Summary
Беременность приводит к значительным изменениям в составе жирных кислот материнских тканей. Профили липидов могут быть получены с помощью газовой хроматографии, чтобы идентификация и количественное определение жирных кислот в отдельных классов липидов среди крыс, которых кормили различные высокие и низкие жиров диеты во время беременности.
Abstract
Метод газовой хроматографии (ГХ) является высокочувствительным методом, используемым для идентификации и количественного содержания жирных кислот липидов из тканей, клеток и плазмы / сыворотки, дает свои результаты с высокой точностью и высокой воспроизводимости. В исследованиях метаболических и питания GC позволяет оценить изменения концентрации жирных кислот следующих мероприятий или во время изменений в физиологическом состоянии, как беременность. Добыча твердой фазы (SPE) с помощью аминопропил кремнезема картриджей позволяет разделение основных классов липидов, включая триацилглицеринов, различных фосфолипидов, и эфиров холестерина (CE). ГК в сочетании с SPE был использован для анализа изменений в составе жирных кислот СЕ фракции в печени целинных и крыс, которые были кормили различные высокие и низкие жиров диеты. Существуют значительные эффекты взаимодействия диета / беременность от содержания омега-3 и омега-6 жирных кислот печени CE, указывая, что беременные самки имеют различный ответ на диетического manipulatионный, чем видно среди девственных самок.
Introduction
Метод газовой хроматографии (ГХ) является устоявшихся метод, используемый для идентификации и количественного включение жирных кислот в липидные бассейнов и клеточных мембран 1,2 во добавок или физиологических условиях, таких как ожирение (и связанных с ним заболеваний, таких как диабет) или беременности 3 - 5. Он также подходит для анализа типов и количеств жиров в пищевых продуктах. Это полезно при характеристике экспериментальные диеты, а также обеспечение того, чтобы пищевой промышленности соответствует нормам. Например, ГК может быть использован для подтверждения личности и количество жирных кислот внутри продукта, таких как пищевая добавка для того, чтобы маркировка является правильным и правила будут соблюдаться 6,7. Анализ жирных кислот может обеспечить ценную информацию липидного обмена в норме и патологии, влияние изменения рациона питания, а также влияние изменений в физиологическом состоянии 8. Использование GC изучать образцы во время беременности оказывает важноеинформация об изменениях в жирной кислоты и сложного липидного гомеостаза 3.
В преддверии хроматографического разделения, липиды, как правило, извлекается из образца с помощью растворимости липидов в смеси растворителей хлороформ-метанол. Хлорида натрия, чтобы облегчить разделение смеси на водную и органическую фазы, содержащей липид 9,10. Сложные классы липидов интереса может быть отделен от общего липидного экстракта путем твердофазной экстракции (SPE). Этот метод разделения элюирует классы липидов на основе их полярности или аффинность связывания. Triacyglycerols (TAG) и сложные эфиры холестерина (CE), элюируют сначала в виде комбинированного фракции, еще классов, фосфатидилхолин (PC), фосфатидилэтаноламин (PE), и не этерифицированные жирные кислоты (NEFA), элюируют, увеличивая полярность элюирующего растворителя . Разделение TAG от CE использует связывание TAG только к свежим SPE патроныDGE, позволяя CE Элюируемый. TAG может быть затем элюировали путем увеличения полярность, элюируя 9,10 растворителя. Этот метод позволяет несколько образцов должны быть разделены одновременно с более высоким выходом, чем достигается при тонкослойной хроматографии, что означает, что относительно небольшие размеры образцов (например, <100 мкл плазмы или сыворотки, <100 мг ткани) могут быть проанализированы 11,12.
GC является хорошо отработанной технологией впервые описан в 1950; было предположено, что подвижная фаза в системах затем жидкость-жидкость может быть заменена с паром. Изначально он использовался для нефтяной анализа, но быстро расширяется в других областях, таких как аминокислотного анализа и липидов биохимии, которая по-прежнему большой интерес. Успехи в GC оборудования и технологий, таких как развитие капиллярных колонок из ранее использовавшихся упакованных колонках привело к наших текущих методов, в которых жирные кислоты способны бытьразделенных более эффективно при более низких температурах приводит к GC используется обычно для идентификации и количественного определения жирных кислот в широком диапазоне исследований 13.
