Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Overvågning Aktivering af Antiviral Mønstergenkendelse Receptorer RIG-I og PKR Af Limited proteasefordøjelse og Native SIDE

Published: July 29, 2014 doi: 10.3791/51415
Automatic Translation
1, 1
1Institute for Virology, Philipps-University Marburg

Summary

Medfødte forsvar mod virusinfektioner er udløst af mønstergenkendelse receptorer (PRRS). De to cytoplasmatiske PRRs RIG-I og PKR binder til virale signatur RNA'er, ændre kropsbygning, oligomerisere og aktivere antiviral signalering. Metoder er beskrevet som tillader bekvemt overvåge konformationelle kobling og oligomerisering af disse cytoplasmatiske PRRs.

Abstract

Værtsforsvarene til virusinfektion afhænger af en hurtig påvisning af mønstergenkendelse receptorer (PRRS) af det medfødte immunsystem. I cytoplasmaet, PRRS RIG-I og PKR binder til specifikke virale RNA-ligander. Denne første medierer konformationelle kobling og oligomerisering, og derefter kan aktivering af et antiviralt interferon respons. Mens metoder til måling af antiviral vært genekspression er godt etableret, metoder til direkte at overvåge aktivering stater i RIG-I og PKR kun er delvist og mindre veletableret.

Her beskriver vi to metoder til at overvåge RIG-I og PKR stimulation ved infektion med en etableret interferon inducer, Rift Valley fever virus mutant klon 13 (Cl 13). Begrænset trypsinfordøjelse gør det muligt at analysere ændringer i protease følsomhed, hvilket indikerer, konformationelle ændringer af PRRS. Trypsinfordøjelse af lysater fra mock-inficerede celler resulterer i hurtig nedbrydning af RIG-I og PKR whereas Cl 13 infektion fører til fremkomsten af ​​en protease-resistente RIG-I-fragment. Også PKR viser en virus-induceret delvis resistens over for trypsinfordøjelse, som er sammenfaldende med dens stempel phosphorylering Thr 446. Dannelsen af ​​RIG-I og PKR oligomerer blev valideret ved nativ polyacrylamidgelelektroforese (PAGE). Efter infektion, er der en stærk ophobning af RIG-I og PKR oligomere komplekser, hvorimod disse proteiner forblev som monomerer i mock inficerede prøver.

Begrænset proteasespaltning og indfødte SIDE, begge koblet til western blot analyse, tillade en følsom og direkte måling af to forskellige trin i RIG-I og PKR aktivering. Disse teknikker er forholdsvis nem og hurtig at udføre og ikke kræver dyrt udstyr.

Introduction

En afgørende begivenhed i antiviral vært forsvar er hurtig påvisning af patogenet ved de såkaldte mønstergenkendelse receptorer (PRRS) 1,2. Intracellulær påvisning af RNA-virus infektion er afhængig af to cytoplasmiske RNA-helicaser, RIG-I (retinsyre inducerbart gen I) og MDA5 (melanomer differentiering associeret protein 5) 3-5. RIG-I består af to N-terminale caspase rekruttering domæner (kort), en central DECH-box type RNA helicasedomænet og et C-terminalt domæne (CTD) 4,6. Mens CTD og helicasedomænet er nødvendige for anerkendelse af ikke-selv (viral) RNA, kortene mægle nedstrøms signalering fører til etablering af et antiviralt vært status.

