Introduction
La pared celular vegetal tiene una gran cantidad de información dentro de sus diversos componentes: lignina, celulosa, hemicelulosa (xilano, glucuronoxilano, xiloglucano, arabinoxilano, vinculación mixta de glucano, o glucomanano), y pectina. Técnicas histológicas proporcionan importantes pistas visuales en el estudio de las diferencias dentro de las paredes celulares secundarias en los niveles de organización y celulares. Diversas técnicas histológicas fueron desarrollados y se pueden encontrar en la literatura, pero estas técnicas puede ser difícil y requiere mucho tiempo para los principiantes debido a protocolos muy detalladas con instrucciones visuales simples son rara vez disponible. El objetivo de este estudio es proporcionar pautas sencillas para las técnicas de tinción histológica para obtener imágenes de alta calidad.
Seccionar el tejido del tallo es el primer paso en la visualización de las paredes celulares y formas celulares. Aunque las secciones cortadas a mano son baratos y requieren menos tiempo para prepararse, el uso de un vibratome ofrece consistencia yproduce imágenes de alta calidad. El uso de un vibratomo permite producir mejor calidad de los datos mediante la generación de incluso secciones con el mismo espesor, lo que ayuda a producir imágenes nítidas y reduce significativamente el riesgo de producir diferencias inexactas entre las muestras que se causada simplemente por una mala preparación de la muestra. El uso de resinas para fijar especímenes frescos puede ser un desafío para los principiantes y todavía puede llevar mucho tiempo, incluso para los expertos en el análisis que debe hacerse rápidamente. Además, se hace imposible para medir cualquier actividad biológica con la muestra cuando se ha incorporado en una resina. Una técnica simple que emplea agarosa y un molde casero es útil para la incrustación de tejidos del tallo, y también se puede utilizar en otras aplicaciones que requieren la disección de los tejidos blandos. En comparación con la incrustación de especímenes en la resina, este método tiene la ventaja de mantener los tejidos vivos y la reducción de la manipulación de la muestra. Seccionamiento tejidos a través de un vibratomo es altamente preciso y genera homogensecciones unidades organizativas, que, dependiendo del objetivo del estudio, a continuación, se pueden utilizar con varias técnicas de tinción diferentes.
Los métodos más sencillos para visualizar la lignina y otros compuestos aromáticos emplean radiación ultravioleta (UV). La excitación de las moléculas de base de compuestos aromáticos por la luz UV es una técnica antigua, pero sigue siendo uno de los métodos más rápidos para la visualización de la lignina. Sin embargo, la visualización UV en realidad no es ideal para la detección de la lignina, porque la luz UV excitará otros compuestos aromáticos. La lignina se compone principalmente de tres componentes básicos, los monolignoles (alcoholes hidroxicinamil: alcohol coniferil, alcohol sinapílico y alcohol p-cumaril) 1-3. Mancha Phloroglucinol puede proporcionar pistas sobre la magnitud de cinnamaldehydes presentes en el xilema, fibras y tejidos traqueales 4. Floroglucinol es un buen indicador de cinnamaldehydes generales y puede diferenciar entre cinnamaldehydes y otros compuestos aromáticos. Los monómeros de alcohol sinapílico se pueden detectary diferenciados por el uso de Maule mancha. Azul de toluidina O es un colorante policromático y por lo tanto tiene la capacidad de manchar diferentes elementos de la pared celular en diferentes colores 5,6. El principal uso de azul de toluidina O es detectar pectina y 5,6 lignina. La ventaja de la utilización de azul de toluidina O es que muchos elementos de la pared celular pueden ser visualizados en un solo paso. Tanto calcoflúor blanco y rojo congo son fáciles de trabajar con y se pueden utilizar para visualizar celulosa. Calcofluor manchas blancas de celulosa, callosa, y otros β-glucanos, no sustituidos o sustituidos débilmente 6-9, mientras que el congo manchas rojas directamente a β-glucanos (1 → 4) y, en particular y celulosa 10,11. El objetivo de este estudio es proporcionar pautas sencillas para el uso de las técnicas de tinción antes mencionados para obtener imágenes de alta calidad a partir de A. thaliana tallos.
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Protocol
1. Stem incrustación
- Hacer una solución de agarosa al 7% en agua (de 7 g de agarosa de electroforesis-grado en 100 ml de agua destilada). Disolver la agarosa en autoclave durante 20 min o en el microondas durante 20 min a una intensidad más baja (por ejemplo, intensidad de 10% de un horno de microondas 1250 vatios).
- Preparar un molde hecho en casa para incrustar los tallos usando viales de plástico.
- El uso de una hoja de afeitar, cortar la parte inferior cónica de un tubo de microcentrífuga con tapón de rosca de 2 ml (Parte A). Con una aguja de jeringa, perforar un agujero en la tapa del tubo ligeramente mayor que el diámetro del vástago para ser incrustado. A continuación, cortar 0,5 cm de la parte inferior de un tubo de microcentrífuga de 0,6 ml (Parte B).
- Añadir la porción de 0.5 cm de corte del tubo de microcentrífuga de 0,6 ml en el tubo de microcentrífuga de 2 ml de precorte. Selle las dos partes utilizando Parafilm (Figura 1). NOTA: La parte inferior del tubo se corta para facilitar la eliminación de la muestra incrustada después de la agarosa se ha solidificado. Tél agujero en la tapa será ayudar en la sujeción del vástago estacionario cuando el vástago está incrustado en agarosa. El molde que servirá para celebrar la agarosa y sostenga el tronco recto al incrustar. El Parafilm celebrará las dos partes, A y B, hasta que la agarosa se establece y el tallo está incrustado.
- Uso de una hoja de afeitar, cortar una sección de vástago de la zona de interés, (por ejemplo, medio de la primera entrenudo del tallo). NOTA: Idealmente, el tallo debe cortarse justo antes de la incorporación de evitar la destrucción por la deshidratación. Alternativamente, el vástago puede ser almacenado temporalmente en una placa que contiene un papel de filtro humedecido con agua. Esta placa se puede colocar en hielo hasta que esté listo para ser incorporado para prevenir la deshidratación del tejido y la deformación. Almacenamiento de la madre para períodos de más de 30 minutos sin elevada humedad hará que el vástago se seque.
