gånger / dag. Ta inte med fisk vars färg inte stanna i tectum i 5 dagar i experimentet. OBS: Embryo medium (EM) lösning är avgörande för fisk överlevnad och temperaturen är den viktigaste faktorn för DII märkning.
3. Wholemounting Retina-och bildbehandling
- Lägg fisken i ett mörkt fält för 2 timmar före näthinnan somlemount.
- Söva fisken med isvatten.
- Punktera ett hål i marginalen på hornhinnan och göra en ögonkopp genom att ta bort hornhinnan med venus sax.
- Ta bort lins och sedan spola mitt i näthinnan med iskall 1x PBS.
- Spola klyftan mellan näthinnan och sklera med iskall 1x PBS tills ingen pigment kvar.
- Skär synnerven på skivan.
- Håll RGC lagret uppåt och håll näthinnan med en self-made glassked (fig. 3A och 3B). En pipett kan också användas för att överföra näthinnan.
- Sätt näthinnan i en droppe iskall 30% glycerol på ett objektglas med RGC skikt uppåt (figur 3C).
- Ta bort glycerin och sedan plattar näthinnan på glasskiva före kapning näthinnan i fyra kvadranter (Figur 3D). Att hålla näthinnan ovikt med RGC lagret uppåt kommer att vara till hjälp för att platta näthinnan.
- Droppa iskalla 50% glycerin på than näthinnan för att tvätta bort fragment av pigmentet.
- Ta bort glycerin och sedan släppa 20 pl isiga 75% glycerin på näthinnan.
- Täck över provet med ett 1,8 cm x 1,8 cm i fyrkant täckglas.
- Täta täckglas med nagellack. Omedelbar avbildning av näthinnan rekommenderas.
- Icke-interlace bild hela näthinnan i en 20X objektlins (NA = 0,70) med DP72 CCD (varje bild är 1360 x 1024 pixlar). Varje fält har tre olika inriktningar.
- Förläng djupet av varje fält med verktyget enligt "förlängd skärpedjup" i programvaran.
- Montera en virtuell näthinna med funktionen av Photomerge.
- Välj tre områden av 680 x 512 pixlar (faktiska området är 350 nm med 264 nm, 0,092 mm 2) i varje riktning av näthinnan för att analysera genomsnittlig täthet av RGC: er (Figur 4A).
- Skaffa området med funktionen av mätningar - skapa en polygon inslag i bildenprogramvara.
- Beräkna det totala antalet RGC genom ekvationen "RGC number = öde x area" 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Såsom figurerna 4B-D visar, är antalet DII + celler två tredjedelar av DAPI + celler i RGCL. I en normal näthinna, ett montage bild av en hel näthinnan (Figur 4E) visar att DII + RGC är fördelad över hela näthinnan, men i en regenererad näthinnan (Figur 4F), som RGC i det centrala området inte har regenereras till sitt mål vid den första veckan, de kunde inte märkas.
Figur 1. Operationen apparat som används för retrograd märkning av RGC. (A) Använd en svamp (a) för att fixa fisken. Rörelse plattform (längd är 28 cm, bredd 10 cm, höjd är 5 cm) och infusionsslangen är ansluten via en metall nål (b). Överskott av vatten lagras i hålrummet (c). (B) En närbild för metallen nålen. Nålen huvud är lindade med ljushärdning bindning (d). (C) Behållare används för lagring av MS-222 (E, är längden 6 cm, bredd 10 cm, höjd är 8 cm) och koksaltlösning (f, längden är fyra cm, bredd 10 cm, höjd är 8 cm), respektive. Infusionsröret (G) ansluter behållaren och metall nålen.
Figur 2. Dorsal vy av skallen av vuxna zebrafisk. (A) Intakt skallen före Rossing. Den gula streckade linjen markerar tectum; den röda streckade linjen markerar telencefalon; och den gröna prickade linjen markerar lillhjärnan. (B) Skull efter hud bort. (C) Efter korrosion med etsningsmedel, är skallen malacic och en konkav område pekas ut av pincett (vit *). (D) Höger tectum exponeras efter skallen avlägsnas. Skala är 500 & #956, m.
Figur 3. Nyckel stegen wholemounting näthinnan. (A) Homebuilt glas sked för att ösa näthinnan, visar nedre bilden hela vyn. (B) Håll näthinnan med "sked" (markerad med streckad linje). (C) Transport näthinnan i iskall 30% glycerin. ( D) Skär näthinnan i 4 kvartal; Pilen anger riktningen för skärning. Skala barer (A) 1 mm; (BD) 500 | im.