Hvis RIG-I er i lydløs tilstand, dvs i mangel af en specifik RNA-ligand, det andet kort interagerer med den centrale helicasedomænet og holder RIG-I i en auto-hæmmende kropsbygning 7-11. RIG-I binder til kort double-streng (ds) RNA, der bærer en 5'-triphosphat (5'PPP) lang dsRNA og polyuretan / UC-rigt RNA, klassiske signatur strukturer, som er til stede på genomerne af mange RNA-vira 12-16. To vigtige karakteristika af RIG-I-aktivering er et skifte til en lukket kropsbygning 6,17 og homo-oligomerisering 6,18,19. Den konforme afbryder øger RNA-binding, udsætter Cards til downstream signalering, og genopretter en aktiv ATPase sted 8,9,11,20. Dannelsen af oligomere RIG-I-komplekser fører til øget rekruttering af downstream signalering adaptormolekyler at danne en platform for antiviral signaltransduktion 11. Den RIG-I-reguleret signalering kæde sidst aktiverer transkriptionsfaktor IRF-3 til opregulering af interferon (IFN-alpha/beta)-gener og dermed gen-ekspression af interferon-stimuleret gener (ISGs) for en fuld antiviralt respons 21,22 . En af de bedst karakteriserede ISGs er RNA-aktiverede Protein-kinase (PKR) 23. PKR hører til familien af ​​eukaryote translationsinitiering faktor 2 alfa (eIF2α) kinaser og er sammensat af en N-terminal dobbeltstrenget RNA-bindende domæne og en C-terminal kinase domæne. Kinasedomænet udgør dimeriseringsgrænseflade afgørende for PKR aktivering og udfører de katalytiske funktioner af proteinet. Binding af PKR viral dsRNA fører til dets konformationsændring tillader dimerisering og auto-phosphorylering Thr 446 blandt andre rester. PKR så medierer phosphorylering af eIF2α derved blokerer translation af viral mRNAs 23-27.

Både RIG-I og PKR gennemgå store strukturelle omrokeringer, danner oligomere komplekser og er posttranslatorisk modificeret ved phosphorylering / defosforylering og ubiquitination 10,11,19,23,24,26-29. For en bedre forståelse af, hvilke virale RNA-strukturer aktiverer RIG-I og PKR (og på hvilket tidspunkt virale antagonister kunne be interfererende), er det vigtigt præcist at bestemme status aktivering. For begge PRRs det tidligere blev beskrevet, at aktiveringen fører til fremkomsten af trypsin-resistente protein fragmenter 6,17,30 og højere orden oligomerer 6,18,19. Men i betragtning af væld af litteratur om disse centrale faktorer i den antivirale værtsrespons 1,2,24 synes forholdsvis sjældne anvendelsen af direkte metoder. I håb om at stimulere en bredere anvendelse, giver vi praktiske og følsomme protokoller til håndfast analysere aktivering stater i RIG-I og PKR. Den IFN kompetent human cellelinie A549 er inficeret med en etableret aktivator af RIG-I og PKR, den svækkede Rift Valley fever virus mutant klon 13 (Cl 13) 31,32. Efter en enkel lyserende procedure, er ekstrakter af inficerede celler testet af begrænset trypsinfordøjelse / western blot analyse for at vurdere konformationel switching, og ved blå indfødte polyakrylamidgelelektroforese (PAGE) / Western blot analyser at måle dannelsen af ​​oligomerer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Såning af A549 Celler til infektion

  1. Dyrke en T75 kolbe af A549-celler ved 37 ° C og 5% CO2 i celledyrkningsmedium (DMEM suppleret med 10% FCS, 526,6 mg / l L-glutamin, 50.000 U / l penicillin og 50 mg / l streptomycin).
  2. Inden man begynder at høste cellerne varme op celledyrkningsmediet PBS og 0,05% trypsin-EDTA i et vandbad opvarmet til 37 ° C.
  3. Fjern mediet og vaske cellerne med 10 ml PBS. Fjern PBS igen.
  4. Tilsæt 3 ml trypsin-EDTA og distribuere ligeligt i kolben. Overfør kolben i en inkubator med 37 ° C og 5% CO2.
  5. Når alle celler er adskilt, tilsættes 7 ml celledyrkningsmedium, resuspenderes cellerne og overføre cellesuspensionen i et 15 ml Falcon-rør.
  6. Centrifuger cellerne ved 800 x g i 5 minutter ved stuetemperatur, supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i 10 ml frisk celledyrkningsmedium.
  7. Tæl celler med et tællekammer.
  8. Tilføj 2,5 x 10 6 celler i 5 ml cellekulturmedium i to T25 kolber hver. Der inkuberes i 16 timer ved 37 ° C og 5% CO2. En kolbe tjener til mock kontrol og én for Cl 13-infektion.