- Derrita la agarosa en el microondas a baja intensidad. PRECAUCIÓN: La botella que contenía agarosa puede estar caliente. Utilice un guante para coger la botella. Deje que los s de agarosa fundidatand a temperatura ambiente (entre 20 ° C y 25 ° C) hasta que se enfría a aproximadamente 50 º C.
- Lentamente pipeta de 5 ml de la agarosa en el molde de plástico preparado de antemano para llenar el vial. NOTA: Asegúrese de que no haya burbujas de aire en los moldes. Las burbujas de aire hará que las brechas en el molde de agarosa y no cubren completamente la muestra madre, que finalmente conducirá a la corte desigual de las secciones de la muestra.
- Deje que la agarosa se enfríe durante 30 a 60 segundos para convertirse en semisólido. Pruebe con un pequeño palillo de dientes, asegurándose de que puede penetrar y permanecer de pie, pero no flotan, en la agarosa. NOTA: Si la madre se coloca cuando la agarosa esté todavía caliente se puede dañar la muestra por encogimiento del tallo, la destrucción de la morfología celular.
- Coloque el vástago en este vial de agarosa-llenado. Asegúrese de que el vástago se mantiene recta. Coloque la tapa perforada de una manera tal que la punta del vástago se lleva a cabo por la tapa. No gire el tapón de rosca. En algún momento más de un vástago (de una sola especie) puede ser embedded en un solo vial; pero en ese caso concreto, no utilice la tapa. NOTA: Si la tapa de rosca está activada, la madre recibirá retorcido.
- Agregar el vial a temperatura ambiente o a 4 º C durante 10-30 min, hasta que se solidifica.
- Retire el molde suavemente deslizándolo fuera del tubo. Abra el Parafilm. Empuje la parte inferior de la parte B del molde suavemente con el pulgar para soltar la agarosa solidificada de la Parte A en un portaobjetos de vidrio para microscopio.
- Cortar el tallo incrustado de agarosa en tres trozos aproximadamente iguales de 1,2 cm de longitud. Corte la parte del tallo que no estaba en la agarosa y descartarlo.
- Guarde estas piezas de agarosa con el embebido tallos en hermético 2 tubos de microcentrífuga ml en una caja oscura a 4 ° C hasta el momento de la sección. Alternativamente, almacenar los tubos a 4 º C durante un máximo de una semana. NOTA: El almacenamiento es posible, pero el experimentador tiene que ser consciente de que los tallos incrustado todavía están vivos y, dependiendo del experimento, Artefactos potencialmente podrían ser introducidos.
2. Stem Sectioning
- PRECAUCIÓN: Lea el manual vibratome cuidadosamente y siga todas las instrucciones de seguridad.
- Asegúrese de que la platina esté limpia y completamente seca (libre de cualquier sólido o líquido). Limpie la platina con una hoja de afeitar para eliminar cualquier pegamento residual de los experimentos anteriores y lavar con agua. Luego seque con una toalla de papel. NOTA: Esto asegurará que el adhesivo funciona bien y se une a la muestra de agarosa. Si este paso no se hace correctamente, es posible que los especímenes no podrán adherirse al disco y más tarde provocarán la muestra caigan fuera del disco durante el corte.
- Utilice papel suave limpia para eliminar la humedad del bloque de agarosa que contiene las muestras.
- Coloque una pequeña gota de adhesivo tisular en la platina. Racha a cabo el adhesivo para cubrir el área en el centro de la placa con la punta de la botella adhesivo. Rápidamente lugarel bloque de agarosa de manera que las muestras son o bien perpendicular a o en paralelo con la placa para transversal o secciones transversales longitudinales, respectivamente. Deje que el adhesivo para fijar la muestra a la platina a temperatura ambiente o a 4 º C durante 10-30 min. NOTA: Este es un paso sensible al tiempo.
- Fijar la platina en su lugar en el baño tampón o valle. El bloque / s de agarosa con las secciones deben estar en paralelo con la hoja de afeitar. Llene la bandeja de tampón con agua destilada a temperatura ambiente hasta que las muestras estén completamente sumergidos.
- Cortar una hoja de afeitar en la mitad y luego recortar los extremos con unas tijeras fuertes para que la hoja se queda completamente plano. Coloque la mitad de la hoja de afeitar de precorte en el soporte de cuchillo.
- Ajuste el ángulo del soporte de cuchillo a 84 °, la velocidad de 0,90 mm / seg (8 posición en el vibratome) y la frecuencia de 50 Hz (posición 5 en el vibratome). Cortar secciones de 100 micras de espesor. Utilice el modo continuo. NOTE: Este espesor se selecciona para asegurar que el tejido puede soportar los diversos tratamientos con ácido y base utilizados en algunos de los protocolos de tinción. Establece la ventana para seccionar y permitir 15-20 min en un modo continuo para la vibratome a la sección de un bloque de agarosa de aproximadamente 1,2 cm.
- Recoge las secciones con una pipeta de plástico desechable durante el corte en el baño tampón. Alternativamente, las secciones pueden ser transferidos desde la bandeja de tampón en un vaso de precipitados de vidrio y luego a una placa de Petri claro. Transferir algunas secciones de los tubos de microcentrífuga de 2,0 ml. Nota: Las muestras se recogen de una placa de Petri, ya que es más fácil ver las secciones sobre un fondo claro, y porque el baño tampón pueden ser preparadas para la siguiente muestra.
- Las secciones se pueden almacenar en un tubo de 50 ml o recogidos y almacenados en 1,5 a 2 ml de tubos de microcentrífuga a 4 ° C durante 30 a 60 min. NOTA: El almacenamiento de las secciones por períodos más largos dará lugar a la mala calidad de imagen.
3. Microscopio y ajustes de la cámara para imágenes
- Ajustar la iluminación Koehler en el microscopio. Elija un objetivo. Enfoque la muestra primero. Traiga la intensidad de la luz a la mitad o menos. Cierre el diafragma de campo (FD) y la apertura (AP) o llevarlo a la posición más baja posible en ese objetivo particular.
