Summary
De structuur van neuronale netwerken begrijpen, functionele en morfologische karakterisering van individuele neuronen is een noodzaak. Hier tonen we juxtasomal biocytine etikettering, die elektrofysiologische opnames maakt in de extracellulaire configuratie, maar met behoud van de mogelijkheid om intracellulair het etiket van de neuron voor post hoc reconstructie van dendritische en axonale architectuur.
Abstract
De cerebrale cortex kenmerkt door meerdere lagen en vele verschillende celtypen die samen een netwerk zijn verantwoordelijk voor veel hogere cognitieve functies zoals besluitvorming, sensorisch-geleide gedrag of geheugen. Om te begrijpen hoe dergelijke complexe neuronale netwerken verrichten van dergelijke taken, een cruciale stap is om de functie (of elektrische activiteit) van individuele celtypen binnen het netwerk te bepalen, bij voorkeur wanneer het dier voert een relevante cognitieve taak. Bovendien is het even belangrijk om de anatomische structuur van het netwerk en de morfologische structuur van de individuele neuronen om reverse engineering de corticale netwerk bepalen. Technische doorbraken die vandaag beschikbaar zijn maken het mogelijk opnemen van cellulaire activiteit in wakker, gedragen dieren met de waardevolle optie van post hoc identificeren van de opgenomen neuronen. Hier tonen we de juxtasomal biocytine labeling techniek, die opname actie potentiometer impliceertal pieken in de extracellulaire (of losse-patch) configuratie met conventionele patch pipetten. De juxtasomal opnameconfiguratie relatief stabiel en toepasselijk over gedragsvoorwaarden, zoals verdoofd verdoofd, wakker-kop vast, en zelfs in de vrij bewegende dieren. Aldus is deze methode kan legen celtypespecifieke actiepotentiaal spiking in dierlijke gedrag reconstructie van de individuele neuronen en uiteindelijk de gehele corticale microschakeling. In deze video manuscript, laten we zien hoe individuele neuronen in de juxtasomal configuratie met biocytine in de-urethaan verdoofde rat voor post-hoc-identificatie en morfologische reconstructie kan worden bestempeld.
Introduction
Neuronale netwerken bestaan uit meerdere celtypes, gekenmerkt door zeer specifieke morfologische en fysiologische eigenschappen 1-7. Bijgevolg individuele celtypen voeren specifieke taken binnen het netwerk (zie bijvoorbeeld GENTET et al.. 8 en Burgalossi et al.. 9). We nu pas beginnen te celtype-specifieke functies te begrijpen over neuronale netwerken en veel is nog te ontdekken. Hiervoor zijn veel laboratoria uitvoering experimentele benaderingen die de analyse van de morfologische eigenschappen van hetzelfde neuronale populatie waaruit fysiologische parameters verkregen 1,10-15 mogelijk. Hier tonen we juxtasomal etiketteringstechniek 16,17 die elektrofysiologische opnames gaat met conventionele patch pipetten in de extracellulaire (dus invasief) configuratie in combinatie met elektroporatie van de opgenomen neuron met biocytine. Degrote voordeel van deze benadering is dat de invasieve aard zodat actiepotentiaal stekelige individuele neuronen wordt opgenomen zonder dat (bijvoorbeeld dialyse) de intracellulaire inhoud van de cel. Gevolgd door elektroporatie, de juxtasomal aanpak biedt de mogelijkheid van post hoc identificatie en reconstructie cel functie (fysiologie) te koppelen aan de structuur (morfologie). Typisch morfologische reconstructie omvat reconstructie van dendritische en axonale morfologie die kan worden uitgebreid voor kwantificering van de wervelkolom en / of bouton dichtheden of reconstructie van neuronale morfologie bij nanometerresolutie middels elektronenmicroscopie. De juxtasomal opnametechniek kan worden gebruikt voor in vivo opname van diverse celtypen in corticale lagen of sub-corticale gebieden in een aantal soorten, hoewel de meeste studies de techniek hebben toegepast in kleine knaagdieren zoals muizen of ratten. Ons onderzoek is gericht op het opnemen en labelen van neuronenvan de rat primaire somatosensorische cortex (S1) en het gaat om visuele identificatie van opgenomen neuronen 18, dendritische reconstructies in combinatie met nauwkeurige registratie in een gestandaardiseerde referentiekader te reverse engineeren corticale netwerken 4,19 en gedetailleerde reconstructie van axonalestructuur tot celtype-specifieke lokale kenmerken en lange afstand projectie richt 20.