2.. Infektion med Rift Valley Fever virus klon 13 (Cl 13)

  1. BEMÆRK: Cl 13 er et svækket virus mutant, som i Tyskland, kan håndteres under BSL-2 anførte betingelser. Der henvises til de relevante nationale retningslinjer. Andre typiske IFN inducere ville være Sendai-virus (stamme Cantell) eller Newcastle disease-virus.
  2. Forvarm PBS, serum-frit medium, og celle-dyrkningsmedium indeholdende 5% FCS.
  3. Forbered 1,25 x 10 7 PFU / ml Cl 13 i serum-frit medium til at inficere 2,5 x 10 6 A549-celler med en multiplicitet af infektion (MOI) af 5. Forbered et svagt (ca. 10%) større mængde end nødvendigt for at tage højde for pipette fejl.
  4. Vask cellerne med PBS som beskrevet under 1.3.
  5. Tilsæt 1 ml af Cl 13 fortynding ellerserumfrit medium (inficerede kontrol, mock) til cellerne og inkuberes i 1 time ved 37 ° C og 5% CO2. Flyt blandes omhyggeligt hver 15 min for at sikre en ligelig fordeling af Cl 13 fortynding og serum-frit medium, hhv.
  6. Efter 1 time for infektion, fjern inokula, tilsættes 5 ml foropvarmet cellekulturmedium med 5% FCS og inkuberes i 5 timer ved 37 ° C og 5% CO2.

3.. Fremstilling af cellelysater

  1. Forbered PBS / 0,5% Triton X-100 ved 4 ° C. Tilsæt ikke serinproteaseinhibitorer.
  2. Vask cellerne med kold PBS, og der tilsættes 10 ml frisk PBS.
  3. Skrabe cellerne fra overføre cellesuspensionen i et Falcon-rør og centrifugeres ved 800 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
  4. Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 30 pi PBS / 0,5% Triton X-100. Overfør lysatet til en frisk 1,5 ml rør og inkuberes i mindst 10 minutter ved 4 ° C.
  5. Centrifuger lysatet 10.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C og overføre den klarede cellelysat (supernatant) i et frisk rør.
  6. Bestem koncentrationen protein ved Bradford-assay som beskrevet andetsteds 33.
  7. Opbevar ved -20 ° C eller videre til trypsinfordøjelse (4.1) eller native PAGE (5.1).

4.. Bestemmelse af konformationsændringer af Mønstergenkendelse Receptorer

  1. TPCK-trypsin Behandling af cellelysater
    1. L-1-tosylamido-2-phenylethyl chlormethylketon-behandlede (TPCK) trypsin fortyndes i PBS til en endelig bearbejdning koncentration på 2 pg / pl.
    2. Juster i to nye rør en endelig proteinkoncentration på 25 ug af hvert protein lysat (mock eller Cl 13) i et slutrumfang på 9 pi med PBS. Derfor bør det være fire rør med 25 ug lysat hver, to gange mock og to gange Cl 13 infektion. Et sæt som input kontrol (ubehandlet) og et sæt til behandling med TPCK-trypsin.
    3. Tilsæt 1 pi PBS (ubehandlet)eller 1 pi af 2 pg / pl TPCK-trypsin (slutkoncentration: 0,2 pg / pl) til cellelysaterne og bland reaktionerne ved pipettering. IKKE fryse og tø TPCK-trypsin portioner, fordi det vil kompromittere effektiviteten af ​​fordøjelsen.
    4. Inkuber lysaterne ved 37 ° C i 25 min. Reaktionen standses ved tilsætning af 5x denaturerende prøvepuffer (250 mM Tris-HCI pH 6,8, 10% SDS, 50% glycerol, 25% β-mercaptoethanol, 0,5% bromphenolblåt), og ved kogning i 5 minutter ved 95 ° C. Det er vigtigt ikke at forlænge trypsin inkubationstid. I tilfælde ingen proteaseresistente fragmenter kan påvises, skal tidspunktet for trypsinfordøjelse forkortes.
    5. Efter kogning, kan prøverne opbevares ved -20 ° C.
  2. SDS-polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) og Western Blotting
    1. Læg prøverne på en natriumdodecylsulfat (SDS) polyacrylamidgel indeholdende en 5% stacking over en 12% adskillelsesgelen. Adskille proteiner ved 25 mA per gel, indtilbromphenolblåt løber ud.
    2. Aktiver en polyvinylidenfluorid (PVDF) membran til 30 sek med methanol og sætte det ind i transfer buffer (48 mM Tris, 39 mM glycin, 1,3 mM SDS, 20% methanol).
    3. Forbered blotting med en halvtør blotting, og tillade overførsel af proteinerne ved 10 V i 1 time. Tag membranen ud, skyl den kortvarigt med vand, og lad det tørre.
    4. Genaktiver membranen ved kort at overføre til methanol. Vask i 5 minutter med TBS. Blok med 10% skummetmælk i TBS i 1 time ved stuetemperatur eller ved 4 ° CO / N. Vask membranen 3x i 5 min hver med TBS.
    5. Forbered antistoffortynding som anbefalet i tabel 1 og inkuberes membranen i 1 time ved stuetemperatur eller ved 4 ° CO / N.
    6. Vask membranen 3x i 10 min med TBS-T. Tilsættes en passende sekundært antistof koblet til peberrodsperoxidase i en 1:20.000 fortynding i 1% skummetmælk i TBS. Inkuber 45 min ved RT.
    7. Vask membranen 3x i 10 min med TBS-T, og one ekstra tid med TBS.
    8. Til påvisning signal bruge en kommerciel Chemiluminescens kit og en digital gel imaging system.
  3. Coomassie Brilliant Blue G-250 Farvning
    1. Udfør SDS-PAGE, som beskrevet i 4.2.1. Load prøver på en SDS-polyacrylamidgel og køre gel ved 25 mA pr gel indtil bromphenolblåt løber ud.
    2. Udfør Coomassie Brilliant Blue G-250 farvning ved RT. Har alle inkubationer under konstant omrystning.
    3. Overfør gelen til fiksering opløsning indeholdende 40% methanol og 10% eddikesyre i 30 minutter.
    4. Udskift buffer til Affarvningsopløsningen (25% ethanol og 8% eddikesyre) og inkuberes i 5 min.
    5. Farv gelen med 0,2% Coomassie Brillant Blå G-250 i 40% methanol og 10% eddikesyre i 1 time.
    6. Affarvning af gelen med Affarvningsopløsningen og udveksle puffer efter 10 min, 30 min og 60 min.
    7. Opbevar gel i 25% ethanol, og 8% eddikesyre og 4% glycerol ved 4 ° C. Udføre billedbehandling og analyse som beskrevet under 4.2.8.