- Cuanto mayor es la ampliación, más grande es el anillo será. Utilice el botón de enfoque del condensador para enfocar el iris de campo tan fuertemente como sea posible.
- Lentamente lleve la imagen del iris de campo (pequeño anillo en forma de hexágono) al centro con los mandos de centrado del condensador-(tornillos en forma de alfiler que rodean el condensador). Aumente poco a poco el diafragma (FD) de tal manera que el diafragma de campo alcanza el borde. Detener el aumento de la FD justo después del iris de campo ha superado el límite.
- Poco a poco aumentar la abertura (AP) para ajustar el contraste. Ajuste la intensidad de la luz según las necesidades. NOTA: la iluminación Koehler necesita ser ajustado para cada Objetivo, cada día experimental. Anote los números obtenidos después del ajuste para el día. Estos números se pueden volver a utilizar cada vez que se cambian los objetivos de ida y vuelta para ese día en particular.
- Ajuste la abertura, intensidad, tiempo de exposición, la ganancia y filtros como se describe en la Tabla 1. Esta información debe ser utilizado sólo como una guía.
- Utilice una cámara digital de alta resolución con un chip CCD interlineal de formato grande sin obturador mecánico para capturar imágenes de fluorescencia; y una alta resolución, cámara de alta velocidad de imágenes de campo brillante.
- Procesar las diapositivas utilizando software estándar. Cargue el software. Haga clic en "Acquire" y "Ajuste de la cámara / tabla," a continuación, seleccione la cámara que se utilizará. Haga clic en "Aceptar". Haga clic en "Adquirir" seguido de "ficha Color." Bajo "ficha Color," elegir "el método Bayer" seguido de "Promedio de cuatro." Añadir la ganancia sugerido (rojo, verde, azul) from Tabla 1. Seleccione la pestaña "Config salvar" y haga clic en el directorio en el que las imágenes han de almacenarse. Ajuste "Tiempo de exposición" de las sugerencias en la Tabla 1. Ajuste "Agrupación" a "1" y "hurgar en la basura en vivo" a "1". Centrarse en la región de interés y, a continuación, haga clic en "Guardar en vivo."
- Imágenes de salida en el software de la cámara están en el formato "TIF". Analizar las imágenes para histoquímica de los tipos de células. Utilice software estándar para usos intermedios de presentación y publicación.
4. Ultravioleta y Bright-campo Imaging
- Usar una pipeta de 1 ml con el corte de punta de la pipeta de manera que las secciones se pueden pipetearon a cabo fácilmente. Suavemente secciones pipeta en la punta y en un portaobjetos de microscopio. Cubrir las secciones con un cubreobjetos. Tenga en cuenta las secciones bajo la luz ultravioleta o luz de campo brillante.
5. Floroglucinol-HCl (Wiesner) tinción 12
- Disolver 0,3 g de floroglucinol en 10 ml de etanol absoluto para preparar una solución de floroglucinol 3%. Mezclar un volumen de HCl concentrado (37 N) a dos volúmenes de 3% floroglucinol en etanol; esta solución es floroglucinol-HCl (pH-HCl) o Wiesner mancha. Nota: esta solución es que se recién hecho en el día de la tinción y no puede ser almacenado, ya que la solución se degradará con el tiempo y la tinción se convertirá en ineficaz. PRECAUCIÓN: HCl es altamente corrosivo, por lo que vaya con mucho cuidado al manipular la mancha Ph-HCl.
- Transferencia de secciones de tallo a un tubo de microcentrífuga de 2,0 ml. Añadir 1 ml de la solución de Ph-HCl al tubo que contiene las secciones y la tapa de inmediato debido a que el HCl en la mancha Ph-HCl es altamente corrosivo. Mueva suavemente el tubo para asegurar que todas las secciones se tiñen. Una alternativa a este paso es para mantener la tapa del tubo abierto de modo que el pH de la solución de HCl-se puede pipeteó arriba y abajo, preferentemente sin molestar a la SECciones. NOTA: Tenga cuidado de no pipetear las secciones en la punta de la pipeta, ya que esto puede dañar esas secciones.
- Usar una pipeta de 1 ml con el corte de punta de la pipeta de tal manera que las secciones se pueden pipetearon a cabo fácilmente y sin daños. Pipetear suavemente secciones en la punta y en un portaobjetos de microscopio. Cubrir las secciones con cubreobjetos. Tenga en cuenta las secciones bajo iluminación de campo brillante. NOTA: El pH de la solución de HCl-seca en 5-10 minutos, provocando un deterioro de los especímenes. Por lo tanto, la imagen tiene que ser completado dentro de ese período de tiempo.
6. Maule tinción 13,14
- Disolver 0,2 g de permanganato de potasio en 40 ml de agua destilada para preparar una solución de permanganato de potasio 0,5%. Almacenar en una botella oscura a temperatura ambiente durante un máximo de 7 días.
- Preparar una solución de HCl 3,7% mediante la adición de 1 ml de HCl concentrado (37 N) a 9 ml de agua destilada (1:10). Prepare una solución fresca HCl 3,7% en eldía del experimento. Asegúrese de que la solución de HCl 37 N que se utiliza no es demasiado viejo. Solución de hidróxido de amonio concentrado (14,8 M) debe ser almacenado a 4 ° C para evitar la molaridad de la solución saturada de disminuir.
- Transferencia de secciones de tallo a un tubo de microcentrífuga de 2,0 ml. Añadir 1 ml de la solución de permanganato de potasio 0,5% al tubo que contiene las secciones.
- Pipetear la solución de permanganato de potasio 0,5% arriba y hacia abajo suavemente, preferiblemente sin molestar a las secciones. Incubar durante 2 minutos y repetir la pipeta. Deje que el tubo de microcentrífuga reposar hasta que todas las secciones se calmen. NOTA: Tenga cuidado de no pipetear las secciones en la punta de la pipeta como las secciones pueden ser dañados. Puede ser difícil de ver las secciones de tallo como la solución es oscura, por lo que mantener el tubo con las secciones sobre Gradilla y permitir que se asienten durante 2 min.