Vergeleken met andere in vivo opnametechniek (intracellulair of hele-cel), juxtasomal opnamen zijn relatief stabiel en kunnen daarom worden toegepast op gedragstoestanden inclusief narcose 21,22, verdoofd 14, wakker-kop vast 23 of zelfs vrij bewegende dieren 9 . Hier tonen we juxtasomal etikettering S1 van een urethaan verdoofde rat, hoewel we benadrukken de algemene toepasbaarheid van deze techniek om veel voorbereidingen van keuze.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van de Animal
Alle experimentele procedures worden uitgevoerd in overeenstemming met de Nederlandse wet en na evaluatie door een lokale ethische commissie uitgevoerd aan de Vrije Universiteit Amsterdam, Nederland.
- Verdoven een Wistar rat (P25-P45, ♂ / ♀) met isofluraan (2-3% zuurstof) en vervolgens met urethaan (20% in 0,9% NaCl, 1,6-1,7 g / kg) door intraperitoneale injectie. Beoordelen van de diepte van de anesthesie door monitoring snuifje terugtrekking, ooglid reflexen en vibrissae bewegingen.
- Dien een bijkomende dosis van urethaan (10% van de aanvangsdosis) wanneer het dier onvoldoende verdoving diepte bereikt of wanneer vibrissae samentrekkingen tijdens het experiment worden waargenomen.
- Plaats de verdoofde dier op de stereotaxisch frame uitgerust met een verwarmingselement, plaatst rectale temperatuur sonde en de lichaamstemperatuur van het dier te handhaven op 37,5 ± 0,5 ° C door een verwarmingselement.
- Injecteer 100 ui 1% lidocaïne (0,9% NaCl) subcutaan lokale verdoving op de gebruikslocatie en wacht 3-5 minuten. Verwijder de huid die het oppervlak van de schedel door te snijden in de caudale naar rostraal richting en reinig het restmateriaal.
- Reinig de schedel uitgebreid met 0,9% NaCl en absorberende doekjes.
- Bepaal de coördinaten van het doelgebied op de linker hersenhelft (voor de primaire somatosensorische cortex (S1): 2.5 mm achter en 5,5 mm lateraal van bregma). Markeer de locatie op de schedel met een chirurgische huid marker pen.
- Schraap het been zachtjes door een tandartsboor van het van belang zijnde tot het bot wordt transparant en bloedvaten zijn duidelijk zichtbaar.
- Voeg een 0,5 mm x 0,5 mm craniotomie door het snijden van een venster in de verdunde schedel met een scalpel (# 11), schade aan de dura mater vermijdenen bloedvaten. Optioneel: markeer de randen van de craniotomie met behulp van een chirurgische huid marker pen om de zichtbaarheid te verbeteren.
- Breng een dun laagje van superlijm op de droge schedel en vervolgens tandheelkundige cement om een bad (dwz opname kamer) omsluit de craniotomie construeren.
- Knip de snorharen aan de contralaterale zijde precies 5 mm van de snorhaar follikel. Optioneel: markeer de getrimde snor met zwarte mascara.
2. Juxtasomal Recordings en biocytine Labeling
- Maak patch pipetten van borosilicaatglas met binnenkant tip diameter van ~ 1 micrometer om elektroden te verkrijgen met 3-5 MQ weerstand. Opmerking: De ideale pipet morfologie voor de juxtasomal opname is een geleidelijke slank taper, een lage kegel hoek, en een ~ 1 micrometer tip (figuur 1).
- Afhankelijk van de opname diepte (ten opzichte van het pial oppervlak), moet de conische afmetingen van de registratie-elektrode worden aangepast. Kritisch belang is dat thij taper diameter moet kleiner zijn dan 75 micrometer zijn op het punt van binnenkomst in de hersenen om mechanische schade of stress om de opname te ontwijken. Dit geeft aan dat voor oppervlakkige corticale opnamen, een tapsheid van 300-500 urn met een buitendiameter van maximaal 75 urn is vereist (figuur 1A) dat opnamen van relatief diepe corticale lagen vereisen een langere tapsheid van 1,500-1,800 um, opnieuw met maximale buitendiameter diameter van 75 micrometer (bij 1.800 micrometer van de elektrode tip).