5.. Analyse af Oligomert stater Mønstergenkendelse Receptorer

  1. Native SIDE
    1. Forbered 50 ug af cellelysat i et slutvolumen på 10 pi med PBS, og der tilsættes 5 × native prøvepuffer (250 mM Tris-HCI pH 6,8, 1% natriumdeoxycholat, 50% glycerol, 0,5% bromphenolblåt) til en slutkoncentration på 1x.
    2. Load prøverne OMGÅENDE på en indfødt polyakrylamidgel med 5% som stabling og 8% som at løse gel. Enhver forsinkelse vil resultere i et tab af indfødte komplekser 34.
    3. Kør gelen ved 20 mA per gel ved 4 ° C med 50 mM Tris-NaOH, pH 9,0, 384 mM glycin som som anode og 50 mM Tris pH 8,3, 384 mM glycin, 1% natriumdeoxycholat som katode buffer. Efter 1,5-2 time (bromphenolblå bandet har forladt gelen ca 45 min tidligere) elektroforese er færdig.
  2. Western Blotting
    1. Aktiver en polyvinylidene fluorid (PVDF) membran til 30 sek med methanol og sætte det ind i Towbin buffer (25 mM Tris, 192 mM glycin, 0,1% SDS, 20% methanol).
    2. Saml en våd skamplet kammer i henhold til producentens anvisninger og fyld tanken med towin buffer.
    3. Udfør blotting med 250 mA i 1,5 time ved 4 ° C.
    4. Når blotting er færdig fortsæt som beskrevet fra 4.2.3 om.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Anerkendelsen af en viral agonist ved RIG-I eller PKR udløser konforme skift 6,17,30 og oligomerisering 6,18,27. Vi analyseret disse to aktiveringsmarkører ved begrænset proteasenedbrydning og nativ polyacrylamidgelelektroforese (PAGE), hhv.

Humane A549-celler blev inficeret med Rift Valley fever virus klon 13 (Cl 13), der er kendetegnet ved en mutation af IFN-antagonist NSS 35,36. På grund af fraværet af funktionelle NSS, Clone 13 stærkt fremmende RIG-I og PKR, der fører til oprettelse af en robust antiviral tilstand i cellerne 12,31,32,37.