- Usando una pipeta de 1 ml, extraer 700 l de solución de permanganato de potasio 0,5%.Añadir 700 l de agua destilada para enjuagar la solución de permanganato de potasio. Repita 3-4x o hasta que la solución de agua permanece clara.
- Deseche el agua. Añadir rápidamente 1 ml de 3% de HCl hasta que el color de color marrón oscuro se descarga de las secciones. Esto puede suceder dentro de 3-5 min o puede requerir de 2 lavados de 5 min cada uno. Pipetear toda la solución de HCl al 3% y proceda inmediatamente al siguiente paso.
- Añadir 1 ml de solución concentrada de hidróxido de amonio. Usar una pipeta de 1 ml con la punta de corte de tal manera que las secciones se pueden pipetearon a cabo fácilmente y sin daños. Pipetear suavemente secciones en la punta y en un portaobjetos de microscopio. Cubrir las secciones con un cubreobjetos. Tenga en cuenta las secciones bajo iluminación de campo brillante. PRECAUCIÓN: Debido a que el hidróxido de amonio es extremadamente corrosivo, requiere especial cuidado y atención para evitar causar corrosión a la platina del microscopio o lente. NOTA: Los vapores de hidróxido de amonio pueden empañar el cubre, por lo que es difícil de observar la muestra. Por lo tanto tenga mucho cuidado antes de añadir el cubreobjetos. La solución se seca en 5-10 minutos, por lo que la imagen tiene que ser completado dentro de ese período de tiempo.
7. Rojo Congo tinción 11,15
- Disolver 0,5 g de rojo Congo en 100 ml de agua destilada para preparar una solución de rojo Congo 0,5%.
- Transferencia de secciones de tallo a un tubo de microcentrífuga de 2,0 ml. Añadir 1 ml de la solución de rojo Congo 0,5% al tubo. Pipetear suavemente la solución de rojo congo 0,5% arriba y abajo sin molestar a las secciones. NOTA: Tenga cuidado de no pipetear las secciones en la punta de la pipeta, ya que esto podría dañar las secciones.
- Incubar a temperatura ambiente durante 10 min y repetir el pipeteado. Siga con otro 3 min de incubación a temperatura ambiente.
- Utilice una pipeta de 1 ml para extraer 700 l de 0,5% solución de rojo congo. Añadir 700 l de agua destilada para enjuagar la solución de rojo congo. Repita el lavado 3-4x hasta que la solución de lavadoestá claro.
- Usar una pipeta de 1 ml con su corte de punta de tal manera que las secciones se pueden pipetearon a cabo fácilmente y sin daños. Pipetear suavemente secciones en la punta y en un portaobjetos de microscopio, y los cubren con cubreobjetos. Tenga en cuenta las muestras en el portaobjetos de un microscopio bajo la luz azul de excitación utilizando un filtro con un paso de banda de 560/40. NOTA: No almacene las secciones en el agua por mucho tiempo antes de que el análisis microscópico, ya que el agua va a lavar el rojo congo en 10-30 min.
8. Calcoflúor Blanco tinción 9
- Disolver 0,02 g de abrillantador fluorescente 28 (calcoflúor blanco M2R) en 10 ml de agua destilada para preparar una solución madre de 0,2%. La solución de 0.2% puede ser almacenado durante seis meses en un frasco oscuro a 4 º C. Preparar una solución de trabajo de 0,02% diluyendo el 0,2% 10x solución madre con agua destilada.
- Transferencia de secciones de tallo a un tubo de microcentrífuga de 2,0 ml. Añadir al tubo 1 ml de la calcof 0,02%Luor solución blanco. Pipetear suavemente la solución blanca 0,02% calcofluor arriba y hacia abajo. NOTA: Tenga cuidado de no pipetear las secciones en la punta de la pipeta, ya que esto podría dañar las secciones.
- Incubar a temperatura ambiente durante 5 min y repetir el pipeteado. Incubar la sección para otro 3 min a temperatura ambiente. NOTA: Permita que las secciones se asienten en el fondo del tubo para que sea más fácil de pipeta la solución sin dañar las secciones.
- Utilice una pipeta de 1 ml para extraer 700 l de solución de blanco 0,02% calcofluor y añadir 700 l de agua destilada; espere 5 minutos para enjuagar la solución blanco calcofluor. Repita el lavado 3-4x. Usar una pipeta de 1 ml con el corte de punta de la pipeta de tal forma que las secciones se pueden pipetearon a cabo fácilmente y sin daños.
- Pipetear suavemente secciones en la punta y en un portaobjetos de microscopio y cubrirlos con un cubreobjetos. Tenga en cuenta las secciones bajo la luz ultravioleta.
9. Toluidina Blue O tinción 16,17
- Disolver 0,02 g de azul de toluidina O en 100 ml de agua destilada para preparar una solución 0,02%. NOTA: La solución de azul de toluidina O se puede almacenar durante dos semanas en una botella oscura a temperatura ambiente.
- Transferencia de secciones de tallo a un tubo de microcentrífuga de 2,0 ml. Añadir 1 ml de la solución de azul de toluidina O 0,02% al tubo. Pipetear suavemente la solución de azul de toluidina O 0,02% arriba y hacia abajo. A continuación, se incuba a temperatura ambiente durante 5 min y repetir el pipeteo una vez. NOTA: Tenga cuidado de no pipetear las secciones en la punta de la pipeta, ya que esto podría dañar las secciones. Deje que el tubo de microcentrífuga se detiene hasta que las secciones se calmen. Esto puede ser difícil de ver, ya que la solución es oscura, por lo que mantener el tubo que contiene las secciones sobre Gradilla y permitir que se asienten durante 2 minutos a temperatura ambiente.
- Utilice una pipeta de 1 ml para extraer 700 l de solución de azul de toluidina O 0,02%. Añadir 700 l de agua destilada para enjuagar el azul de toluidina O sollución. Repita 3-4x o hasta que la solución de lavado que está claro. Usar una pipeta de 1 ml con el corte de punta de la pipeta de tal manera que las secciones se pueden pipetearon a cabo fácilmente sin dañarlos.
- Pipetear suavemente secciones en la punta y en un portaobjetos de microscopio y cubrirlos con un cubreobjetos. Tenga en cuenta las secciones bajo iluminación de campo brillante.