GC требует жирные кислоты должны быть получены производные с тем, что они могут стать достаточно летучи, чтобы быть элюировали при разумных температурах без термического разложения. Это обычно включает замещение функциональной группы, содержащей водород с образованием сложных эфиров, сложные тиоэфиры или амиды для анализа. Метиловых эфиров обычно изучали производные, которые производятся путем метилирования. В этом методе сложноэфирные связи в сложных липидов гидролизуют, чтобы освободить свободные жирные кислоты, которые transmethylated с образованием метиловых эфиров жирных кислот (FAME). В результате профиль FAME, определяется GC, называют состава жирных кислот и могут быть легко по сравнению между различными экспериментальными группами 9,10. Методика позволяет обе пропорции отдельUAL жирные кислоты и их концентрации должны быть измерены.
В дополнение к использованию GC для анализа жирных кислот в питании исследований и в пищевой промышленности, методика может быть использована в широком диапазоне аналитических областей. Например, экологические анализы с использованием GC включают измерения загрязнения воды инсектицидами и почвы анализирует измерения содержания хлорбензол. В токсикологии, GC также используется для выявления запрещенных веществ в моче и образцах крови лиц; такие спортивный производительности усилители 12 и способность отделить сложные смеси углеводородов делает этот метод популярен в нефтяной промышленности для нефтехимической анализа 12.
Беременность связана со значительными изменениями в жирнокислотного состава материнской тканей, специально в содержании омега-3 (N-3) и омега-6 (п-6) полиненасыщенных жирных ациспуск (ПНЖК) 3. В текущем исследовании, мы иллюстрируют использование GC в измерении жирных кислот, описывая его использование в анализе состава жирных кислот ткани печени, взятой из целинных и беременных крыс кормили низкие и высоким содержанием жиров диеты с различными источниками нефти. Экспериментальные диеты, приведенные здесь были масляной основе диеты с низким содержанием жира сои, с высоким содержанием жиров на масляной основе диеты сои (130,9 г Всего жиров / кг жиров) или с высоким содержанием жиров на масляной основе диеты льняное (130,9 г Всего жиров / кг диета), при условии течение 20 дней. Состав кислота полный питательных веществ и жирных из этих диет были описаны ранее 14. Нефтяные диеты сои богаты линолевой кислоты (18:02 н-6) и содержат некоторое количество α-линоленовой кислоты (18:03 н-3), когда диета масло льняное богат α-линоленовой кислоты. Эти высоким содержанием жиров диеты представляют различные рационы линолевой к α-линоленовой кислот (рационах 8:01 и 1:1, соответственно). Метод выделения отдельных классов липидов и анализа ГХ, мыLL создана и утверждена, и был опубликован ранее 10, но без подробное техническое описание найденного здесь.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Процедуры животных
- Все животные работа должна проводиться в соответствии с домашнего офиса животных (научные процедуры) Закон (1986).
- Mate крыс линии Вистар в возрасте 10 недель на моногамных разведения и подтвердить беременность появлением вагинального вилкой. Запишите это как 1-й день беременности, и начать экспериментальную диету. Для целинных женщин, дом каждой крысы индивидуально, и начать экспериментальную диету.
- После кормления экспериментальных диет в течение 20 дней усыпить крысы по CO 2 удушья с последующим смещением шейных позвонков.
- Используйте рассечение пинцет и ножницы, чтобы разоблачить брюшной полости и вырезать печень, сокращая связки, соединяющие печень к диафрагме, переднюю стенку живота, желудка и двенадцатиперстной кишки. Промойте печень в PBS и заморозить в жидком азоте перед хранением при -80 ° С
2. Подготовка общих липидов Экстракт 9
- Добавить moleculар сита (заполнить 1/10 емкости растворителя) для всех растворителей для создания «сухой» растворители. Выполняйте все работы растворителя в вытяжной шкаф.
- Отрежьте около 100 мг мороженой печени и весят. Поместите ткань в трубку в ведро со льдом и добавить 0,8 мл ледяной 0,9% NaCl. Однородный ткани.