Trypsinfordøjelse mock inficerede cellelysater resulterer i en hurtig nedbrydning af RIG-I, mens Cl 13-infektion fører til dannelsen af et 30 kDa resistent RIG-fragment 1A. Også PKR viser delvis resistens over for trypsinfordøjelse i inficerede prøver, der falder sammen med dens Phosphorylation figur 1A. Hvis du vil overvåge effektiviteten og specificiteten af ​​trypsinfordøjelse blev geler farvet med Coomassie Brilliant Blue G-250. Ubehandlede prøver viser lige store mængder af læsset proteiner figur 1B. Udsættelse mock og Cl 13 cellelysater til trypsinfordøjelse fører til et sammenligneligt fald i den globale protein beløb. Dette viser, at trypsinbehandling har samme effektivitet for mock og Cl 13-inficerede prøver.

Dannelsen af ​​oligomere komplekser blev analyseret ved hjælp af nativ PAGE. I ikke-inficerede celler, blev der kun monomerer af RIG-I og PKR detekteret fig. 2. Som yderligere kontrol vi medtaget transkriptionsfaktoren IRF-3, der er til stede som en monomer, men vides at dimerisere efter aktivering via f.eks RIG-I 38. Cl 13-infektion fører til en kraftig ophobning af RIG-I oligomere komplekser i form af et udstrygningspræparat og PKR og IRF-3 dimerer / oligomerer som defineret proteinbånd.

class = "jove_content"> Disse resultater viser, at begrænset trypsinfordøjelse og indfødte SIDE er nyttige værktøjer til at overvåge konformationsændringer og oligomer dannelse af RIG-I og PKR ved infektion.

Figur 1
Figur 1. Konformationsanalyse skift af RIG-I og PKR. A549-celler blev fingeret inficeret eller inficeret med Cl 13 ved en MOI på 5. Efter 5 timer blev cellerne lyseret i PBS suppleret med 0,5% Triton X-100 og blokerede cellelysater var enten venstre ubehandlet eller behandlet med trypsin. Prøver blev underkastet SDS PAGE efterfulgt af Western blotting (A) eller Coomassie-farvning (B). Blots blev farvet mod RIG-I, PKR phosphoryleret PKR (Thr 446) og imod RVFV nukleoprotein (RVFV N) og beta-actin som infektion og påsætningskontrol hhv._blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Oligomerisering af RIG-I, PKR og IRF-3. Cellelysater af mock og Cl 13-inficerede cellelysater blev underkastet nativ PAGE efterfulgt af Western blot analyse. Farvning blev udført med antistoffer mod RIG-I, PKR IRF-3 og beta-actin som loading kontrol. PKR oligomerer udgør sandsynligvis dimerer 27. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sensing tilstedeværelsen af virus og aktivering af det antivirale type I IFN-systemet er afgørende for en vellykket medfødte immunrespons 22. Virusdetektering derved medieret af patogen anerkendelse receptorer (PRRS) ligesom RIG-I og PKR, der muliggør en hurtig reaktion og aktivering af antivirale forsvarsmekanismer. Her beskriver vi to metoder til direkte at vurdere aktiveringsstatus RIG-I og PKR.

Begrænset proteasefordøjelse som et redskab til at overvåge konformationsændringer af RIG-I og PKR blev først beskrevet af de grupper af M. Gale Jr. og T. Fujita 6,17, og JL Cole 30, hhv. Den repræsenterer en følsom metode til at evaluere følsomheden ændringer af trypsinbehandling forårsaget af konformationsændringer. Anvendelse trypsinfordøjelse, vi opdaget hurtig nedbrydning af RIG-I og PKR i mock inficerede prøver, hvorimod trypsinbehandling af virusinficerede cellelysater førte til trypsin resistente RIG-I-fragmenter. SimilArly blev en trypsin resistent PKR fragment påvises ved Cl 13-infektion. Dette blev ledsaget af PKR phosphorylering ved Thr 446, en udbredt markør for PKR aktivering. Sammenligning trypsinfordøjelse mock og Cl 13 cellelysater efter Coomassie-farvning viser en sammenlignelig reduktion af den globale protein niveauer. Dette indikerer, at dannelsen af ​​resistente fragmenter er specifik for proteiner som RIG-I og PKR.