- Ajustar la iluminación Koehler en el microscopio. Elija un objetivo. Enfoque la muestra primero. Traiga la intensidad de la luz a la mitad o menos. Cierre el diafragma de campo (FD) y la apertura (AP) o llevarlo a la posición más baja posible en ese objetivo particular.
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Representative Results
Stem inclusión y corte:
El uso del molde de plástico hecha en casa para incrustar los tallos en 7% de agarosa demostrado ser rápido y fácil (Figura 1). Las dos partes (A y B; Figura 1) del sistema vial incrustado hacen que sea sencillo para liberar fácilmente el vástago incrustado en agarosa, tal como la agarosa no se pegue a las partes de los viales que son inertes, mantener el sistema limpio. Los viales se pueden reutilizar varias veces por año. La conveniencia de almacenar el vástago incrustado también hace que los próximos pasos más fácil. Con el fin de ahorrar en algún momento, similar incrustado tallos pueden ser agrupados (hasta 3) en una placa de corte único para el corte.
Observación de Aromáticos Bajo UV:
Las secciones de tallo se montaron en agua destilada a los portaobjetos de vidrio y se observaron bajo luz UV. Los compuestos aromáticos, incluyendo la lignina en las células, se pueden visualizar por su autofluorescencia bajo luz UV. Xilema (XY) y las fibras interfasciculares (Fi)mostró autofluorescencia bajo iluminación UV pero no en la médula (Pi) y la corteza o epidermis (Ep) (Figura 2), debido a la lignina, un polímero aromático, se deposita durante la biosíntesis de la pared celular secundaria. En algunos casos, cuando las plantas se acumulan cantidades significativas de compuestos aromáticos en sus vacuolas (por ejemplo, antocianina), la fluorescencia se puede observar en las células corticales (datos no presentados). Stem secciones transversales se analizaron bajo 5X, 10X, 20X, 40X y ampliación (Figura 2 Paneles A, B, C, y D - E, respectivamente) para visualizar mejor distribución aromático de la pared celular a través de la madre.
Observación de la lignina en las secciones de tallo teñidas con Phloroglucinol y Maule Manchas:
El xilema compuesto por vasos y fibras y fibras interfasciculares eran los únicos elementos de la madre que se tiñeron por las manchas de lignina (floroglucinol y Maule) Usando una sección del tallo muestra de tipo salvaje. Mancha Phloroglucinol reacciona con cinnamaldehyde finales grupos de lignina para dar un color rosa o fucsia 4 (Figura 3). Como observó bajo iluminación UV, una coloración fucsia se observa en las fibras del xilema y interfascicular pero está ausente en la médula y la corteza o epidermis (Figura 3). Stem secciones transversales se analizaron bajo 5X, 10X, 20X, 40X y ampliación (Figura 3 Paneles A, B, C, y D - E, respectivamente) para visualizar mejor la distribución de manchas floroglucinol a través de la madre y se diferencian los principales tejidos; xilema y fibras interfascicular; médula y la corteza; y la epidermis. Por lo general, la intensidad del color se correlaciona con el nivel de lignificación de una manera cualitativa - excepto cuando el mutante o transgénicos analizados se enriquece anormalmente en unidades de aldehido cinámico-derivados (por ejemplo mutantes CAD) <sup> 14. La mancha del Maule es específico en la detección de las unidades de lignina siringil en el xilema y fibras interfasciculares. Coloración rojo indica la presencia de unidades de lignina siringil en los elementos de la lignina (Figura 4) 18. Sin embargo, una coloración rojo brillante se observó en las fibras cuando se compara con los tejidos del xilema que sugiere que las fibras contienen un nivel más alto de S lignina mientras que el xilema es más enriquecido en unidades de T. Como se observó después de la tinción floroglucinol, una coloración roja se observa en las fibras del xilema y interfascicular pero está ausente en la médula y la corteza o epidermis (Figura 4). También se correlaciona con la distribución de lignina observado bajo UV (Figura 2) y demuestra que las unidades siringil están presentes en todos los tejidos lignificados de esta muestra de tallo. Stem secciones transversales se analizaron bajo 5X, 10X, 20X, 40X y ampliación (Figura 2 Paneles A, B, C, yD - E, respectivamente) para visualizar mejor la distribución de manchas Maule a través de la madre y la discriminación de los principales tejidos: las fibras del xilema y interfascicular, médula y la corteza, y la epidermis. Es importante tener en cuenta que la cantidad y distribución de las unidades de siringilo entre los tejidos lignificados varían con la edad de la madre y pueden estar ausentes en un tallo joven (datos no mostrados).
La observación de secciones de tallo teñidas con calcoflúor Blanco y Congo Manchas rojas:
Calcofluor manchas blancas de celulosa, callosa, y otros β-glucanos no sustituidos o sustituidos débilmente; mientras que congo manchas rojas directamente a β-(1 → 4)-glucanos y particularmente a la celulosa. Secciones de tallo teñidas con calcofluor blanco se observaron bajo luz UV 6-9. Congo secciones teñidas de rojo se observaron bajo excitación de luz azul utilizando un filtro con un paso de banda de 560/40. Tanto calcofluor blanco y rojo Congo tiñeron la epidermis, córtex y médula; ªes es porque todos estos tejidos contienen celulosa como polímero de polisacárido importante en sus paredes celulares (Figura 5 y la Figura 6, respectivamente). En contraste a blanco de calcoflúor, polisacáridos teñidas de rojo congo mejor en el xilema y fibras interfascicular y parece menos afectado por la presencia de lignina (Figura 5 y Figura 6) 10,11. Stem secciones transversales se analizaron bajo 5X, 10X, 20X, 40X y ampliación (paneles A, B, C, y DE, respectivamente de las figuras 5 y 6) para visualizar mejor calcoflúor blanco y congo distribuciones mancha roja a través del vástago y el importante tejidos (xilema y fibras interfascicular, médula y la corteza, y la epidermis).