F igure 4. Provtagningen av RGC räknar i virtuella näthinnan. (A) Schematisk bild av näthinnan har fyra fält (N, D, V, T-fältet) och var och en av dem hartre fält som visas i en vit ruta. Lägg märke till den optiska skivan är vanligtvis belägen på den ventrala-tidsorientering (svart prick). (B) Dil-märkta RGC. (C) DAPI märkt kärna. (D) Sammanslagen bild av RGC och kärna. (E) Montage bild av hela näthinnan i normal zebrafisk. (F) Montage bild som visar regenere näthinnan efter synnerven skada. Den centrala delen av näthinnan inte är märkt som RGC: er inte har regenereras till sina mål på den första veckan. Förkortningar: N = nasal, D = rygg, V = ventrala, T = tids. Skalstrecken: 30 ^ m (BD); 500 | im (e, f).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Retrograd märkning av RGC är viktigt att forska RGC överlevnad i däggdjur, men det har inte använts i zebrafisk. De alternativa metoder, HE-färgning 7 och antikroppsfärgning 8, är inte guld-standarder för räkning av RGC antal och transgena linjer med alla RGC märkta ännu inte har konstruerats 12, 13. I denna video presenterar vi en metod för att retrograd etikett RGC: er i näthinnan av vuxna zebrafisk. Även om ca 1% av axoner projicera att luktloben eller andra områden 14, kan denna metod märka nästan alla RGC i näthinnan.
Som zebrafisk är för sköra för att bära den fysiska skadan, öppna skallen av vuxna zebrafisk med skalpell snitt 3 eller en borr 5 15 kan leda till döden. Mjukgörande skallen med etsningsmedel kan minimera skador på hjärnan. Genom att täta hålet med en ljushärdande obligation och fastställande av den under blått ljus,de flesta fiskar överlever efter operationen. Det tar bara 12-15 minuter att utföra operationen i skickliga drift, vilket är mer bekväm och effektiv jämfört med råtta och andra däggdjur 5.
Dil vävnadsmärkningspasta är en lipofil färgämne. Jämfört med DII kristaller eller mikroinjektion av koncentrerade lösningar, förbättrar denna penetration av färgämnet i vävnaden, märkning axoner både på och under ytan. Vidare kan fluorescens kvarstår under en lång tidsperiod 10. Å andra sidan är detta färgämne absorberas genom passiv transport pathway, så det är nödvändigt att lämna färgämnet i tectum i minst 5 dagar för fullständig märkning.
Den zebrafisk är en utmärkt modellorganism för visuell förnyelse. Vid 7 dagar efter synnerven krossa, nästan alla RGC axon regenerera till tectum, men endast hälften av RGC regenerera i den optiska nerven skuren modell 9. Denna metod är ett idealiskt sätt att forska RGCs överlevnad och regeneration efter synnerven krossa, vilket skulle kunna undvika extra skada på synnerven.
Vi har lagt fram ett komplett protokoll för framgångsrikt bakåtsträvande märkning RGC i vuxen zebrafisk och mäta RGC nummer i en wholemount näthinnan. Dessutom, genom användning av en ljushärdning bindning ökar vi överlevnaden hos zebrafisk, vilket gör denna metod mer effektiv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MS222 | Sigma Aldrich, USA | E10521 | |
| DiI | Invitrogen, USA | N22880 | |
| Light curing bond | Heraeus Kulzer, Germany | Durafill bond | |
| Gluma Etch | Heraeus Kulzer, Germany | Gluma Etch 35 Gel | |
| Blue LED | Shenruo Medical Equipment Co., China | Power Blue Light Curing Unit |
References
- Wyatt, C., et al. Analysis of the astray/robo2 zebrafish mutant reveals that degenerating tracts do not provide strong guidance cues for regenerating optic axons. J Neurosci. 30, 13838-13849 (2010).
- Grieshaber, P., Lagreze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. J Neurosci Methods. 192, 233-239 (2010).
- Schwalb, J. M., et al. Two factors secreted by the goldfish optic nerve induce retinal ganglion cells to regenerate axons in culture. J Neurosci. 15, 5514-5525 (1995).
- Watanabe, M., Inukai, N., Fukuda, Y. Survival of retinal ganglion cells after transection of the optic nerve in adult cats: a quantitative study within two weeks. Vis Neurosci. 18, 137-145 (2001).
- Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus. J Vis Exp. , (2008).
- Bakken, T. E., Stevens, C. F. Visual system scaling in teleost fish. J Comp Neurol. 520, 142-153 (2012).
- Zhou, L. X., Wang, Z. R. Changes in number and distribution of retinal ganglion cells after optic nerve crush in zebrafish. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 35, 159-162 (2002).
- Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
- Zou, S., Tian, C., Ge, S., Hu, B. Neurogenesis of retinal ganglion cells is not essential to visual functional recovery after optic nerve injury in adult zebrafish. PLoS One. 8, (2013).
- Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: a comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117, 167-172 (2002).
- Zou, S. Q., et al. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J Vis Exp. , (2010).
- Tokuoka, H., Yoshida, T., Matsuda, N., Mishina, M. Regulation by glycogen synthase kinase-3beta of the arborization field and maturation of retinotectal projection in zebrafish. J Neurosci. 22, 10324-10332 (2002).
- Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection. Development. 132, 2955-2967 (2005).
- Li, L., Dowling, J. E. Disruption of the olfactoretinal centrifugal pathway may relate to the visual system defect in night blindness b mutant zebrafish. Journal of Neuroscience. 20, 1883-1892 (2000).
- Kassing, V., Engelmann, J., Kurtz, R. Monitoring of Single-Cell Responses in the Optic Tectum of Adult Zebrafish with Dextran-Coupled Calcium Dyes Delivered via Local Electroporation. PLoS One. 8, (2013).