Dannelsen af ​​oligomere komplekser af RIG-I, PKR og IRF-3 blev overvåget af indfødte SIDE. Udsættelse Cl 13-inficerede cellelysater til native PAGE, vi opdaget RIG-I, PKR og IRF-3 oligomerer, hvorimod disse proteiner forblev som monomerer i mock inficerede prøver. RIG-Jeg er nødt til at danne oligomerer aktiverer nedstrøms veje. Hypotesen var, at RIG-I oligomerisation understøtter rekruttering af co-faktorer til at danne en signalering platform for antivirale reaktionsmekanismer 11. Funktionen af ​​PKR dimerisering er ikke helt forstået. Mest sandsynligt, at PKR underenheder dimeren phosphorylere hinanden 25. Type I IFN-systemet reguleres stramt på transskriptionsniveau og IRF-3 repræsenterer en central transkriptionsfaktor til induktion af IFN og ISGs 38. Centrale kendetegnende for aktivering er phosphorylering dimerisering og translokation til kernen, hvor det rekrutterer transkriptionel co-aktivatorer p300 og CREB-bindende protein (CBP) at indlede IFN mRNA-syntese 21,39. Analyse af IRF-3 dimerisering er et udbredt værktøj til at overvåge aktivering af type I IFN respons 38.. Derfor brugte vi påvisning af IRF-3 oligomere komplekser som et bevis på princippet de oligomeriserende analyser af RIG-I og PKR oligomerisering. Faktisk tillader adskillelse af proteinlysater under ikke-denaturerende betingelser, var vi i stand til at opdage IRF-3 dimerisering i Cl 13 inficerede prøver.

Utvivlsomt vil hver lab nødt til at optimere protokollerne for begrænset protease Digeforbrændingen og indfødte SIDE. Hvis konfronteret med ingen påvisning af eventuelle resistente proteiner eller for mange resistente fragmenter, kunne man forkorte eller forlænge tidspunktet for fordøjelsen, hhv. Forskelle kan også skyldes den specifikke TPCK-trypsin lager, som præparater variere lidt. Derfor bør de forskellige TPCK-trypsin koncentrationer testes for optimering. Cellelysater kan fremstilles af andre cellelinjer end A549, men tilpasninger af protokollen kan være påkrævet. Det anbefales at justere mængden af ​​totale proteiner for trypsinfordøjelse og nativ PAGE ifølge ekspressionsniveauet af proteinet af interesse i dette specifikke celletype. Desuden kan begrænset detektering eller svag adskillelse af oligomere komplekser af indfødte SIDE have flere årsager, og kan håndteres som følger: Sørg for, at udstyret er renses for at fjerne de resterende denatureringsmidler, holde alle prøver og gelen under SIDE ved 4 ° C , og ikke forlænge tiden mellem forberedelse og loa prøveding på gelen. Begrænset proteasespaltning og nativ PAGE er også blevet anvendt til at overvåge aktivering af en anden vigtig nært beslægtet PRR, MDA5 40-42. Overvågning af MDA5 aktivering kræves forskellige eksperimentelle betingelser i forhold til RIG-I og PKR, og blev derfor ikke medtaget her.

Sammenfattende er punkt-for-punkt protokoller for to nyttige og følsomme metoder til at måle aktivering af RIG-I og PKR præsenteres. Begrænset proteasespaltning og indfødte SIDE, begge koblet til Western blot-analyse, tilladelse overvågning af konformationsændringer og oligomerisering, hhv. Ved hjælp af disse metoder, vi havde tidligere vist, at RIG-Jeg kan aktiveres ved nukleocapsider af forskellige vira direkte efter deres indtræden i cellerne 32.