La observación de secciones de tallo tiñeron con azul de toluidina O:
Azul de toluidina O se clasifica como un tinte policromático porque reacciona con diferentes componentes químicos de las células de manera diferente y los resultados enuna muestra de varios colores (Figura 7). Los colores generados pueden proporcionar información sobre la naturaleza de la célula y sus paredes. Azul de toluidina O es un colorante catiónico que se une a grupos cargados negativamente 5. Una solución acuosa de este tinte es de color azul, pero de diferentes colores se generan cuando el colorante se une con diferentes grupos aniónicos en el 6,9 celular. Por ejemplo, aparece un color púrpura rosado cuando el colorante reacciona con polisacáridos carboxilados tales como el ácido pépticas; verde, azul verdoso o azul brillante con sustancias poliaromáticos tales como lignina y taninos; y de color violeta o azul verdoso con ácidos nucleicos. Toluidina O azul de madre secciones transversales reveló que las fibras del xilema y interfascicular se lignificadas ya que muestran una coloración azul o azul verdoso (Figura 7, panel C), que está de acuerdo con la UV y observaciones de tinción Ph-HCl (Figuras 2 y 3). En contraste, la médula y los tejidos de la corteza y la epidermis muestran coloración azul verdoso o azul, ya que, aunque no están lignificadas, contienen algunos polímeros de pectina en sus paredes celulares. Stem secciones transversales se analizaron bajo 5X, 10X, 20X, 40X y ampliación (Figura 7 Paneles A, B, C, y D - E, respectivamente) para visualizar mejor azul de toluidina O distribución mancha a través de la madre y para diferenciar los tejidos principales .
. Figura 1 molde hecho en casa para incrustar los tallos En la parte izquierda.; parte superior del tubo 2 ml con tapón de rosca de microcentrífuga (Parte A) y la parte inferior del tubo de microcentrífuga de 0,6 ml (Parte B). En el lado derecho; el Parafilm sosteniendo las dos partes; A y B para formar el molde final.
Figura 2. Fluorescencia UV de A. madre thaliana secciones transversales. secciones transversales de un tipo silvestre A. madre thaliana bajo fluorescencia de luz UV que muestra la presencia de compuestos aromáticos, incluyendo la lignina, sólo en las paredes de las fibras y células interfasciculares xilema (A - E). Las posiciones de la epidermis y de la corteza (EP), fibras interfasciculares (Fi), médula (Pi) y xilema (XY) se indican. Aumentos: Panel A: 5X; Grupo B: 10 veces; Panel C: 20X; paneles D y E: 40X. Bar = 100 micras.
Figura 3. Tinción Phloroglucinol-HCl de A. madre thaliana secciones transversales. Tinción Phloroglucinol-HCl (color rosa o fucsia) de un tipo natural A. sección de vástago thaliana que muestra la deposición normal de lignina en las paredes de las fibras interfascicular y células del xilema (A - E). Las posiciones de la epidermis y de la corteza (EP), fibras interfasciculares (Fi), médula (Pi) y xilema (XY) se indican. Aumentos: Panel A: 5X; Grupo B: 10 veces; Panel C: 20X; paneles D y E: 40X. Bar = 100 micras.
Figura 4. Tinción Maule de A. madre thaliana secciones transversales. tinción Maule (color rojo) de un tipo natural A. thaliana </ Em> sección del tallo que muestra la deposición normal de lignina en las paredes de las fibras y células interfasciculares xilema (A - E). Las posiciones de la epidermis y de la corteza (EP), fibras interfasciculares (Fi), médula (Pi) y xilema (XY) se indican. Aumentos: Panel A: 5X; Grupo B: 10 veces; Panel C: 20X; paneles D y E: 40X. Bar = 100 micras.
Figura 5. Calcoflúor blanco manchado de A. madre thaliana secciones transversales. calcoflúor blanco manchado de un tipo silvestre A. sección de vástago thaliana que muestra la deposición de celulosa en las paredes celulares de las células de la epidermis, corteza, médula, fibras interfascicular, y xilema (A - E). El positiComplementos de la epidermis y de la corteza (Ep), fibras interfasciculares (Fi), médula (Pi) y xilema (XY) se indican. Aumentos: Panel A: 5X; Grupo B: 10 veces; Panel C: 20X; paneles D y E: 40X. Bar = 100 micras.
Figura 6. Tinción con rojo Congo de A. madre thaliana secciones transversales. tinción con rojo Congo de un tipo natural A. sección de vástago thaliana que muestra la deposición de celulosa en las paredes celulares de las células de la epidermis, corteza, médula, fibras interfascicular, y xilema (A - E). Las posiciones de la epidermis y de la corteza (EP), fibras interfasciculares (Fi), médula (Pi) y xilema (XY) se indican. Aumentos: Panel A: 5X; Grupo B Panel C: 20X; paneles D y E: 40X. Bar = 100 micras.
Figura 7. Toluidina O tinción de azul de A. madre thaliana secciones transversales. Toluidina tinción azul O de un tipo natural A. sección de vástago thaliana que muestra la deposición normal de lignina en las paredes de las fibras interfascicular y células del xilema (A - E). Las posiciones de la epidermis y de la corteza (EP), fibras interfasciculares (Fi), médula (Pi) y xilema (XY) se indican. Aumentos: Panel A: 5X; Grupo B: 10 veces; Panel C: 20X; paneles D y E: 40X. Bar = 100 micras.