- Laad de patch pipet met een normale rat bel (NRR) aangevuld met 2% biocytine (zie tabel 1 voor oplossingen en reagentia) en monteer de patch pipet op een micromanipulator vaste hoofd podium.
- Stel de hoek van de elektrodehouder tot 34 ° ten opzichte van het sagittale vlak specifiek gericht kolom D2 rat S1.
- Sluit de hoofd podium op een versterker in bridge-modus (dwz stroomtang).
- Plaats de pleisterPipetteer in de nabijheid van de craniotomie. Vul het bad met 0,9% NaCl en bepaal de elektrode weerstand die dient tussen 3-5 MQ, bepaald door een vierkant puls met positieve stroominjectie (1 nA 200 msec aan / uit).
- Vaststellen overdruk van 100-150 mbar en vooraf de patch pipet in 1 micrometer stappen terwijl die positieve stroom als vierkante pulsen (1 nA, 200 msec aan / uit). Monitor de robuuste weerstand verandering bij het leggen van contacten met de dura mater. Op dit punt, stelt u de coördinaten van de micromanipulator om 'nul' om nauwkeurige diepte metingen mogelijk te maken.
- Advance in 1 micrometer stap-modus totdat de patch pipet dringt de dura mater aangegeven door een plotselinge daling van de weerstand elektrode. Verwijder het bedrijf druk van de pipet.
- Zoek naar afzonderlijke eenheden en bevordert tegelijk in 1 micrometer stappen. Bewaken van de elektrode weerstand continu door het toepassen van 200 msec aan / uit pulsen. Een toename elektrode weerstand typically geeft de nabijheid van een neuron. Vooraf de elektrode tot positieve actiepotentiaal (AP) golfvormen van ~ 2 mV worden geregistreerd (Figuren 2A en 2B).
- Optioneel: Noteer de spontane stekelige patroon van het neuron en bepaal-whisker opgeroepen door spiking bijvoorbeeld caudaal afbuigen individuele bakkebaarden 200 msec onder een hoek van 3,3 ° met een piëzo-elektrische inrichting 18.
- Vooraf de elektrode totdat de weerstand 25-35 MQ en spikes hebben amplitudes van 3-8 mV tot optimale omstandigheden van juxtasomal vulling te verkrijgen. Start de juxtasomal vullen door toepassing vierkante pulsen van positieve stroom (1 nA, 200 msec aan / uit). Langzaam en geleidelijk verhogen van de huidige stappen van 0,1 nA terwijl het toezicht op de AP golfvorm en frequentie (Figuren 2A en 2B).
- Bewaak het membraan opening als een duidelijke toename van de AP frequentie tijdens de on-fase van het blok puls (figuur 2C (figuren 2C en 2D). Aanvullende parameters zijn onder meer geluid of een kleine (1-5 mV) negatieve DC verschuiving.
- Verhogen of te verlagen van de huidige (1 nA) tijdens het vullen van een stabiele biocytine infusie behouden. Verminder of stop de stroompulsen bij plotselinge toename van de AP frequentie toxiciteit vermijden door overmaat instroom van extracellulaire ionen zoals natriumionen. Opmerking: elk neuron zal anders reageren op de huidige injectie en juxtasomal etikettering parameters moeten worden aangepast afhankelijk van de individuele opname-omstandigheden.
- Nauw het signaal volgen na het stoppen van de huidige injectie. De spike golfvorm na een vulling sessie wordt meestal verbreed en toont een sterk gereduceerd na hyperpolarisatie. Wacht tot het herstel van het neuron, dat is duidelijk wanneer de piek golfvorm terug naar zijn oorspronkelijke eigenschappen (dwz de aanwezigheid vannormaal na-hyperpolarisatie, figuur 2).
- Herhaal biocytine vullen sessies na volledig herstel van het neuron te biocytine belasting voor betere kleuring kwaliteit te verhogen.
- Trek de patch pipet in stappen van 1 micrometer tot de piek amplitude afneemt aan mechanische stress te verminderen naar de cel. Wacht minstens 1 uur voor de biocytine om intracellulair te verspreiden terwijl nauwlettend controle van de lichaamstemperatuur van het dier en de ademhaling.