Den nøjagtige art og oprindelse af RNA-arter, der er relevante for RIG-I og PKR aktivering i inficerede celler er stadig ikke helt løst. Desuden har mange vira forstyrrefunktioner PRRS ved en lang række strategier 12,43-46. De præsenterede teknikker udvide spektret af metoder ved at lade en let og direkte måling af RIG-I og PKR aktivering, er hurtige til at udføre, og ikke kræver dyrt udstyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Vi takker Alejandro Brun fra CISA-INIA for at levere anti-Rift Valley fever virus sera. Arbejde i vores laboratorier er støttet af Forschungsförderung perle. § 2 Abs. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum Giessen und Marburg, Leibniz Graduate School for Emerging virussygdomme (EIDIS) DFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021, og DFG Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Gibco 21969-035
OptiMEM Gibco 31985-47
L-glutamine PAA 25030-024
Penicillin-streptomycin PAA 15070-063
Fetal calf serum (FCS) PAA 10270
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
Chemicals
L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin Sigma Aldrich T1426
Antibodies
Mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1) Enzo Life Sciences ALX-804-849-C100 WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS
Mouse monoclonal anti-PKR (B10) Santa Cruz sc-6282 WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS
Rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446) Epitomics 1120-1 WB: 1:1,000 in 5% BSA in TBS
Rabbit polyclonal anti-IRF-3 Santa Cruz sc-9082 WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS
Rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386) IBL og-413 WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS
Rabbit anti-RVFV hyperimmune serum "C2" (MP-12) Kindly provided by Alejandro Brun CISA-INIA WB: 1:2,000 in 1% skim milk in TBS
Mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10) Cell Signalling 3700 WB: 1:1,000 in 1% skim milk in TBS
Polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit Thermo Fisher 0031460 1892914 WB: 1:20,000 in 1% skim milk in TBS
Polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse Thermo Fisher 0031430 1892913 WB: 1:20,000 in 1% skim milk in TBS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gurtler, C., Bowie, A. G. Innate immune detection of microbial nucleic acids. Trends in Microbiology. 21, 413-420 (2013).
  2. Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
  3. Kato, H., Takahasi, K., Fujita, T. RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for non-self RNA. Immunological Reviews. 243, 91-98 (2011).
  4. Yoneyama, M., et al. The RNA helicase RIG-I has an essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses. Nature Immunology. 5, 730-737 (2004).
  5. Andrejeva, J., et al. The V proteins of paramyxoviruses bind the IFN-inducible RNA helicase, mda-5, and inhibit its activation of the IFN-beta promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17264-17269 (2004).
  6. Saito, T., et al. Regulation of innate antiviral defenses through a shared repressor domain. in RIG-I and LGP2 Proc Natl Acad Sci USA. 104, 582-587 (2007).
  7. Ferrage, F., et al. Structure and dynamics of the second CARD of human RIG-I provide mechanistic insights into regulation of RIG-I activation. Structure (London, England : 1993). 20, 2048-2061 (2012).
  8. Kolakofsky, D., Kowalinski, E., Cusack, S. A structure-based model of RIG-I activation. 18, RNA. New York, NY. 2118-2127 (2012).
  9. Luo, D., Kohlway, A., Vela, A., Pyle, A. M. Visualizing the determinants of viral RNA recognition by innate immune sensor RIG-I. Structure (London, England : 1993). 20, 1983-1988 (2012).
  10. Kowalinski, E., et al. Structural basis for the activation of innate immune pattern-recognition receptor RIG-I by viral RNA. Cell. 147, 423-435 (2011).
  11. Luo, D., et al. Structural insights into RNA recognition by RIG-I. Cell. 147, 409-422 (2011).
  12. Habjan, M., et al. Processing of genome 5" termini as a strategy of negative-strand RNA viruses to avoid RIG-I-dependent interferon induction. PloS One. 3, e2032 (2008).
  13. Rehwinkel, J., Reis, E. S. C. Targeting the viral Achilles' recognition of 5'-triphosphate RNA in innate anti-viral defence. Current Opinion in Microbiology. 16, 485-492 (2013).
  14. Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates. , Science. New York, NY. 314-997 (2006).
  15. Hornung, V., et al. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. , Science. New York, N.Y. 314-994 (2006).
  16. Saito, T., Gale, M. Differential recognition of double-stranded RNA by RIG-I-like receptors in antiviral immunity. The Journal of Experimental Medicine. 205, 1523-1527 (2008).
  17. Takahasi, K., et al. Nonself RNA-sensing mechanism of RIG-I helicase and activation of antiviral immune responses. Mol Cell. 29, 428-440 (2008).