Tabla 1. Microscopio y ajustes de la cámara para obtener imágenes. Directrices para trabajar con filtros de fluorescencia y las imágenes de campo claro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Secciones de tallo de A. thaliana se utilizan ampliamente para estudiar la organización de las células en la pared celular secundaria y para examinar cualitativamente las diferencias entre el tipo salvaje y las plantas transgénicas. Las técnicas utilizadas para el corte de las muestras son de corte directo de las manos; o cuando las muestras están incrustados en agarosa o fijador, seccionamiento se puede hacer con un vibratome o microtomo. En contraste con el corte manual, los dos últimos permiten reducir el riesgo de producir diferencias inexactas entre las muestras que se causada simplemente por una mala preparación de la muestra causados por las diferencias de espesor entre las muestras y las superficies irregulares. Todos estos métodos tienen sus pros y sus contras. Elegimos la incrustación en agarosa, seguido por el corte utilizando un vibratome, y así lo hicimos por las siguientes razones: La facilidad de incorporación y el tiempo invertido en el uso de agarosa elimina la necesidad de Perfecto acabado de tejido fresco. Además, nuestros moldes caseros son fáciles y baratos de hacer, puede contener ªe tallo recto, puede ser utilizado durante muchos años, y puede ayudar en la fácil liberación de especímenes sin hacer un desastre. La mejor manera de disolver alto porcentaje de agarosa y obtener una solución homogénea (disolución total de 7 g de agarosa en 100 ml sin formar gránulos gruesos) es autoclave o para el microondas a la intensidad más baja. Es importante para cortar el tejido del tallo fresco, o, alternativamente, para almacenarlo en una placa colocada en hielo que contiene un papel de filtro humedecido con agua para prevenir la deshidratación del tejido y la deformación. Almacenamiento de la madre para períodos de más de 30 minutos sin elevada humedad hará que el vástago se seque. La temperatura de la agarosa justo antes está incrustado el vástago debe estar alrededor de 50 º C. Es fundamental para comprobar la presencia de burbujas de aire después de la agarosa se ha derramado en el vial, ya que las burbujas de aire causan deficiencias en el molde y en consecuencia, el seccionamiento será desigual. Las burbujas de aire se pueden quitar rápidamente colocando la solución al vacío antes de verterella. El vástago debe ser colocado en la agarosa cuando todavía es suave y no más caliente que 50 ° C. El calor puede dañar la muestra por encogimiento del tallo y va a destruir la morfología celular. Si la agarosa es demasiado frío el vástago no penetra a través de la agarosa y la incrustación no será posible. Después de la incrustación de agarosa, las muestras madre pueden ser almacenadas a 4 ° C durante hasta una semana.
El uso de un vibratome lugar de rendimientos-seccionar la mano cortada con precisión las muestras y una mejor calidad de imagen. Todas las instrucciones de seguridad deben ser leídas y seguidas durante el uso de un vibratome cuidadosamente. Es importante asegurarse de que la platina esté limpia y seca para permitir que el adhesivo tisular para mantener la muestra firmemente en su lugar para que no se caiga durante el corte. Se especifica el espesor de las muestras para resistir el ácido dura y tratamientos de base durante los procedimientos de tinción. La cuchilla usada en el vibrátomo debe ser completamente plana, de modo que la sección se corta EVneamente. Seccionamiento tarda aproximadamente 20 min por muestra; con el fin de ahorrar tiempo, los especímenes similares pueden ser seccionados en grupos en un plato espécimen único. Durante el corte, las secciones se transfieren desde la bandeja de tampón en una pequeña placa de Petri para hacer las secciones más fácil de ver en un fondo claro y para liberar la bandeja de tampón para la siguiente muestra. Las secciones se pueden utilizar inmediatamente para los procedimientos de tinción aguas abajo o se almacenan para su uso posterior. Alícuotas de las secciones de tallo de 2,0 ml tubos de microcentrífuga de ayuda en el cebado de los procedimientos de tinción. Hacer los ajustes correctos y configuración de la cámara y el microscopio son muy críticos para lograr imágenes de alta calidad. Ajuste de la iluminación Kohler es uno de los pasos más importantes en el uso del microscopio. Los ajustes para la apertura y la intensidad de la luz, como se describe en la sección Métodos, están destinados sólo como una guía. Ellos pueden necesitar ser modificados dependiendo del microscopio y la cámara utilizada. Se utilizó una alta resolucióncámara digital con un chip de gran formato interlineal CCD y sin obturador mecánico para obtener imágenes de los rayos UV, calcofluor blanco, y tinción con rojo congo; y una cámara de alta resolución y color de alta velocidad para las imágenes de campo brillante del Maule, floroglucinol y la tinción de azul de toluidina O. Se analizan, procesan y ensamblan utilizando software de imagen estándar Imágenes.
Floroglucinol es la mancha más comúnmente utilizado para la determinación de lignina; no es un verdadero mancha lignina ya que tiñe sólo grupos terminales de aldehido cinámico. La mancha floroglucinol, también conocido como Weisner mancha, se obtiene un color rosa cereza característica o de color fucsia en el xilema y fibras interfascicular donde estos grupos aldehído están presentes 4. La intensidad del color rosa varía con el grado de lignificación. Aunque las diferencias sutiles son más difíciles de observar, que es fácil de detectar diferencias entre el tipo salvaje y secciones de tallo de mutantes que tienen variaciones en su contenido de lignina 19. También es EASy para observar las diferencias entre jóvenes (hacia el ápice del tallo) y mayores (base del tallo) los tejidos, debido a los niveles de la lignificación en tales tejidos varían. Por lo general, en el tipo salvaje tallo, la corteza y la médula de la epidermis no contienen cinnamaldehydes (por lo tanto no se deje de color) a menos que haya lignificación ectópico 20. Mancha Maule, por otro lado, es específica hacia las unidades de lignina siringil y se puede utilizar para diferenciar diferentes enriquecimientos de lignina en unidades S o T (por ejemplo, fibra frente a los tejidos del xilema) 14,18. El permanganato de potasio y acto de ácido clorhídrico en el núcleo siringilo de la unidad S en la lignina para formar un methoxycatechol y luego a metoxi-o-quinona siguiente reacción con hidróxido de amonio. La mancha del Maule es un buen indicador para diferenciar los mutantes que carecen o están ampliamente suprimidos en las unidades S de lignina (por ejemplo, en los mutantes F5H A. thaliana y plantas gimnospermas generales), Maule da color amarillo-marrón inst coloraciónead de rojo, tanto en el xilema y el esclerénquima 21. Por la misma razón, la tinción Maule se puede utilizar para diferenciar las angiospermas, que contiene principalmente lignina S de gimnospermas que normalmente carecen de la unidad de S 18. Como el ácido fuerte y la base se utilizan durante floroglucinol y procedimientos de tinción Maule, respectivamente, algunas medidas experimentales necesitan ser realizado con precaución. Tanto HCl concentrado y el hidróxido de amonio son corrosivos fuertes; que pueden deteriorar la platina del microscopio y del objetivo si las diapositivas que contienen las muestras teñidas Ph-HCl y Maule no se manejan adecuadamente. También pueden secarse rápidamente, en 5-10 minutos, provocando muestras se deterioren, por lo que la imagen tiene que ser hecho rápidamente. Azul de toluidina O es una mancha policromática y manchas de diferentes componentes de la pared celular en diferentes colores, ya que reacciona con diferentes componentes químicos de las paredes celulares de manera diferente, produciendo una muestra de varios colores. Los colores generados pueden Provide información sobre la naturaleza de la célula. Azul de toluidina O es también un colorante catiónico que se une a grupos cargados negativamente 5,6. Una solución acuosa de este tinte es de color azul, pero de diferentes colores se generan cuando el colorante se une con diferentes grupos aniónicos en la célula. Por ejemplo, los colores son una púrpura rosado cuando el colorante reacciona con polisacáridos carboxilados, tales como pectina; verde, azul verdoso o azul brillante con sustancias aromáticas como la lignina y taninos; y de color violeta o azul verdoso con ácidos nucleicos. La tinción es fácil y puede durar dos días.