3. Perfusie van het dier en de hersenen verwijderen
- Bereid de perfusie setup, spoelen, en preload de buis met 0,9% NaCl.
- Plaats het dier op een chirurgische dienblad en beveiligen met standaard etikettering tape. Zorg voor voldoende diepte van de anesthesie, voet knijpen en ooglid reflexen moeten afwezig zijn.
- Voeg een mediaal incisie (5-6 cm) lateraal door de buikwand net onder de ribbenkast en vervolgen in posterieure anterieure richting het borstbeen bloot.Trek het borstbeen naar voren en de lever zorgvuldig scheiden van het middenrif.
- Voeg een kleine incisie in het membraan, dwars door de onderste ribben en blijven de incisie langs de gehele lengte van de buikholte naar het hart bloot.
- Verwijder het pericardium.
- Steek de naald in de linker ventrikel en een insnijding in het rechter atrium. Perfuseren met 0,9% NaCl (~ 8 ml / min) tot ontkleuring van de lever is voltooid.
- Schakel de infusie tot 4% paraformaldehyde (PFA) tot stijfheid van voorpoot en onderkaak is duidelijk.
- Onthoofden de rat met behulp van een schaar
- Verwijder het resterende nekspieren en de schedel volledig bloot.
- Plaats de schaar in de hersenstam aan de rugzijde en snijd het bot voorzichtig langs de pijlnaad, het handhaven van de dorsale positie.
- Verwijder de beenderen aan beide zijden van de pijlnaad de hersenen bloot behulp van een tang. Verwijder de dura zorgvuldig d voorkomenAmage.
- Steek voorzichtig een botte spatel om de ventrale zijde van de hersenen en verwijder de hersenen zachtjes.
- Post-fix het hele brein overnachting in PFA bij 4 ° C. Schakel de hersenen 0,05 M fosfaatbuffer (PB) en bewaar bij 4 ° C.
4. Het snijden van de hersenen in Tangential Secties
- Neem de hersenen uit de 0,05 M PB en zet het op een filter papier dat naar anterior. Gebruik een scherp scheermesje af te snijden van de kleine hersenen langs het frontale vlak en scheid de hersenhelften door te snijden langs het midden van de sagittale vlak.
- Solliciteer secondelijm op de montageplaat en monteer de linker hersenhelft op haar sagittaalvlak met anterior naar rechts. Bevestig de montageplaat onder een hoek van 45 ° op een vibratome en dompel de hersenen in 0,05 M PB.
- Bevestig een scheermesje op vibratome en zorg ervoor dat het eerste contact met het hersenoppervlak in het midden van de anterieure-posterieure vlak van de halve bol. Snijd 24 100 pmsecties en verzamelen ze in een 24-wells plaat met 0,05 M PB.
5. Histologische Procedures
- Voer histologische protocollen voor het cytochroom oxidase kleuring 24 en de avidine-biotine-peroxidase werkwijze volgens eerder beschreven werkwijzen 25. Optioneel: visualiseer biocytine met fluorescerende avidine / streptavidine-Alexa conjugaten. Hierdoor kan bovendien dubbel-kleuring met retrograde of anterograde tracing technieken.
- Wash secties 5 x 5 min met 0,05 M PB en bereiden 3, 3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)-bevattende oplossing voor het cytochroom oxidase kleuring om vaten visualiseren laag 4 (L4) van S1 (zie Tabel 2 voor oplossingen en reagentia). Incubeer secties 6-12 van de pia in de voorverwarmde oplossing gedurende 30-45 minuten bij 37 ° C.
- Spoel secties met 0,05 M PB voor 6 x 5 min en lessen endogene peroxidase activiteit door incubatie van alle secties in 3% H 2 2 in 0,05 M PB gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Spoel secties met 0,05 M PB voor 5 x 10 minuten. Incubeer secties in ABC-oplossing (zie tabel 3 voor oplossingen en reagentia) overnacht bij 4 ° C.
- Spoel secties met 0,05 M PB voor 5 x 10 min en de voorbereiding van de DAB-oplossing voor de-biocytine gevulde neuron visualiseren (zie tabel 4 voor oplossingen en reagentia). Incubeer secties in gefiltreerde oplossing 45-60 minuten bij kamertemperatuur.
- Spoel secties met 0,05 M PB voor 5 x 10 minuten. Mount hoofdstukken over microscoop dia's en dekglas met Mowiol (zie tabel 5 voor oplossingen en reagentia).
- Bepaal etikettering kwaliteit met behulp van een lichtmicroscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gedetailleerde kennis over 3D structuur van individuele neuronen is van cruciaal belang voor het ophelderen van organisatorische principes van neuronale netwerken. Onze methode houdt in een pijpleiding naar hoge kwaliteit biocytine etikettering bereiken van een in vivo voorbereiding, waardoor post hoc neuronale indeling en de gedetailleerde reconstructie van dendritische en axonale architectuur van enkele neuronen met een hoge resolutie. Afhankelijk van de kwaliteit van juxtasomal etikettering neuronen worden teruggewonnen met verschillende DAB-intensiteiten variëren van zwak tot sterk DAB signalen op posities die nauwkeurig overeenkomen met de opnamelocatie 19,26. In ons lab, een getrainde onderzoeker werkt op een succes-percentage van 30-40% in urethaan verdoofde knaagdieren. Dit geeft aan dat een neuron is geselecteerd voor dendritische en axonale wederopbouw in een van drie experimenten die vervolgens aan de volgende criteria: 1) slechts een neuron ingevuld in de hersenen, 2) uitstekende kwaliteit etiketteren,3) biocytine signaal is constant langs axonale projecties en niet afneemt bij het distale eindes, 4) Cyt C tegenkleuring is succesvol neuronale registratie mogelijk te maken, en 5) geen schade aan de hersenen plakjes tijdens histologie. De beperkende factor is meestal onvoldoende biocytine etikettering, wat betekent dat in ~ 80% van alle experimenten (verdoofd en / of wakker), wordt het opgenomen neuron worden teruggewonnen (soma en dendrieten). Dit volstaat celtype indeling maar niet betrouwbare en volledige reconstructie van het axonalestructuur. In figuur 3 tonen wij twee voorbeelden van biocytine-gelabelde neuronen met DAB signaal na passende juxtasomal etikettering; een stekelige piramidale neuron (Figuur 3A) en een interneuronen (figuur 3B). Reconstructie van aangrenzende tangentiële secties maakt seriële reconstructie volledige neuronale morfologie 18,22,23,27,28 verkrijgen. Bovendien histologische kleuring anatomische referentieframes (bijvoorbeeld inprimaire somatosensorische cortex) laat registreren enkele neuronen gestandaardiseerde referentiekaders 4,19. De twee voorbeelden hier gepresenteerde weerspiegelen optimale omstandigheden te classificeren en vervolgens reconstrueren de morfologische eigenschappen met een handmatige of geautomatiseerde systeem (Figuur 4) 15,20,29-31.
Figuur 1. Elektrode kenmerken voor juxtasomal biocytine etikettering. (A) Elektrode voor juxtasomal opname van corticale neuronen bij 300-500 micrometer diepte ten opzichte van pial oppervlak. (B) elektrode voor juxtasomal opname van corticale neuronen bij 1,500-1,800 um opname diepte. Let op het verschil in lengte tussen conus panelen (A) en (B). (
Figuur 2. Elektrofysiologische eigenschappen tijdens biocytine vullen. (A, B) Spontane actiepotentialen worden waargenomen tijdens de toepassing van vierkante pulsen (200 msec, aan / uit) met positieve stroom, maar met onvoldoende amplitude om de neuron te laden met biocytine. (C) Het verhogen van de huidige amplitude resulteert in het openen van de neuronale membraan waardoor biocytine-loading, zichtbaar in de sporen als fasegekoppelde burst-stekelige tijdens de o on-fasef de pols. (D) De piek golfvorm tijdens het vullen toont een vergrote breedte en verminderde na hyperpolarisatie. Spike amplitude wordt genormaliseerd naar amplitude spike in B voor vergelijking. (E, F) Na succesvolle terugwinning van het neuron na het vullen sessie een normale piek breedte en frequentie worden waargenomen. Spike amplitude wordt genormaliseerd naar amplitude spike in B voor vergelijking. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 3. Biocytine-DAB etikettering van juxtasomally gevuld neuronen in de primaire somatosensorische cortex van urethaan verdoofde ratten. (A) piramidale neuron in tangentiëleuitzicht. Let op de prominente verschil in grootte diameter van dendrieten en axonen. (B) Fast-stekelige interneuron in tangentiële uitzicht. Let op de kralen structuur van de dendrieten en axonen. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 4. Digitale reconstructie van juxtasomally gelabeld neuron. (A) Neuron beeldprojectie met een hoge resolutie (maar lage vergroting) verkregen van 100 micrometer tangentiële plakje laag 6 neuron van de rat primaire somatosensorische cortex met behulp van semi-geautomatiseerde beeldvorming pijplijn. (B) Het zelfde beeld als in (A) met geautomatiseerde digitale reconstructie overlay (axon in blauw, Dendrite in rood, respectievelijk). (C) Beugel box van (B) ingezoomd te illustreren betrouwbaarheid van axonale reconstrueren aan de hand juxtasomal etikettering. Let op de axon Boutons de gehele lengte van het axon, twee boutons worden gemarkeerd door zwarte pijlen. Klik hier voor grotere afbeelding.
| mM | g / ltr | |
| 135 | NaCl | 7,8894 |
| 5.4 | KCl | 0,40257 |
| 1.8 | CaCl | 0,26464 | |
| 1 | MgCl2 | 0,2033 |
| 5 | HEPES | 1,1915 |
| Breng de pH op 7,2 met NaOH | ||
| Voeg 20 mg/ml-1 biocytine |
Tabel 1. Normaal Rat Ringer Aangevuld met biocytine.
| 8 mg | Cytochroom C van equine hart |
| 8 mg | Catalase van runderlever |
| 265 pl | 75 mg / ml DAB |
| Los op in 40 ml 0,05 M PB | |
| Filter en verwarm oplossing bij 37 ° C | |
Tabel 2. Oplossing voor cytochroom C oxidase kleuring.
| 1 druppel | Reagens A |
| 1 druppel | Reagens B |
| 0,5 ml | 10% Triton X100 |
| echts = "21" style = "height: 21px;"> Oplossen in 9,5 ml 0,05 M PB (45 min. van tevoren) | |
| Voeg 410 ul oplossing / goed | |
| Protocol voor het ABC-oplossing voor een 24-well plaat. | |
Tabel 3. Oplossing met Vectastain standaard ABC-kit.
| 265 pl | 75 mg / ml DAB |
| 13.4 pi | 30% H 2 O 2 |
Tabel 4. Oplossing voor DAB-kleuring.
| 6 g | Analytische kwaliteit glycerol |
| 2,4 g | Mowiol 4-88 |
| Handmatig roer 10 min om de vacht Mowiol met glycerol | |
| 6 ml | Gedestilleerd H2O |
| Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur | |
| 12 ml | 0,2 M Tris pH 8,5 |
| Incubeer bij 50 ° C waterbad gedurende 1 uur - O / N, roer af en toe | |
| Centrifugeer 15 minuten bij 5000 xg, hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C | |
Tabel 5. Mowiol oplossing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De juxtasomal methode laat opnemen in vivo actiepotentiaal vastspijkeren van enkele eenheden over gedragsvoorwaarden (verdoofd, wakker-hoofd vast of vrij bewegende) met de optie van-biocytine labelen van de opgenomen neuron voor post hoc celtype classificatie en / of 3D-reconstructie. Het grote voordeel is fysiologische parameters in de extracellulaire (dus invasief) informatie te verkrijgen, maar het kunnen de neuron intracellulair label met biocytine 16,17,32. Naast labeling biocytine Deze techniek kan worden gebruikt om neuronen met DNA, RNA, eiwitten of fluorescente kleurstoffen 33,34 injecteren. De meest duidelijke nadeel van deze benadering is misschien het gebrek aan visuele controle op de etikettering kwaliteit en dus geen middelen zijn om de etikettering kwaliteit tijdens het experiment. Echter, opnameomstandigheden en bijzonder actiepotentiaal vorm worden gebruikt om het succes van de labelingsprocedure beoordelen. Voor instabiliteitnce, de waarschijnlijkheid van het winnen van een neuron met dichte biocytine-DAB label toe wanneer de spiking frequentie tijdens stroompulsen dramatisch toeneemt, vergezeld verdwijnen van de na-hyperpolarisatie en verbreding van de actiepotentiaal golfvorm (zie figuur 2). Bovendien wordt de kwaliteit van biocytine-labeling direct gecorreleerd aan de gesommeerde lengte van de afzonderlijke etikettering sessies, zodat verscheidene lange vulling sessies (> 60 sec) resulteert in een betere histologische kwaliteit in vergelijking met een individu korte vulling zitting (<30 sec) . Tenslotte zal de overlevingstijd voor tracer diffusie kritisch bepalen de etikettering intensiteit van distale compartimenten. In het algemeen is de overleving van 1 uur na hoge-kwaliteit elektroporatie zorgt voor voldoende etikettering van lange-afstands intracorticale axonale projecties. Een voorbeeld van zo'n lange afstand projecties zijn neuronen van de primaire somatosensorische cortex projecteren naar secundair somatosensorische cortex of dysgranularzones dus projecteren naar gebieden die enkele millimeters verwijderd van de etikettering website 4,20. Wanneer axonale projecties van nog grotere afmetingen worden onderzocht (zoals thalamocortical projecties), moet overlevingstijd worden verhoogd 15. Belangrijk om te beseffen is dat elektroporatie van het neuron een diepgaand effect op de fysiologische toestand van het neuron zal hebben als gevolg van overmatige natrium instroom vanuit de elektrode oplossing. Zo is het sterk aanbevolen om vermengen vullen episoden met latente afleveringen de volledige dekking van actiepotentiaal vastspijkeren en toezichthoudende opnameomstandigheden na het vullen sessies wanneer biocytine mag verspreiden langs de dendritische en axonale arborizations 12,31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De authros hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij willen Profs bedanken. Huibert Mansvelder en Bert Sakmann voor uitgebreide ondersteuning, dr. Marcel Oberlaender voor vruchtbare discussies en het verstrekken van neuronale tracing, en Brendan Lodder voor technische ondersteuning. De gegevens werden verkregen met behulp van de ntrode VI voor LabView, genereus geleverd door R. Bruno (Columbia Univ., NY, USA). Dit onderzoek werd gesteund door het Max Planck Instituut en het Bernstein Center for Computational Neuroscience, Tübingen (gefinancierd door het Duitse Federale Ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF; FKZ: 01GQ1002)) (RTN), Center for Neurogenomics and Cognitive Research (CNCR) , Neuroscience Campus Amsterdam (NCA), financiering van CPJdK (NWO-ALW # 822.02.013 en ENC-Network # p3-c3) en de Vrije Universiteit Amsterdam.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SM-6 control system | Luigs Neumann | ||
| LN- Mini 23 XYZ | |||
| LN- Mini 55 Manipulatorblock X2 | |||
| Lynx-8 amplifier | Neuralynx | ||
| Axoclamp-2B amplifier | Axon Instruments | ||
| Osada model EXL-M40 | Osada, Inc. | ||
| Piezoelectric device | Physik Instrumente | PL140.10 | |
| LabView | National Instruments, Austin, TX, USA | LabView acquisition software | |
| Ntrode Virtual Instrument | R. Bruno, Columbia Univ., NY | ||
| Sugi absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
| Cytochrome C from equine heart | Sigma | C2506 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma | C9322 | |
| DAB | Sigma | D5637 | |
| H2O2 | Boom | 7047 | |
| Vectastain standard ABC-kit | Vector | PK6100 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Isoflurane | Pharmachemie | 45.112.110 | |
| Lidocaine | Sigma | L5647 | |
| Simplex rapid dental cement | Kemdent | ACR308/ACR924 | |
| Biocytin | Molekula | 36219518 | |
| PFA | Merck Millipore | 8187151000 | |
| Trizma base | Sigma | T4661 | |
| Mowiol 4-88 | Aldrich | 81381 | |
| Analytical grade glycerol | Fluka | 49767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 31434 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60130 | |
| CaCl | Sigma Aldrich | 22,350-6 | |
| MgCl2 | Fluka | 63072 |
References
- Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr. Opin. Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat. Rev. Neurosci. 14 (3), 202-216 (2013).