  18. Binder, M., et al. Molecular mechanism of signal perception and integration by the innate immune sensor retinoic acid-inducible gene-I (RIG-I). J Biol Chem. 286, 27278-27287 (2011).
  19. Jiang, X., et al. Ubiquitin-induced oligomerization of the RNA sensors RIG-I and MDA5 activates antiviral innate immune response. Immunity. 36, 959-973 (2012).
  20. Civril, F., et al. The RIG-I ATPase domain structure reveals insights into ATP-dependent antiviral signalling. EMBO reports. 12, 1127-1134 (2011).
  21. Hiscott, J. Triggering the innate antiviral response through IRF-3 activation. The Journal of Biological Chemistry. 282, 15325-15329 (2007).
  22. Hertzog, P. J., Williams, B. R. Fine tuning type I interferon responses. Cytokin., & Growth Factor Reviews. 24, 217-225 (2013).
  23. Pindel, A., Sadler, A. The role of protein kinase R in the interferon response. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 31, 59-70 (2011).
  24. Donnelly, N., Gorman, A. M., Gupta, S., Samali, A. The eIF2alpha kinases: their structures and functions. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 70, 3493-3511 (2013).
  25. Cole, J. L. Activation of PKR an open and shut case. Trends in Biochemical Sciences. 32, 57-62 (2007).
  26. Dauber, B., Wolff, T. Activation of the Antiviral Kinase PKR and Viral Countermeasures. Viruses. 1, 523-544 (2009).
  27. Dey, M., et al. Mechanistic link between PKR dimerization, autophosphorylation, and eIF2alpha substrate recognition. Cell. 122, 901-913 (2005).
  28. Gack, M. U., et al. TRIM25 RING-finger E3 ubiquitin ligase is essential for RIG-I-mediated antiviral activity. Nature. 446, 916-920 (2007).
  29. Zeng, W., et al. Reconstitution of the RIG-I pathway reveals a signaling role of unanchored polyubiquitin chains in innate immunity. Cell. 141, 315-330 (2010).
  30. Anderson, E., Cole, J. L. Domain stabilities in protein kinase R (PKR): evidence for weak interdomain interactions. Biochemistry. 47, 4887-4897 (2008).
  31. Habjan, M., et al. NSs protein of rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. Journal of Virology. 83, 4365-4375 (2009).
  32. Weber, M., et al. Incoming RNA virus nucleocapsids containing a 5'-triphosphorylated genome activate RIG-I and antiviral signaling. Cell Hos., & Microbe. 13, 336-346 (2013).
  33. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  34. Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native. 5, 4338-4346 (2005).
  35. Muller, R., et al. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am J Trop Med Hyg. 53, 405-411 (1995).
  36. Bouloy, M., et al. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. Journal of Virology. 75, 1371-1377 (2001).
  37. Ikegami, T., et al. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathogens. 5, e1000287 (2009).
  38. Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes to Cells : Devoted to Molecula., & Cellular Mechanisms. 6, 375-388 (2001).
  39. Yoneyama, M., Suhara, W., Fujita, T. Control of IRF-3 activation by phosphorylation. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 22, 73-76 (2002).
  40. Bamming, D., Horvath, C. M. Regulation of signal transduction by enzymatically inactive antiviral RNA helicase proteins MDA5 RIG-I and LGP2. The Journal of Biological Chemistry. 284, 9700-9712 (2009).
  41. Wu, B., et al. Structural basis for dsRNA recognition, filament formation, and antiviral signal activation by MDA5. Cell. 152, 276-289 (2013).
  42. Berke, I. C., Modis, Y. MDA5 cooperatively forms dimers and ATP-sensitive filaments upon binding double-stranded RNA. The EMBO Journal. 31, 1714-1726 (2012).
  43. Garcia-Sastre, A. Induction and evasion of type I interferon responses by influenza viruses. Virus Research. 162, 12-18 (2011).
  44. Taylor, K. E., Mossman, K. L. Recent advances in understanding viral evasion of type I interferon. Immunology. 138, 190-197 (2013).
  45. Goodbourn, S., Randall, R. E. The regulation of type I interferon production by paramyxoviruses. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 29, 539-547 (2009).
  46. Versteeg, G. A., Garcia-Sastre, A. Viral tricks to grid-lock the type I interferon system. Current Opinion in Microbiology. 13, 508-516 (2010).

Tags

Infektionssygdomme medfødte immunrespons virusinfektion patogen genkendelse receptor RIG-I PKR IRF-3 begrænset proteasespaltning konformational switch indfødte PAGE oligomerisering
Overvågning Aktivering af Antiviral Mønstergenkendelse Receptorer RIG-I og PKR Af Limited proteasefordøjelse og Native SIDE
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weber, M., Weber, F. Monitoring… More

Weber, M., Weber, F. Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE. J. Vis. Exp. (89), e51415, doi:10.3791/51415 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter