Den Published: March 11, 2014 doi: 10.3791/51040

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Michael W. Rudokas¹, Zoltan Varga¹, Angela R. Schubert¹, Alexandra B. Asaro¹, Jonathan R. Silva¹

¹Department of Biomedical Engineering, Washington University in St. Louis

Summary

Cut-open vaselin gap tilnærming blir brukt for å oppnå lavt støynivå innspillinger av ioniske og gating strømmer fra spenningsavhengige ionekanaler uttrykt i Xenopus oocytter med høy oppløsning på raske kanalkinetikk. Med mindre modifikasjoner, kan spennings-klemme fluorometri sammenkoples med cut-åpen oocytten protokoll.

Abstract

Cut-open eggcelle vaselin gap (COVG) spenning klemme teknikken gjør det mulig for analyse av elektrofysiologiske og kinetiske egenskaper av heterologe ionekanaler i ubefruktede egg. Opptak fra cut-åpen oppsett er spesielt nyttig for å løse lave magnitude gating strømninger, rask ionisk nåværende aktivering og deaktivering. De viktigste fordeler i forhold til de to-elektrodespenningsklemme (TEVC) teknikk inkluderer økt klemme hastighet, forbedret signal-til-støy-forhold, og evnen til å modulere den intracellulære og ekstracellulære miljø.

Her benytter vi den menneskelige hjertenatriumkanalen (HNA _V 1.5), uttrykt i Xenopus oocytter, for å demonstrere cut-åpen oppsett og protokoll samt endringene som er nødvendige for å legge spenning klemme fluorometri evne.

Egenskapene til raske aktiverings ionekanaler, som for eksempel HNA _V 1.5, ikke fullt ut kan løses nær romtemperatur ved hjelp TEVC, i hh helheten av oocytten membranen er fastklemt, slik at spenningskontroll vanskeligere. Imidlertid, i cut-åpen teknikk, isolering av bare en liten del av cellemembranen tillater hurtig fastspenning nødvendig for å nøyaktig registrere hurtige kinetikk, mens den forhindrer kanal nedslitt forbundet med patch clamp-teknikker.

I forbindelse med COVG teknikk, ionekanal-kinetikk og elektrofysiologiske egenskaper kan bli ytterligere analysert ved hjelp av spennings-klemme fluorometri, hvor protein bevegelsen spores via cystein konjugering av ekstracellulært anvendt fluoroforer, innsetting av genetisk kodede fluorescerende proteiner, eller inkorporering av unaturlige aminosyrer inn i regionen av interesse ^en. Denne tilleggsdata gir kinetisk informasjon om spenningsavhengige konformasjonsforandringer rearrangements av proteinet gjennom endringer i mikromiljøet som omgir det fluorescerende molekyl.

Introduction

Spesialiserte spenningsklemmeteknikk tillater opptak av ioniske strømmer ved kontrollerte membranpotensialer. Mye brukt to-elektrode spenningsklemmen (TEVC) og patch clamp teknikker gir pålitelig elektrofysiologisk informasjon om egenskapene til mange ionekanaler. Men begge disse metodene har ulemper som hindrer anskaffelse av pålitelige data for rask spenningsstyrte natriumkanaler og andre fast aktiverings kanaler i membraner som for eksempel de av Xenopus oocytter. De Bezanilla og Stefani laboratorier følgelig utviklet cut-åpen vaselin gap spenning klemme teknikk (COVG) for egg ^2. Teknikken har blitt brukt mye til å spille inn, Na ^+, K ^+, og Ca ^{2 +} kanaler ^3-8.

Under COVG opptak, er en heterologt protein-uttrykke eggcelle membran delt inn i tre regioner. Den ioniske strøm av data blir tatt opp fra den øverste regionen av oocytten sombad som omgir den øverste region er festet til en lede potensial, som kan enkelt og raskt skiftes. De midtre region beskytter mot lekkasjestrøm ved å bli spent fast til samme potensial som den øverste regionen ^ni. Den nedre område er der oocytt åpning (cut-åpen) skjer ved hjelp av et saponin løsning eller en kanyle. Kjemiske eller manuell åpning av membranen i det nedre område tillater kontroll av den indre potensial, som er festet til bakken, og gjør cellen innvendig sammenhengende med det nedre kammer løsning. Perfusjon av løsninger inn i det nedre kammer kan justere egenskapene til det indre miljø, mens oppløsningen veksling i den øverste kammeret endrer de eksterne omgivelsene.