- Добавить внутренние стандарты растворяют в 1 мл / мг сухого хлороформа и метанола (2:1, об / об), содержащей бутилированный гидрокситолуол (ВНТ, 50 мг / л) в качестве антиоксиданта. Для 100 мг печени крыс добавить 100 мкг стандарта CE (холестерилацетат heptadecanoate 17:00) Внимание:. Хлороформ и ВНТ опасны.
- Добавить 5,0 мл сухого хлороформ: метанол (2:1, объем / объем), содержащий ВНТ (50 мг / л).
- Добавить 1,0 мл 1 М NaCl, тщательно перемешать встряхиванием, пока смесь не выглядит однородным. Образцы могут быть ограничен и хранили при -20 ° С на этой стадии до недели.
- Центрифуге при 1000 х г в течение 10 мин, низкий тормоза при комнатной температуре.
- Сбор нижефазы с использованием стекла пипетки Пастера, трансфер в новой винтовой крышкой стеклянной трубкой и сухой атмосфере азота при 40 ° С Образцы могут быть ограничен и хранили при -20 ° С на этой стадии до недели.
3. Разделение липидов классов по твердофазной экстракции (SPE) 10
- Соедин ют баллон с SPE с вакуумным насосом и поместить аминопропил кремнезема SPE картридж на резервуаре.
- Поместите новый винт-крышка стеклянная трубка с надписью TAG и CE в баке стойки под колонки собрать первую фракцию.
- Растворите общее липидный экстракт в 1,0 мл сухого хлороформа и вихревых.
- Применить образец колонки, используя стекло пипетки Пастера и позволяют капать через в завинчивающейся крышкой трубки под действием силы тяжести. Когда никакие дальнейшие капает не упасть, удалите оставшуюся жидкость с помощью вакуума.
- Элюции TAG и CE фракции под вакуумом, колонку промывают 2 х 1,0 мл моет сухого хлороформа.
- Когда вся жидкость удаляется, высушить TAG и CE fractioн в атмосфере азота при 40 ° С Образцы могут быть ограничен и хранили при -20 ° С на этой стадии до недели.
- Поместите новый завинчивающейся крышкой стеклянной трубки с надписью ПК в лоток бака в столбце.
- Элюции фракции PC под вакуумом с добавлением 2 х 1,0 мл сухого хлороформ: метанол (60:40, об / об), пока вся жидкость не будет удален из колонки.
- Снимите и сухая фракция ПК в атмосфере азота при 40 ° С Образцы могут быть ограничен и хранили при -20 ° С на этой стадии до недели.
- Установите новую завинчивающейся крышкой стекло PE пробирку в лоток резервуара и элюируют фракцию PE с добавлением 1,0 мл сухого метанола в вакууме.
- Удалить и сухой ЧП фракция в атмосфере азота при 40 ° С Образцы могут быть ограничен и хранили при -20 ° С на этой стадии до недели.
- Поместите новый завинчивающейся крышкой стеклянную трубку помечены NEFA в лоток резервуара и элюируют фракцию NEFA под вакуумом при добавлении 2 х 1,0 мл промывками безводного хлороформа, метанола и ледяной уксусной кислоты. (100:2:2, об / об / об) Предостережение: ледяной уксусной кислоты опасными.
- Удалить собранную NEFA фракции и сухой атмосфере азота при 40 ° С Образцы могут быть ограничен и хранили при -20 ° С на этой стадии до недели.
- Установите новую аминопропил кремнезема SPE картридж на SPE бака и поместите стеклянную трубку с завинчивающейся крышкой в лоток бака под патрон для сбора отходов.
- Промыть колонку с 3 стирок сухого гексана в вакууме, а затем окончательного 1,0 мл стирки под действием силы тяжести. Не допускайте, чтобы картридж становиться сухой (поворот каналы столбцов картридж в закрытое положение, когда уровень гексан близка к матрице картриджа). Внимание: гексан является опасным.
- Заменить отходов трубку с новым винтовой колпачок стеклянной трубки с маркировкой CE.
- Растворите высушенного TAG и CE фракцию (полученного на стадии 3.6) в 1,0 мл сухого гексана и вихря. Примените это к колонке с использованием стекла пипетки Пастера и позволяют капать через под гravity.
- Когда никакие дальнейшие капает не упасть, удалите оставшуюся жидкость в вакууме.
- Под вакуумом, колонку промывают 2 х 1,0 мл моет сухого гексана элюироваться CE и сухой собранную фракцию в атмосфере азота при 40 ° С Образцы могут быть ограничен и хранили при -20 ° С на этой стадии до недели.
- Поместите новый винт-крышка стеклянная трубка с надписью TAG в лоток резервуара и Элюции TAG с добавлением 2 х 1,0 мл моет сухого гексана: метанол: этилацетат (100:5:5) в вакууме.
- Сухой Собранную фракцию в атмосфере азота при 40 ° С Образцы могут быть ограничены и хранили при -20 ° С на данном этапе для до недели. Внимание: этилацетат является опасным.
4. Подготовка FAME от Е 10
- Добавить 0,5 мл сухого толуола, отделенной CE фракции (собраны в шаге 3.19) и вихрь. Внимание: толуол является опасным.
- Подготовка метилирования реагента (сухой метанол с 2% (об/ Объем) H 2 SO 4), из которых 1,0 мл требуется на образец. Внесите объем сухого метанола в стекло или подходящий пластиковый контейнер с крышкой и добавьте необходимое количество H 2 SO 4 каплям затем смешать инверсией. Внимание: Серная кислота является опасным.
- Добавить 1,0 мл метилирующего реагента для образцов, растворенных в сухом толуоле, колпачок пробирки надежно, и осторожно перемешать.
- Нагрейте образцы в течение 2 часов при 50 ° С
- Через 2 часа снять трубки от жары. После прохладной добавить 1,0 мл нейтрализующие решение (0,25 М КНСО3 0.5MK 2 CO 3). Внимание: Калий бикарбонат и карбонат калия являются опасными.
- Добавить 1,0 мл сухого гексана и вихревые.
- Центрифуга при 250 х г в течение 2 мин, низкий тормоза при комнатной температуре.
- Соберите верхнюю фазу, которая содержит FAME, и передать в новую, не завинчивающейся крышкой одноразовые стеклянной трубки.
- Высушите собранную FAME подазота при 40 ° С Образцы могут быть ограничен и хранили при -20 ° С на этой стадии до недели.
5. Удаление свободного холестерина загрязнения от CE FAME 14
(Бесплатный Холестерин может загрязнить образец; см. рисунок 1 Например хроматографа следов с и без удаления свободного холестерина).
- Поставьте отходов трубку в SPE бака и поместите силикагелевого SPE картридж на танк.
- Столбец Промыть 3 х 1 мл моет сухого гексана в вакууме и 1 х 1 мл под действием силы тяжести.
- Удалить моет отходов и добавить новую трубку отходов в баке.
- Растворите CE FAME в 1 мл сухого гексана, вихря.
- Нанести на колонки, используя стекло пипетки Пастера и позволяют капать через под действием силы тяжести.
- Столбец Промыть 3 х 1 мл моет гексана в вакууме.
- Удалить моет отходов и поместите новый неофициальный завинчивающейся крышкой трубки в бак помечены CE FAME.
- ЭлюцииCE FAME с 2 х 1 мл сухого гексана: диэтиловый эфир (95:5 об / об) моет.
- Высушите в атмосфере азота при 40 ° С Образцы могут быть ограничены и хранили при -20 ° С на данном этапе для до недели. Внимание: диэтиловый эфир является опасным.
6. Передача FAME в GC автосэмплера флакон
- Добавить 75 мкл сухого гексана, чтобы пробовать, вихрь, и перенести в авто образца флаконе GC.
- Добавить еще 75 мкл сухого гексана, чтобы пробовать, вихревые и трансфер в той же GC авто образца флаконе. Образцы могут быть ограничен и хранили при -20 ° С на этой стадии до одного месяца.
7. Анализ с помощью газового хроматографа 14
- Анализ FAME на газовом хроматографе. Пример настройки: 30 м 0,25 мкм х 0,25 мм BPX-70 из плавленого кварца капиллярная колонка с протоколом температуры:
Начальная температура 115 ° С, провести 2 мин, рампа 10 ° С / мин до 200 ° С, удерживая 18,5 мин, рампы 60 ° С / мин до 245 ° С, чстарый 4 мин.
Колонка: Гелий газ, расход 1,0, давление 14,6 и скорость 29.
Инжектор: температура = 300 ° С.
Детектор: Водород поток 40.0, воздушный поток 184,0, составляют газа гелий, расход 45,0, температура = 300 ° С. - Установить сплит соотношение в зависимости от обстоятельств (например, 25:1 для CE анализа FAME).
- Определить площадь под каждым пиком, используя соответствующее программное обеспечение и определить FAME по сравнению со стандартами. См. Рисунок 2 Например хроматограмм.
- Использование площадь под пиком данных для вычисления вклада индивидуальных жирных кислот в процентах от общего количества жирных кислот.
- Рассчитать абсолютные концентрации жирных кислот путем деления площади внутреннего стандарта на величину добавлен. Разделить площадь каждой жирной кислоты этим результатом, чтобы получить абсолютные концентрации каждого жирной кислоты в количестве ткани, используемой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успех этого метода зависит от следующих протокол точно и на использовании чистых растворителей и реагентов, чтобы уменьшить "шум" и загрязнения, которые могут появиться на хроматограмме. Загрязненные образцы являются более сложными для анализа, снижения точности площади под расчетах кривой. Если протокол успешно следовать хроматограмму с четкими симметричными, хорошо выраженных пиков и с минимальным фонового шума должны быть получены, как показано на рисунке 3. Если загрязнение произошло хроматограмму покажет дополнительные пики и проявляют несимметричные (перекос) пики, как показано на рисунке 4. Заражение от свободного холестерина будет происходить при запуске FAME, полученный из CE (см. рисунок 1, если холестерин не будет удален (как описано в Протоколе 5).
Использование подготовленной калибровки смеси позволяет идентификации FAME в тыс. тенгеэ образец. Калибровка смесь запустить, используя те же настройки прибора, как образцы, так что хроматограмма можно сравнить с образцом и пиков правильно определили на основе их времени удерживания, как показано на рисунке 2.
Площадь пика используется для расчета процента конкретных жирных кислот в общем. После того, как данные были собраны, полезно проверять их на наличие выбросов, как показано на рисунке 5. Выброс образцы затем могут быть дополнительно исследованы и добыча и / или анализа при необходимости повторить.
Добавление внутренний стандарт для образцов (как описано в протоколе шагом 2.3) позволяет количественное жирных кислот в образце по расчетам с использованием площадь известного количества внутреннего стандарта пика по отношению к площади пика интереса, и с поправкой на Оригинальный объем образца или вес. В таблице 1, FAME в печени крыс CE описываются какпроцента от всех жирных кислот (г/100 г общего количества жирных кислот) в пределах печени CE. Эти данные описывают CE жирных кислот в печени целинных или беременных крыс кормили в течение 20 дней на одном из трех различных диет. Статистический анализ с использованием двухфакторной ANOVA (факторы: питание, беременна против девы) показывает значимые эффекты диеты и беременности от пропорции нескольких жирных кислот, а также значительных диеты х беременности взаимодействий (табл. 1). В качестве иллюстрации Рисунок 6 показывает, что арахидоновая кислота (AA; 20:04 н-6) содержание печени CE у беременных крыс под влиянием более рационе, чем у первичных самок.
Рисунок 1. Сравнительные газовые хроматограммы идентичных образцов, иллюстрирующих важность свободного удаления холестерина в крыс ткани печени. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 2. Пример использования метода используется для идентификации образца CE FAME крысы ткани печени с помощью подготовленного калибровки микс. Пр.epared калибровки смесь запустить, используя те же настройки прибора, как образцы, так что хроматограммы можно сравнить, чтобы определить жирных кислот в образце. Сопроводительный хроматограмма для калибровки смеси позволяет FAME в миксе быть помечены. Это помечены след может быть по сравнению с хроматограмме от образца, где легко идентифицируемые большие пики можно сравнить их времени удерживания тем, которые по калибровочной смеси затем с надписью соответствующим образом. Например выделены на след. будет 16:00, чтобы проиллюстрировать сравнение времен удерживания от смеси калибровки выше к жирных кислот в образце следа ниже позволяя правильность маркировки жирных кислот. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 4. Пример загрязненного газа NEFA хроматограмме, полученной из человеческой плазмы. Есть много неожиданных пиков, как обведены в начале выборки, которые могут повлиять на интеграцию подлинных пиков. Пики прерываются и неопределенным, как видно Towar DS конца образца и стали наклонный как круг. Это будет влиять на точность площади под расчетов кривых и количественной оценки этих жирных кислот. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 5. Идентификация выброса данными между состав жирных кислот в печени CE в девственных крыс, получавших соевое масло диета с высоким содержанием жира (п = 6). Это показывает, как процентные показатели анализируемых жирных кислот может быть использована для определения неоднозначные результаты. Эти данные показывают, что образец 125 может быть выброс, и требует дальнейшего изучения. Пять основных жирных кислот внутри CE (16:00, 18:00, 18:01 н-9, 18:2 н-6, 20:4 н-6) не показаны.JPG "целевых =". _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 6. Содержание арахидоновой кислоты печени CE среди целинных и беременных крыс, которых кормили экспериментальные диеты. Значения средства ± SD, п = 6. Средства, без единой буквы отличаются, р <0,05. * Отличается от девственных самок в пределах согласованного диетического группы, Р <0,05. Это визуальное представление результатов таблицы 1, показывающие различия в печени содержания CE целинных крыс кормили различные диеты по сравнению с беременных крыс, получавших те же диеты. Различия можно увидеть в каждой пищевой группе между целинных и крыс. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Таблица 1. Состав жирных кислот в печени крыс эфиров холестерина целинных и беременных крыс, которых кормили экспериментальные диеты. Значения средства (SD), п = 6. ND указывает не обнаружено (среднее <0,1%). Средства без общей письмом в течение целинных или беременных отличаются, р <0,05. * Отличается от девственных самок в пределах согласованного диетического группы, Р <0,05. Эта таблица показывает средние значения н-3 и н-6 жирных кислот, присутствующих в ткани печени целинных и беременных крыс, когда кормили низкие и различные диеты с высоким содержанием жира. Результаты анализировали статистически с использованием дисперсионного анализа (ANOVA) с уровнем значимости Р <0,05 различия между целинных и беременных крыс, тип питания и диеты х взаимодействия беременности. Результаты ANOVA предложить существуют значительные различия в уровнях арахидоновой кислоты (20:04 н-6) между целинных и беременных крыс в пределах мatched диетические группы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Газовая хроматография является точным метод, используемый для анализа жирных кислот, и его высокая воспроизводимость считает эту технику, подходящую для клинических анализов. Соответствующие столбцы GC должен использоваться для того, чтобы идентифицировать жирных кислот, представляющих интерес, с доступные столбцы, имеющие отклонения в полярности стационарной фазы, длиной столбца и внутренним диаметром. Использование плавленого колонке кварцевую капиллярную в этом методе анализа обеспечивает хорошую термическую стабильность и высокую воспроизводимость времен удерживания из-за его высокой поверхностной инертности и хорошим разрешением 8.
Критические шаги в рамках этого протокола, включают низшие и шаги по сбору верхней фазы (протокол шаги 2,7 и 4,8). Важно, чтобы как можно больше правильной фазы собирают, насколько это возможно без загрязнения с любым из нежелательной фазы. Наличие загрязняющих веществ в образце приводит к нежелательному выходу хроматографическойКак показано на рисунке 2. При сборе CE во SPE крайне важно, чтобы столбцы картриджей хранятся насыщен растворителя (шаг 3,15), следуя промывок гексана по обеспечению образец проникает столбец, чтобы позволить успешное разделение CE от TAG. Дальнейшее разделение CE для удаления свободного холестерина важно, чтобы избежать загрязнения, появляющиеся на хроматографа следов, как показано на рисунке 1. Важно также, чтобы гарантировать шаги, требующие удаление жидкости под вакуумом следуют точно так вся жидкость полностью удаляется из колонны, чтобы обеспечить хороший выход.
Основным ограничением GC является то, что сложные липиды, такие как фосфолипиды и triacyglycerols должны быть омылению до дериватизации с образованием FAME перед анализом, так что информация о конкретных структур этих липидов и типичных комбинаций жирных кислот теряется 10. Все шаги вэтот протокол должны проводиться в вытяжном шкафу из-за использования растворителей, что ограничивает пригодность окрестностях этот метод можно выполнять дюйма Этот метод также может занять много времени для анализа небольшое количество образцов, как правило, принимают два рабочих дня чтобы получить от образца, представляющие интерес для вывода данных, если не используются полностью автоматизированные процедуры. Тем не менее, при обработке большего числа образцов, каждый этап может быть сделано в пакетном режиме, чтобы максимизировать эффективность этого времени техники и наличие оборудования для других пользователей. Некоторые методы в протоколе требует практики и ловкости рук например верхний и нижний фазовых выделений (шаги 2,7 и 4,8), что может быть проблемой для людей с проблемным суставов или кто склонен к негативным последствиям повторяющихся движений.
Шаги в пределах этого метода могут быть легко добавлены или удалены, чтобы облегчить сбор различных фракций для широкого спектра образцас, например, сбор PE может не потребоваться при анализе плазма, но представляет интерес в образцах клеток и тканей 10. Этот способ также может быть модифицирован для анализа клеток общих экстрактов липидов, где шаги SPE может быть опущено, если это необходимо. Один такой вариант является то, что описано для эритроцитов, который опускает общее стадии экстракции липидов, а также SPE пунктами с 15. В отличие от текущего протокола, метод, используемый в данном исследовании используют 250 мкл метилирующим реагентом (14% трифторида бора), который добавляется непосредственно в эритроцитах вместе с 250 мкл гексана и нагревают в течение 10 минут при 100 ˚ С. Стадию нейтрализации опущен и вместо воды и добавляют гексан; образец затем центрифугируют и гексан верхнюю фазу собирали и переносили непосредственно в GC автоматического пробоотборника флакона без сушки в атмосфере азота и повторно растворяют в гексане.
GC является универсальным методом и обеспечивает отнiable результаты с диапазоном доступных модификаций 15 и может быть использован для анализа широкого спектра образцов. Он имеет преимущества по сравнению с масс-спектрометрии (MS) при анализе метаболизм н-6 и омега-3 жирных кислот, как он способен различать структурно подобных жирных кислот, как он использует время удерживания для маркировки, в отличие от атомной массы. MS может определить жирных кислот в образце, но не может различить двойных связей в позиции стереоизомеров и поэтому не может сказать определенные жирные кислоты друг от друга. При необходимости оба метода могут быть использованы в тандеме с помощью ГХ-МС 16. Этот метод используется при расследовании липидного обмена и функции в области lipidomics. Использование GC в тандеме с MS привело к большим достижениям, так как позволяет манипулирование идентификации жирных кислот с использованием различных стационарных фаз в GC различать жирных кислот, которые в одиночку МС не может. GC также может быть использован в сочетании с масс-спектрометрии электронного удара(EI-MS), что позволяет для идентификации жирных кислот, когда они совмещены с альтернативных химических производных, таких как сложные эфиры пиколинил. Это расширяет использование техники и продолжает улучшают липидный профилирование как метод исследования в целом ряде областей, таких как физиологии, клинической обнаружения биомаркеров, и патологии, а также липидного биохимии 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют каких конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы выразить признательность за вклад Меритшелльская Роме-Надаль в исследовании на крысах.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4056/17 | 'CAUTION' Fumes - HPLC Grade |
| Chloroform | Fisher Scientific | C/4966/17 | 'CAUTION' Fumes - HPLC Grade |
| BHT | Sigma- Aldrich | W218405 | 'CAUTION' Dust fumes - Anhydrous |
| NaCl | Sigma- Aldrich | S9888 | Anhydrous |
| Hexane | Fisher Scientific | H/0406/17 | 'CAUTION' Fumes - HPLC Grade |
| Glacial acetic acid | Sigma- Aldrich | 695084 | 'CAUTION' Burns - 99.85% |
| Sulfuric acid | Sigma- Aldrich | 339741 | 'CAUTION' Burns - 99.999% |
| Potassium carbonate | Sigma- Aldrich | 209619 | 99% ACS Reagent grade |
| Potassium bicarbonate | Sigma- Aldrich | 237205 | 99.7% ACS Reasgent grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10204340 | 'CAUTION' Fumes - 99+% GLC SpeciFied |
| Toluene | Fisher Scientific | T/2300/15 | 'CAUTION' Fumes |
| Diethyl ether | Sigma- Aldrich | 309966 | 'CAUTION' Fumes |
| Nitrogen (oxygen free) cylinder | BOC | 44-w | 'CAUTION' Compressed gas - explosion risk |
| Aminopropyl silica SPE cartridges | Agilent | 12102014 | Cartridge - Bead mass 100 mg |
| Silica gel SPE cartidges | Agilent | 14102010 | Cartridge - Bead mass 100 mg |
| Molecular seives | Sigma- Aldrich | 334324 | Pellets, AW-300, 1.6 mm |
| Glass Pasteur pipettes | Fisher Scientific | FB50251 |
References
- Browning, L. M., et al. Incorporation of eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids into lipid pools when given as supplements providing doses equivalent to typical intakes of oily fish. Am. J. Clin. Nutr. 96 (4), 748-758 (2012).
- Cao, J., Schwichtenberg, K. A., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y. Incorporation and clearance of omega-3 fattyacids in erythrocyte membranes and plasma phospholipids. Clin. Chem. 52 (12), 2265-2272 (2006).
- Lauritzen, L., Carlson, S. E. Maternal fatty acid status during pregnancy andlactation and relation to newborn and infant status. Matern. Child Health. 7 (2), 41-58 (2011).
- Kelsall, C. J., et al. Vascular dysfunction induced in offspring by maternal dietary fat involves altered arterial polyunsaturated fatty acid biosynthesis. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Karpe, F., Dickmann, J. R., Frayn, K. N. Fatty acids, obesity, and insulin resistance: time for a re-evaluation. Diabetes. 60 (10), 2441-2449 (2011).
- Mossoba, M. M., Moss, J., Kramer, J. K. Trans fat labelling and levels in U.S. foods: assessment of gas chromatographic and infrared spectroscopic techniques for regulatory compliance. J. AOAC Int. 92 (5), 1284-1300 (2009).
- Chee, K. M., et al. Fatty acid content of marine oil capsules. Lipids. 25 (9), 523-528 (1990).
- American oil chemists society. Gas chromatographic analysis of molecular species of lipids. , The Oily Press, Inc. Available from: http://lipidlibrary.aocs.org (2013).
- Folch, J., Lees, M., Sloane-Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226 (1), 497-509 (1957).
- Burdge, G. C., Wright, P., Jones, E. A., Wootton, S. A. A method for separation of phosphatidylcholine, triacylglycerol, non-esterified fatty acids and cholesterol esters from plasma by solid-phase extraction. Br. J. Nutr. 84 (5), 781-787 (2000).
- Seppänen-Laakso, T., Laakso, I., Hiltunen, R. Analysis of fatty acids by gas chromatography, and its relevance to research on health and nutrition. Anal. Chim. Acta. 465 (1), 39-62 (2002).
- Beesley, T. E., Buglio, B., Scott, R. P. W. Quantitative chromatographic analysis. , Marcel Dekker. New York, NY. Part. (2000).
- Bartle, K. D., Myers, P.
- Childs, C. E. The effect of gender, pregnancy and diet upon rat tissue fatty acid composition and immune function. , University of Southampton, School of Medicine. Available from eprints.soton.ac.uk 378 (2008).
- Harris, S. W., Pottala, J. V., Ramachandran, S. V., Larson, M. G., Robins, S. J. Changes in erythrocyte membrane Trans and marine fatty acids between 1999 and 2006 in older Americans. J. Nutr. 142 (7), 1297-1303 (2012).
- Rohwedder, W. K. Mass spectrometry of lipids (USDA). Northern Regional Research Laboratory ARS. , Available from: ddr.nal.usda.gov/bitstream/10113/29457/1/CAIN769045540.pdf (2013).
- Roberts, L. D., McCombie, G., Titman, C. M., Griffin, J. L. A matter of fat: An introduction to lipidomic profiling method. J. Chromatogr. B. 871 (2), 174-181 (2008).