- Dean, P., Porrill, J., Ekerot, C. F., Jorntell, H. The cerebellar microcircuit as an adaptive filter: experimental and computational evidence. Nat. Rev. Neurosci. 11 (1), 30-43 (2010).
- Oberlaender, M., et al. Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex. Cereb. Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).
- Dyer, M. A., Cepko, C. L. Regulating proliferation during retinal development. Nat. Rev. Neurosci. 2 (5), 333-342 (2001).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
- Urban, N., Tripathy, S. Neuroscience: Circuits drive cell diversity. Nature. 488 (7411), 289-290 (2012).
- Gentet, L. J., et al. Unique functional properties of somatostatin-expressing GABAergic neurons in mouse barrel cortex. Nat. Neurosci. 15 (4), 607-612 (2012).
- Burgalossi, A., et al. Microcircuits of functionally identified neurons in the rat medial entorhinal cortex. Neuron. 70 (4), 773-786 (2011).
- Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471 (7337), 177-182 (2011).
- Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
- Herfst, L., et al. Friction-based stabilization of juxtacellular recordings in freely moving rats. J. Neurophysiol. 108 (2), 697-707 (2012).
- Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat. Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
- Bruno, R. M., Sakmann, B. Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses. Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).
- Oberlaender, M., Ramirez, A., Bruno, R. M. Sensory experience restructures thalamocortical axons during adulthood. Neuron. 74 (4), 648-655 (2012).
- Joshi, S., Hawken, M. J. Loose-patch-juxtacellular recording in vivo-a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1. J. Neurosci. Methods. 156 (1-2), 37-49 (2006).
- Pinault, D. A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. J. Neurosci. Methods. 65 (2), 113-136 (1996).
- de Kock, C. P., Bruno, R. M., Spors, H., Sakmann, B. Layer and cell type specific suprathreshold stimulus representation in primary somatosensory cortex. J. Physiol. 581 (1), 139-154 (2007).
- Egger, R., Narayanan, R. T., Helmstaedter, M., de Kock, C. P., Oberlaender, M. 3D reconstruction and standardization of the rat vibrissal cortex for precise registration of single neuron morphology. PLoS Comput. Biol. 8 (12), (2012).
- Oberlaender, M., et al. Three-dimensional axon morphologies of individual layer 5 neurons indicate cell type-specific intracortical pathways for whisker motion and. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (10), 4188-4193 (2011).
- Sakata, S., Harris, K. D. Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex. Neuron. 64 (3), 404-418 (2009).
- de Kock, C. P., Sakmann, B. High frequency action potential bursts (>or= 100 Hz) in L2/3 and L5B thick tufted neurons in anaesthetized and awake rat primary somatosensory cortex. J. Physiol. 586 (14), 3353-3364 (2008).
- de Kock, C. P., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (38), 16446-16450 (2009).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Horikawa, K., Armstrong, W. E. A versatile means of intracellular labeling: injection of biocytin and its detection with avidin conjugates. J. Neurosci. Methods. 25 (1), 1-11 (1988).
- O'Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).
- Veinante, P., Deschenes, M. Single-cell study of motor cortex projections to the barrel field in rats. J. Comp. Neurol. 464 (1), 98-103 (2003).
- Boudewijns, Z. S., et al. Layer-specific high-frequency action potential spiking in the prefrontal cortex of awake rats. Front. Cell. Neurosci. 7, 99 (2013).
- Oberlaender, M., Bruno, R. M., Sakmann, B., Broser, P. J. Transmitted light brightfield mosaic microscopy for three-dimensional tracing of single neuron morphology. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064029 (2007).
- Boudewijns, Z. S., et al. Semi-automated three-dimensional reconstructions of individual neurons reveal cell type-specific circuits in cortex. Commun. Integr. Biol. 4 (4), 486-488 (2011).
- Bruno, R. M., Hahn, T. T., Wallace, D. J., de Kock, C. P., Sakmann, B. Sensory experience alters specific branches of individual corticocortical axons during development. J. Neurosci. 29 (10), 3172-3181 (2009).
- Schubert, D. Observing without disturbing: how different cortical neuron classes represent tactile stimuli. J. Physiol. 581 (1), 5 (2007).
- Neumann, E., Kakorin, S., Toensing, K. Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes). Bioelectrochem. Bioenerg. 48 (1), 3-16 (1999).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