Calcoflúor manchas blancas de celulosa, callosa, y otros β-glucanos no sustituidos o sustituidos débilmente 6-9 y congo manchas rojas directamente a β-(1 → 4)-glucanos y particularmente y celulosa 8,10,11. Calcoflúor manchas blancas brillantemente la epidermis, la corteza, y la médula pero que el brillo se reduce significativamente en el xilema y fibras interfasciculares. Hay dos pexplicaciones osibles para la reducción de la fluorescencia de blanco calcoflúor en los tejidos lignificados en gran medida; se atribuye a la presencia de lignina, lo que, a su vez, reducir la capacidad de blanco calcoflúor para difundir correctamente a través de los polisacáridos. A segundo puntos de explicación a un sofocado parcial de la fluorescencia emitida por el blanco de calcoflúor excitado bajo UV. En contraste a blanco de calcoflúor, tinción con rojo Congo parece menos afectado por la presencia de lignina. Se podría estar relacionada con la diferencia en las propiedades de fluorescencia entre calcoflúor blanco y rojo Congo; una mejor capacidad de difusión de rojo Congo a través de los tejidos lignificados que calcofluor blanco; o una ligera diferencia en las propiedades de unión de polisacáridos 22. Es importante señalar que las secciones teñidas con rojo congo no deben ser almacenados demasiado tiempo antes de formación de imágenes, porque rojo congo tiende a ser arrastrados en el agua.
Aunque la tinción histoquímica es ni cuantitativani absolutamente concluyentes, puede revelar a través de señales visuales de una gran cantidad de información acerca de características importantes, como la integridad de los tejidos o deposición de la pared celular anormal y la lignificación. Las técnicas de tinción descritos anteriormente son fáciles de realizar y son aplicables para elementos críticos en una pared de célula de la planta, tales como la lignina y la celulosa. Por el contrario, se requiere inmunofluorescencia utilizando antisueros específicos y anticuerpos monoclonales para la detección de diversos componentes de hemicelulosa y pectina. Este informe está destinado a servir como un manual para los principiantes en el campo de la coloración de la pared celular secundaria que usan A. thaliana como sistema modelo.
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Acknowledgments
Estamos agradecidos a Sabin Russell para asistencia en la edición. Este trabajo formó parte de la Joint BioEnergy Institute DOE (http://www.jbei.org) apoyado por el Departamento de Energía de los EE.UU., Oficina de Ciencia, Oficina de Investigación Biológica y Ambiental, a través del contrato DE-AC02-05CH11231 entre Lawrence Berkeley Laboratorio Nacional y el Departamento de Energía de EE.UU..
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | EMD | MERC2125 | CAS Number: 9012-36-6 |
| Phloroglucinol | Sigma | P 3502 | 1,3,5-trihydroxybenzene [CAS Number: 108-73-6] |
| Hydrochloric acid | EMD | HX0603-75 | CAS Number: 7647-01-0 |
| Ammonium hydroxide | EMD | AX1303-6 | CAS Number: 1336-21-6 |
| Toulidine Blue O | Sigma | T3260 | Blutene chloride, Tolonium Chloride [CAS Number 92-31-9] |
| Potassium permanganate | Sigma | 223468 | CAS Number 7722-64-7 |
| Ethanol 190 proof | KOPTEC | V1401 | CAS Number: 64-17-5 |
| Congo Red | Sigma | C6277 | Disodium 3,3'-[[1,1'-biphenyl]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaphthalene 1-sulphonate) [CAS Number 573-58-0] |
| Fluorescent Brightener 28/ Calcofluor White Stain | Sigma | F3543 | 4,4'-Bis[[4-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbene-2,2'-disulphonic acid [CAS Number 4404-43-7] |
| Vibratome | Leica | Leica Vibrating blade microtome VT1000S | http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/ |
| Razor | American Safety razor company | Item # 60-0139-0000 | Stainless Steel Double Edge Blade (Personna Super) |
| Screw Cap Microcentrifuge Tubes (2 ml) | VWR | 16466-044 | |
| Microcentrifuge Tubes (0.6 ml) | Axygen Scientific | MCT-060-C | |
| Mitt | Bel-Art | 380000000 | SCIENCEWARE Hot Hand Protector Mitt |
| Tissue adhesive | Ted Pella Inc | 10033 | Store at 4 °C or 20 °C for 3 months or longer storage |
| Microwave | Panasonic | NN-SD762S | PELCO Pro CA 44 Instant tissue adhesive |
| Camera with CCD chip with no mechanical shutter | Hamamatsu | C4742-95 | |
| High speed color camera | QImaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Camera software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.7.0.0 | |
| Imagining anaylsis | Adobe | Photoshop CS4 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1 | VWR | 48366-067 | 22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Cover glasses are corrosion-resistant and uniformly thick and flat. No. 1 thickness is 0.13 to 0.17 mm. |
| Frosted Micro Slides, 1 mm | VWR | 48312-003 | 75 x 25 mm - 1 mm |
| Parafilm M | Alcan packaging | BRNDPM998 | |
| TX2 Filter cube | Leica | 11513851/11513885 | Filter used for Congo red analysis with a band-pass of 560/40. |
References
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