Figur 1. Eggcelle Cut-Open Voltage-Clamp Bath Setup Diagram. (A) Topned-visning av de tre bad atskilt fra hverandre. Dimensjonene av kamrene for COVG er vist på figuren. (B) Sett fra siden av badstuer oppsett i testing posisjon. Klikk her for å se større bilde .

Fordelene med COVG teknikk omfatter lav strømstøy (1 nA på 3 kHz), kontroll av den ioniske sammensetning av eksterne medier, evnen til å modulere den interne mediet, fast tidsoppløsning (20-100 usekunder tidskonstanten for nedbrytning av kapasitet transient), og stabile opptak i flere timer ^9. Ulempene er at det krever spesialutstyr, og det er mer vanskelig å utføre sammenlignet med to-elektrodespenningsklem (TEVC) ^10.

Mens COVG tilnærming krever høyt spesialisert utstyr og intrikate prosessuelle elementer, kan det gi rom for kjøp av verdifulledyktige elektrofysiologiske data. Denne informasjonen, som for eksempel gating strømninger med raske kinetikk og hale strømninger ^4, kan tas opp uten noen av problemene forbundet med andre spenningsklem protokoller inkludert kanal nedslitt. Mindre modifikasjoner til COVG oppsett kan tillate bruk av temperaturkontrollere og spenning klemme fluorometri (VCF). Inkludering av spenning klemme fluorometri elementer innen COVG forsamlingen kan øke datautgang ved å konferere muligheten til å overvåke protein konformasjonsendringer samtidig opptak nåværende ^11-13.

Protocol

En. Initial Setup Utstyr

1. Plasser scenen og microelectrode manipulator på et vibrasjons isolert system (f.eks en luft tabell) med et området Faraday bur for å hindre elektrisk og mekanisk støy.
2. Lodd seks Ag / AgCl pellets til seks-tommers lengder av 24 AWG-ledning. Til en av disse lengder (for å være koblet til P1), spleise i en andre ledning for å danne en "Y". På endene av hver ledning lodde en gull BNC-pin, som følger med forsterkeren.
3. Koble de fem Ag / AgCl pellets loddet til 24 AWG-ledning til bad / Guard heads (P1, P2, CC, GS1 og GS2). Koble "I" Ag / AgCl pellet til "I" heads og andre ledningen som kommer ut av P1 til V2 heads.
4. Koble forsterkeren til datainnsamling enheten i henhold til retningslinjene i utstyrshåndbøkene.
5. Plasser og epoxy temperaturregulatoren termistorer. Tråd blokken termistor gjennom et hull i metall-stillasd rett over midten av varme-/ kjøle-element. Plasser og epoksy badekaret termistor i et hull boret i legemet av temperatur-ledende bunnkammeret meget nær, men ikke i kontakt løsningen.

2. Eggcelle og foreløpig Forberedelse

1. For å ta opp et heterologt uttrykt kanal som Hna _V 1.5, syntetisere mRNA (avledet fra hSCN5a) og injisere den i en Xenopus eggcelle rundt 4-5 dager før du utfører protokoll 4. For hSCN5a, er peak uttrykk innhentet etter inkubasjon i 4-5 dager ved 19 ° C. Referer til Richards og Dempski ¹⁴ og Cohen et al. ¹⁵ for detaljerte instruksjoner om eggcelle, mRNA forberedelse, og eggcelle injeksjon.
2. Klorid AgCl wire og AgCl pellets før du begynner protokoll 4. For å gjøre dette, plasserer den ene enden av ledningen og pellets i blekemiddel i minst 20 min, og så lenge O / N. Når pellets har blitt chlorided, feste dem til fordeleren ved hjelp av klebemiddel.
   Merk: Kjøring strøm gjennom ledningene kan også brukes til å klorid ledningen og pellets. Denne teknikken vil øke hastigheten på chloridation men krever også mer utstyr. Se Teknikker for Chloriding Silver Ledninger for videre opplæring ^16.

Tre. Agar Bridge Forberedelse

1. Lag minst seks agar broer ved å varme opp den ene enden av en borsilikat kapillarrør i et medium flamme. Kontroller at enden av kapillarrør er i den øverste del av det blå flamme. Gjør ekstra broer i tilfelle skade på originalene.
2. Når kapillarrør har varmet opp, bruke tang for å lage en 90 ° vinkel bend i røret. Målet for en bøyning med en jevn krumning i stedet for en brå hjørne, eller det kan i betydelig grad redusere den indre diameter av glasset, noe som gjør fylle mer vanskelig og øker motstanden av broen.
3. Lag en andre 90 ° bendi samme retning 25 mm nedover kapillarrør fra det første bend ved hjelp av den samme fremgangsmåten.
   Merk: Den nøyaktige lengden av broen spiller ingen rolle så lenge broen størrelse er i overensstemmelse, men til slutt lengdene bør være egnet for riggen de skal brukes på. Husk at bridge motstand er proporsjonal med lengden og bør minimaliseres.
4. Når kapillarrørene er avkjølt, kan du bruke en diamant-tipset glass cutter å trimme "ben" av broen til ca 5 mm.
5. Sett lengder av platinatråd inn kapillarrørene av de tre "strøm-leveranser" broer for å forbedre ytelsen ved å redusere motstand i agar ^17. Skjær av overflødig platinatråd, slik at det ikke er noen tråd utsettes utenfor røret.
   Merk: På grunn av de høye kostnadene av platina, hente og bruke noen ledning fra ødelagte broer.
6. Skyv platinatråd lenger inn i kapillarrør med en fin-tipped gjennomføre for eksempel en micropipette tip, slik at tråden er 1 mm kortere enn glasset på begge ender av kapillærrøret.
7. Gjør 100 ml av en M NMDG bufrede med 1,2 g HEPES. Bruk et pH-meter og tilsett MES hydrat pulver inntil en pH på 7,4 er oppnådd (ca. 10 g). Når en pH-verdi på 7,4 er nådd, fjernes pH-elektroden. Sett av 40 ml av løsningen for å holde som en lagringsløsning.
8. Legg granulert agar for å produsere et 2 til 3% agar-blanding. Rør-og varme til agar-løsning oppløses og klar. Ikke overopphetes eller koke løsningen som det vil bli altfor tyktflytende og fylle bruene vil være vanskelig.
9. Flytt agaroppløsningen til et nytt beger og legge en liten oppsikt bar. Fortsett oppvarming og stirring på et moderat hastighet.
10. Tilsett kapillær broene en av gangen med benene vendt opp. Over tid broene vil fylle med agar. Alternativt kan posisjonen broene ved å skyve agar løsning gjennom en sprøyte koblet til et lite pipettespissen.
11. Når det ikke er noen bobler i den bridges, hente broene fra agaroppløsningen og plassere broene på et papir håndkle for å tørke. Noen broer med rest bobler kan bli opphisset med tang for å lette boble exit.
    Merk: Avgjort agar med bobler kan fjernes helt ved å dyppe broene i kokende vann. Når agaren er fjernet, å bruke en vakuumledning for å fjerne gjenværende vann. Broer kan deretter brukes om igjen for behandling agar.
12. Fjern overflødig agar fra broene når tørre. Legg 60 ml vann til 40 ml reserve-løsning og plassere broene i lagringsløsningen.

4. Cut-open Rig Forberedelse

1. Slå på vannkilde for temperaturregulatoren og deretter strømbryteren til temperaturregulator. Vent inntil badtemperaturen har nådd den angitte temperatur (19 ° C).
2. Trekk microelectrodes fra borsilikat kapillarrør med en microelectrode avtrekker til en motstand på 0,2-0,5 MΩ.
   Merk: Senking pipette motstand forbedrer klem hastighet. Men lavere motstand pipetter er mer sannsynlig å skade eggcelle. Eksperimentering er nødvendig for å finne den beste pipette motstand verdi for hvert program.
3. Klargjør saponin løsning ved å blande 0.125 g tørr saponin med 50 ml av intern løsning. Dette vil føre til en 0,25% løsning. Vend forsiktig for å blande.
4. Under et disseksjonsmikroskop anvende en liten mengde vaselin rundt kanten av hullet på oversiden av den midtre kammer og bunnsiden av det øvre kammer med en meget spiss gjenstand.
   Merk: "smultring" vaselin vil bidra til å holde oocyte på plass over hullet, og vil hjelpe til med dannelsen av forseglingen. Men for mye vaselin vil felle bobler og forhindre at løsningene fra å nå eggcelle overflaten.
5. Tilsett 3 M KCl-løsning inn i manifold-spor som holder Ag / AgCl pellets, slik at det ikke er noen overflyt fra sporene, men pelletene og bro ben ender er vikred. Rydd opp ekstra KCl dråper for å hindre uønskede elektriske forbindelser mellom spor.
6. Legg ekstern løsning til de nedre og midtre bade kamre.
7. Plasser agar broer i sporene i den AgCl pellet manifold slik at det ene beinet per brua er i hvert spor. Den andre etappen av broene vil senere bli lagt inn i de respektive kamre (P1, P2, CC topp, GS1, GS2 midten (vakt), jeg nederst). Sørg for at platina trådbroer er i GS2, P2, og jeg spor.
   Merk: Sørg for broer er vasket med destillert vann og helt tørr før du setter inn i kammeret bad.
8. Slå på datainnsamlingssystemet og PC. Start innspillingen programvare.

5. Cut-open Prosedyre

1. Installer de øvre og midtre oocytten kamre uten en eggcelle. Skyv øvre kammer utenfor midten, slik at hullene i de to kamre ikke overlapper hverandre. Fyll alle kamrene med ekstern løsning og plassere alle elektrodene i sine respektive kamre.
   Merk: Ikke press den øverste kammer helt ned når du installerer kamrene. Sørg for at en svært liten åpning forblir mellom de to kamrene. Den ikke-sentrert arrangement øker motstanden av kammersystem for bedre å simulere nærværet av en celle. Denne prosessen, som kalles "balansere broene", kompenserer for de gjenkjøps potensialer som kan oppstå fra inhomogeneity blant agar broer.
   1. Slå av ekstern kommando og begge klemmene. Sjekk den aktuelle lese på forsterkeren. Juster med en liten skrutrekker P utlignet på baksiden av bad / vakt head-scenen til null strøm.
   2. Slå bad / vakt bryteren på forsterkeren til aktiv og justere GS offset for å få null strøm.
   3. Gjenta mellom "aktive" og "passive" inntil begge er rimelig nær null (<100 nA).
2. Fjern den øverste kammer og overføre en eggcelle inn i midten bad kammeret ved hjelp av en pipette pumpe. Kontroller at oocyte er plassert over hullet i midten av badet.
   Merk: Når du forbereder en eggcelle for VCF, plassere den merkede cellen inn i kammeret med dyret polet (mørkere side) vendt oppover. Cell orientering spiller ingen rolle om VCF ikke blir utført.
3. Fjern overskudd eksterne løsningen fra bunnen badekaret ved hjelp av en aspirator for å opprette en tetning mellom oocyte-og badeoverflaten.
4. Plasser toppkammer badekaret over oocyte slik at hullet i kammeret er sentrert på toppen av oocytten. Ved hjelp av en tommel og langfinger, langsomt press ned på kammeret inntil den er presset tett mot den oocyte kåret for å vise bare en liten del av membranen til den øvre badekaret gjennom hullet.
   Merk: eggcelle kan bule under press fra toppen kammer. Ikke bruk for mye kraft til toppen kammer, da dette vil føre til at eggcelle til å sprekke. Pinsett tips plassert på diagonale hjørner av den øverste kammer kan brukes som et alternativ til fingrene for å Apply press nedover.
5. Legg ekstern løsning til de øverste og nederste bad til de er nesten full.
6. Plasser de frie ben av de agar broer i den eksterne oppløsning av hvert bad som sett i figur 2 (bro emisjon). Sørg for at hver bro hviler i sin korrekte bad plassering. (Jeg bro i bunnen bad, GS1 og GS2 broer i midten bad, og P1, P2, og CC broer i øvre bad). Slå bad / vakt bryteren på forsterkeren til aktiv.
   Merk: Sørg for at det ikke er noen 3 M KCl forbindelser mellom broene, sine brønner, og opptaks kamre. Videre sørge broer er formet slik at de er hevet over innspillingen kammer løsninger.
   
   Figur 2. Agar Brooppsett Sted Diagram. Placement plasseringen av de frie endene av agar broeri de ulike bad. Klikk her for å se større bilde .
7. Start en testprotokoll i innspillingen programvare. Hvis puls viser vertikale forskyvning av den horisontale delen mellom de to toppene ved å anvende en 100 mV puls som er større enn 100 nA (svarende til 0,3 MΩ med bad / vakt i passiv) deretter øke tettheten av badet dekselet. Se figur 3 for et eksempel på en ideell testpuls.
   Merk: Testprotokollen avgir en spenningspuls for å se om badekaret dekselet er stram nok, og alle komponenter er montert korrekt. Alternativt kan test-funksjonen av forsterkeren brukes.
   
   Figur 3. Ideell Test Pulse fra Recording Software. Testen pulsbør ligne på den ovennevnte puls, avhengig av protokollen som brukes. Beholdningen Strøm (midten baseline) bør være nær null. Klikk her for å se større bilde .
8. Fjern den utvendige oppløsning i bunnen bad og erstatte med saponin løsning. Vær nøye med å unngå å skape bobler mens legge saponin. For å sikre maksimal erstatning, anvende suging på den motsatte ende av den nederste bad mens tilsetning av løsningen.
9. Etter saponin løsningen har blitt lagt til, observere gjentatt testen puls. Hvis toppen av forsøksprotokollen reduseres eller forsvinner så er dette et tegn på at det er en boble som er plassert under oocyte. I dette tilfellet er fullstendig fjerne saponin løsning og deretter erstatte den.
   Merk: Permeabilization er vanligvis fullstendig i løpet av 30 sekunder med friskt saponin løsning. Løsningene kan ha problemer med å nå cellen hvis det er fanget boblereller hvis follicular lag forblir på en dårlig fordøyd eggcelle. Eggcelle har blitt permeabilized (åpnet) når skråningen av spenning pigg avtar (økning i tid konstant av forfall).
   
   Figur 4. Testpuls Traces Under oocytter Permeabilization. Utvalgte rester fra testpulsprotokoll etter en 0,25% saponin oppløsning ble ført inn i bunnen oocytten kammeret. Økningen av tiden konstant av forfall sett i sporene viser en økning på eggcelle permeabilization. Klikk her for å se større bilde .
10. Når cellen er permeabilized, fjerner saponin løsning og badet fylles med intern løsning. Stopp testprotokollen.
    Merk: Selv om saponin gir tilgang tilindre av cellen ved permeabilizing membranen, er ekvilibrering av de ion-konsentrasjoner mellom den nedre bad og cytoplasma av oocytten ved diffusjon en meget langsom prosess. Denne prosess kan kreve titalls minutter, avhengig av forholdene (figur 5).
11. Sjekk for eventuelle høye nivåer av løsningen i bad og krystallisert KCl mellom brønnene av manifolden da disse kan forårsake kortslutning og uberegnelig oppførsel.
12. Bruk den modifiserte sprøyte å injisere 3 M KCl inn en microelectrode. Flick mikroelektroden flere ganger med én finger, mens avstivning med de andre fingrene.
    Merk: Dette trinnet er nødvendig for å fjerne eventuelle luftbobler i microelectrode.
13. Monter KCl-fylte elektroden på mikromanipulator armen ved å sette inn wiren filamentet inn i det åpne microelectrode ende. Skyv enden av microelectrode inn filament holderen og kontroller at elektroden er ikke løst. Stram elektroden lås.
    Merk: Make på at ledningen har en enda AgCl belegg for elektroden til å fungere normalt.
14. Sving armen på plass over eggcelle bad og stram klemmene for å hindre ytterligere bevegelse arm.
15. Ved hjelp av manipulatoren knotter, gå elektroden ned i badekaret. Pass på at ingen test puls er brukt og at membranen test funksjonen er ikke aktivert på dette punktet.
    Merk: Før elektrodespissen føres inn i væsken, V1-V2 på spenningsklemmen vil lese en positiv spenning. Når elektrodespissen føres inn i væsken, bør spenningsmåleren på spenningsklemmen endres til en verdi nær null. For VCF opptak, må elektroden å nærme cellen på et relativt grunt vinkel for å gi rom for målet. Impaling cellen med elektroden utenfor midten, nærmere kanten av den isolerte membran patch hjelper også til å unngå kollisjon med det formålet med elektroden.
16. Stopp vandre elektroden ned. Innstill offsetpotensialet til null ved å trykke på knappen for V1 og deretter redusere V1 spenningen til null ved å justere V1 offset. I tillegg utfører den samme justering for V2. Potensialforskjellen V1-V2 bør lese 000 mV.
    1. Bytt tilbake til V1 og slå Z-test på å måle elektrodemotstand. Verdien vil gradvis falle og nærme seg den faktiske motstand. Målet for en motstandsverdi på 0,2-0,5 MΩ.
17. Fortsett å gå elektroden ned mot synlig lapp av eggcelle i øverste bad. Når mikroelektroden er svært nær oocyte, se V1-V2 lesing å se når elektroden kommer inn i oocytt; V1-V2 spenning vil bli negativ når mikroelektroden kommer inn i cellen.
    Merk: Verdien som vises på dette punktet er det membranpotensialet av cellen, og vil bli påvirket av de kanalene som uttrykkes og de løsninger som brukes. Innsetting av mikroelektroden for langt vil skade cellemembranen.
18. Åpne datainnsamling protokollen iinnspillingen programvare.
19. Vend på klemmen bryteren på spenningsklemmen og juster potensial til å matche kommando (f.eks -100 mV) ved å justere rattet ligger på "I" heads.
20. Vend på kapasitans og motstand kompensasjon bryteren.
21. Flip "Test" slå på i "Kommandoer" region av spennings-klemme. Bruk oscilloskop for å visualisere signalet. Juster Cm kompensasjon knottene i signal-condition-segmentet for å redusere de kapasitive transienter på oscilloskop. Ikke over-kompensere toppene til et punkt der ytterligere omvendt topper oppstå eller toppene begynner å utvikle en sigmoidal kurvatur, som kan introdusere gjenstand i opptaket.
22. Når kapasitans er manuelt redusert til et tilfredsstillende nivå, slå av testbryter.
23. Påbegynne data innspillingen protokollen i innspillingen programvare.

6. Opprydding

1. Når opptakene har been ferdig, slå av alle de forskjellige bryterne på spenningsklemmen inkludert klemmen og bad / vakt brytere.
2. Bruk pinsett for å fjerne de agar broer fra de forskjellige bad.
3. Fjern den øverste bad og aspirer alle løsningene og eggcelle fra alle bad.
4. Bruk en flaske med avionisert vann for å skylle alle bad og deretter aspirer bad med et vakuum. Gjenta dette trinnet 3-5x.
5. Tørk krystallisert KCl av broene og plassere broene i lagringsløsning. Broer kan brukes om igjen i mange uker, så lenge de er riktig lagret.
6. Aspirer KCl-løsning fra manifolden brønnene og skyll manifold med avionisert vann flere ganger.
7. Slå av alt diverse utstyr inkludert temperaturkontroll og innspillingen programvare.

7. Tilsetting av Voltage Clamp fluorometri

1. Følg fremgangsmåten i del 1 til 6 i en tidligere utgitt Jove protokoll ¹⁶ Examining den conformational Dynamics av membran proteiner in situ med nettstedet styrt fluorescens Merking: Klikk her for å vise siden.
2. Utfør trinnene i § 4 gjennom 5,22 av den nevnte COVG protokollen ved hjelp av en VCF mikroskop satt til 4X fokus.
   Merk: VCF opptak krever større eggcelle bade kamre enn nødvendig i COVG målinger. (Målene på de tilpassede VCF kamrene er plassert i materialer listen.) Dette større VCF kammeret må være i stand til samtidig imøtekommende objektiv, microelectrode, og agar broer. I tillegg dyret polet (mørke siden av eggcelle) må være vendt oppover i kammeret for lav bakgrunns VCF innspillinger.
3. Bring den øverste delen av oocytten i fokus ved hjelp av en vann-nedsenking 40X objektiv.
   Merk: Bytte fra 4X til 40X objektiv krever en bestemt geometry av cut-åpen komponenter og forsiktig oppmerksomhet for ikke å treffe elektrode, broer eller kamre når senke 40X objektiv. Videre, på grunn av det økte volum i toppvern, sørge for at badet volumet fra toppen beskyttelsen ikke er forbundet med den midtre beskyttelsen når 40X objektiv er satt på plass.
4. Fokus på en ring rundt omkretsen av den eksponerte eggcelle overflaten, slik at toppen av eggcelle er litt over fokusplanet.
   Merk: Justering i xy-planet kan være nødvendig, slik at synsfeltet er stort sett fylt med membranen og ikke i kammeret. XY oversettelse oppnås lettest ved plassering av mikroskopet på en oversettelse scenen.
5. Beveg terning filteret inn i den optiske bane og bryter lysbanen fra okularet til detektoren (diode).
6. Slå på VCF lyskilde.
7. Slå av lamper, fiber lys lyset, og andre lyskilder.
   Merk: Ideelt sett VCFopptak bør utføres i en fullstendig mørkt rom.
8. Kjør en fluorescens-protokollen i innspillingen programvare.

Representative Results

Fig. 4 viser endringen i permeabilitet av oocytten som et saponin oppløsning påføres den nedre del av oocytten. Figur 5 viser graden av det intracellulære løsning utveksling ved diffusjon etter saponin permeabilization. 20-40 min er pålagt å komme til en steady-state ^2,18.

Figur 6A viser spor som er generert fra opptaks protokollen. Figuren viser ioniske strømmer (etter P/-8 lekkasje subtraksjon) som reaksjon på spenningsprotokollen (innfelt). Hvert spor i figuren representerer forskjellig påtrykt spenning. Sporene med tregeste kinetikk representerer de laveste potensialer hvor natriumkanalen kan åpnes. Vanligvis, ved hjelp av tradisjonelle metoder, er det vanskelig å opprettholde spenningsstyring for disse lavere potensialer, fordi den indre strøm depolarizes membranen. Denne depolarisering igjen aktiverer flere kanaler skape en positiv tilbakekoplingssløyfe . Den forbedrede klemme hastigheten av kuttet åpen teknikk muliggjør spenningskontroll kreves for opptak av kanalen selv ved disse vanskelige potensialer.

Figur 6B viser strøm / spenningskurve, som ble generert fra sporene i figur 6A. Uten spenning kontroll nevnt ovenfor, toppspenningen tidligst potensialer (~ -60 mV) ville være overvurdert. Dette vil forhindre at en nøyaktig beskrivelse av den aktuelle spenningsforhold.

Figur 7 viser et eksempel på spennings-klemme fluorometri resultater for en oocytt. Fluorescens signalene ble registrert fra en eggcelle merket med MTS-TAMRA på en cystein satt i posisjon 805 i DII domenet til den menneskelige hjertenatriumkanalen Na _V 1.5.

_upload/51040/51040fig5.jpg "width =" 500px "/>
Figur 5. Kinetikk av Cytoplasmatisk Na ⁺ Konsentrasjon Endring ved diffusjon. Frekvensen av interne oppløsning ekvilibrering ble vurdert ved å anvende 90 mM Na ⁺ i både de ytre og indre sider av cellen og deretter måling av Na ⁺ reversering potensial ved innspilling IV forhold hvert 2 min. Hvis det interne miljøet var perfekt erstattet, ville E _rev være 0 mV. Tid målingene ble startet da saponin permeabilized eggcelle membran. Klikk her for å se større bilde .

Figur 6. Wild Type Na _v 1.5Sodium Kanal Resultater fra Cut-Open Spenning Klem. (A) Spor av innspilt strøm fra ulike stimuli spenninger fra et holdingselskap potensial på -80 mV ned til -120 mV for 100 msek, testen puls (-120 mV til 40 mV i 10 mV trinn) i 200 msek, og til slutt repolarizing til -120 mV. (B) Den IV kurve, som representerer spenningen-avhengighet av peak strøm i panel A. Her toppspenningen for pulser opp til 60 mV vises. Klikk her for å se større bilde .

Figur 7. Na _v 1.5 Natrium Channel Voltage Clamp fluorometri Recordings. (A) Ionisk strømmer opp fra en eggcellemerket med MTS-TAMRA på en cystein satt i posisjon 805 i DII-S4 domenet til den menneskelige hjertenatriumkanalen Na _V 1.5. Spenningsimpulser som spenner fra -170 mV til 70 mV ble brukt i 20 mV trinn for en varighet på 20 msek etter en prepulse til -120 mV. (B) De tilknyttede fluorescens signaler. Annenhver fluorescens spor er utelatt for klarhet. Af / F representerer den relative endring av fluorescensintensiteten indusert av spenningspulsen. for å vise større bilde .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
External Solution	Brand	Catalog Number	[Final], weight, or volume
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	25mM
MES Sodium Salt	Sigma-Aldrich	M5057	90mM
HEPES	Research Products International	H75030	20mM
Calcium hydroxide	Sigma-Aldrich	239232	2mM
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Internal Solution
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	105mM
MES Sodium Salt	Sigma-Aldrich	M5057	10mM
HEPES	Research Products International	H75030	20mM
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E4378	2mM
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Depolarizing Solution
KCl	Sigma-Aldrich	221473	110mM
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266	1.5mM
Calcium Chloride	Caisson	C021	0.8mM
HEPES	Research Products International	H75030	10mM
Pipet Solution
KCl	Sigma-Aldrich	221473	3M
Saponin Solution
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	0.125g
Internal Solution	See above		50mL
Agar Bridge Solution
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	100ml of 1M
HEPES	Research Products International	H75030	1.2g
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Granulated Agar	Research Products International	A20250	3%
NMDG Storage Solution
NMDG, HEPES, MES Hydrate solution	see above		40ml
Water			60ml
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
High Performance Oocyte Clamp	Dagan	CA-1B
Data Acquisition System	Axon CNS	Digidata 1440A
Oscilloscope	Tektronix	TDS 210
Rack Power Filter	APC	G5
Heating/Cooling Bath Temperature Controller	Dagan	HCC-100A
PC	Dell	Optiplex 990
pCLAMP 10.3 Voltage Clamp Software	Molecular Devices, LLC	pCLAMP10.3
TMC Vibration Control TableTop Platform	TMC	64 SERIES
TMC Vibration Control Air Table	TMC	20 Series
V1/I Electrode Data Collector	Dagan	part of CA-1B
MX10L Micromanipulator	Siskiyou	MX10L
Bath/Guard (I/V) Headstage (with appropriate connectors)	Dagan	part of CA-1B
Microscope	Omano	OM2300S-JW11
Temperature Control Bath	Custom or Dagan	Custom or HE-204C	Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). Dagan also provides a prefeabricated stage (HE-204C).
Custom AgCl Pellet Container	Custom	Custom	Custom machined
Ag/AgCl electrode, pellet, 2.0 mm	Warner	E-206
External Oocyte Bath	Custom or Dagan	Custom or CC-1-T-LB	Custom machined or purchased from Dagan
Internal Oocyte Bath	Custom or Dagan	Custom or CC-TG-ND	Custom machined or purchased from Dagan
Capillaries for Agar Bridges and Pulled Electrodes	Warner	G150T-4
Rotatable Mounts for the Microscope, Micromanipulator, and Bath	Siskiyou	SD-1280P
Fiber-Lite	Dolan-Jenner	LMI-600
Regular Bleach	Clorox	470174-764
Xenopus laevis Oocytes	Nasco	LM535M (sexually mature females)
90 Na+ External Solution	See Solutions sheet
10 Na+ Internal Solution	See Solutions sheet
3 M KCL	See Solutions sheet
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
NMDG Storage Solution	See Solutions sheet
5mL transfer pipets	SciMart	GS-52
Modified KCl electrode injector	BD	309659	Plastic syringe tip melted to allow for injection of solution into electrodes. Alternatively, a Microfil by WPI can be purchased.
Microvaccum	Custom	Custom
Forceps	VWR	63040-458
Oocyte Handling Tools (Pipette Pump)	VWR	53502-222
Deionized Water Squirt Bottle	VWR	16649-911
Vaseline Petroleum Jelly	Fisher Scientific	19-086-291
Additional Materials Required for VCF Recordings:
VCF Microscope	Nikon	Eclipse FN1
Nikon CFI APO 40XW NIR Objective	Nikon	N40X-NIR
X-Y Translator System for Fixed-Stage Upright Microscopes	Sutter Instruments	MT500-586
External VCF Oocyte Bath	Custom		Custom machined. The chamber dimensions are 2.7 x 1.9 x 0.4 cm.
Internal VCF Oocyte Bath	Custom		Custom machined. The chamber dimensions are 1.6 x 1.6 x 0.4 cm.
Modified Temperature Control Bath	Custom		Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). The chamber dimensions of the modified temperature controller bath are 2.7 x 1.9 x 0.3 cm for the horizontal chamber, and 1 x 2.5 x 0.5 cm for the vertical chamber.