Summary
孤立的血液灌注肺的准备，使可视化微血管网络上的肺表面是可行的。在这里，我们描述的方法用实时荧光成像量化单一微血管隔离肺的通透性。
Abstract
分离的血液灌注的肺制剂被广泛用于可视化和单微血管定义信令。通过实时成像耦合此制备中，以确定在单个肺微血管通透性的改变成为可能。在这里，我们描述的步骤来隔离大鼠肺组织，并与自体血灌注他们。然后，我们概述的步骤注入通过微导管荧光团或代理人到一个小细胞肺癌区域。使用上述这些程序，我们确定通透性增加大鼠肺微血管针对细菌脂多糖注射。数据显示，脂多糖通过这两个小静脉和毛细血管微血管段增加液体泄漏。因此，该方法使得有可能以比较的血管段中的渗透性的反应，因此，限定在响应中的任何不均匀性。而常用的方法来定义肺通透性要求肺组织样品，进行后处理的使用实时成像消除这一要求作为显而易见的，从目前的方法。因此，隔离肺制剂结合实时成像提供了一些优于传统方法来确定肺微血管的通透性，又是一个简单的方法来制定和实施。
Introduction
在肺微血管通透性增加导致肺泡水肿和损害气体交换的发展，是急性肺损伤（ALI）1-3的一大特点。因此，血管通透性的估计是在确定肺损伤，并提出治疗措施疗效的程度很重要。重量分析诸如血液中的游离肺湿重与干重比和微血管过滤系数被广泛使用的方法来估算渗透性4,5。其它方法包括定量肺组织6-8中的放射性或荧光探针的保留。然而，上述方法需要肺组织样品的postexperiment加工朝向阐明的渗透率数据。此外，由于一动物只能用于单一治疗方案，大型动物数量，可能需要一个完整的研究。上述方法的一个共同特点是，它们确定平均血管通透性为所有的血管组织样本内。但是，它是公认的肺部微观和宏观血管表型不同9。因此，渗透性反应可能是异构的各种血管段以及9,10之间。因此，定量组织样本中的所有肺血管通透性均可能没有充分反映这种异质性。
在离体血液灌注肺标本，血管对肺表面可以通过一个堂堂正正的显微镜4,11,12可视化。这使得在单个容器的反应特征，因此，解决在应对13任异质性。此外，通过利用微血管的荧光成像，基于荧光测定法可并入。进一步，左心房微导管可被用于运载剂和荧光探针进入血管11,14。微导管限制了传递到小肺部区域，从而前冒充只有区域内的血管的灌注剂和荧光基团。这允许将用于单独的实验相同的肺中的多个小区域，导致所需的研究动物的整体减少。
即时成像能够在血管和微血管单隔离肺准备的荧光血管外动态变化的捕获。因此，对于像场中的每个微血管，输液荧光和冲刷的过程中发生变化的荧光可以被记录，并量化离线14。使用的最大和残余血管荧光值，摄像视场中的每个微血管通透性指数可以被确定。以确定响应于炎性或损害性药物的渗透性的变化，所需的剂可以首先给药，然后通透性指数来确定。此外，该图像字段可以设置为通过注入肺区域内微导管，从而使之在选择所需的血管网的高度灵活性。因此，孤立的血液灌注肺的准备以配合实时成像提供了一个有吸引力的实验模型来量化通透性单肺微血管。
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Protocol
对动物进行的所有实验均批准的田纳西大学健康科学中心大学的机构动物护理和使用委员会。
1，油管灌注大鼠肺制剂
- 准备一个管道系统用聚乙烯管（＃18），用于血液灌注， 如图1连接的压力传感器（P23XL），并放置在显微镜载物台上的管件。
- 设定水浴温度为37°C。
- 连接肺入口，并与聚乙烯管暂时出口。
图1。血液灌注管 。该图显示了用于通过隔离肺制剂血液循环管路的设置。也表明是相关联的组件，通过该管子我s路由。心脏和肺的示意图包括显示管和肺动脉（PA）之间的连接部位，和左心房（LA）套管（蓝色虚线）。
2，制备离体大鼠肺
- 麻醉大鼠（雄性Sprague-Dawley大鼠; 250-300克）用氯胺酮（80〜100毫克/千克），并用甲苯噻嗪（5-10毫克/千克）。后确保手术的麻醉平面，将动物仰卧位置。
- 进行气管切开，插入气管插管（PE-90），并与手术缝合固定。
- 通过心脏穿刺（21克蝴蝶针）注入肝素（100-200 U）到心脏，等待60秒，抽血血（〜12-15毫升血）。
- 准备两个套管（聚乙烯管，直径3毫米，4厘米长，扩口的一端），并填充生理盐水。
- 进行开胸手术。做一个切口（3毫米），在右心室和套管的扩口端滑入朝向肺切口动脉。固定套管肺动脉与手术缝合线。
- 切割（3毫米），左心室心尖和第二套管的扩口端滑入切口。引导导管进入左心房。固定插管至左心室与脐带（2毫米宽）。
- 解剖任何结缔组织，并与所连接的插管取出肺和心脏在一起。将肺和心脏的培养皿。重新定位的肺，使膈面在上面。这三个套管应朝向同一方向。
- 放置在能够在XY方向上进行操作的一个阶段的肺制剂。附带显微镜任何阶段都可以进行修改，以保持管件或内置，如果需要一个特制的阶段。
3，血液离体大鼠肺灌注
- 混合放血血用等体积的白蛋白（5％）溶液，并添加到储存器。启动蠕动泵和设置流程R吃了14毫升/分钟。使血液填充管上。
- 与分流开，取出肺临时进出水口接头。附加肺动脉和左心房插管至肺入口和出口，分别。确保没有气泡在管。
- 气管插管连接到第三压力传感器（P23XL）。通过气管插管肺膨胀与30％氧气和压力保持5厘米高2 O。
- 关闭分流钳，开始灌注肺。维持肺动脉和〜分别为10 3厘米H 2 O的左心房压力。
4，准备对肺微血管灌注
- 提高对上面的肺和安全水平的导管延伸管的后端。
- 通过插入一个长40厘米PE10管材成约30厘米长的PE90管长约30厘米准备输液导管。在PE10管的外露端连接到一根针（30克）在上亦有一个注射器（1毫升）。
- 插入导管组合成延伸管的凸起尾部。通过左心房和进入肺引导导管组合，直到遇到阻力。然后，再独自推PE10导管进入肺部，直到它遇到阻力。需要注意的是用力过大，同时插入导管会损害肺。
- 填充1毫升注射器用林格氏溶液和附加到一个注射器泵。设置输液速度以10微升/分钟。
- 相比于肺的其余部分注射部位会变得苍白。
- 润肺用生理盐水，盖上保鲜膜，有孔大到足以离开输液部位发现的肺。
- 棉签上的O形环（定制）的底部部分旋塞润滑脂，并放置在玻璃盖玻片（＃1.5，直径为22mm）上的O形环的底部。轻轻地用在输注部位的盖玻片放置O型圈。固定O形环与标准试管方荣景DER。盖玻片/ O型圈组合不变形的肺泡结构，它的下面，如最近报道15。
- 位置上方的O形环的荧光显微镜的物镜（20X），并集中于肺表面。
5，成像荧光葡聚糖过境微血管
- 准备显微镜成像FITC荧光。
- 选择要成像的区域，并利用图像采集软件在1/minute的速率采集图像。
- 使用注射泵开始输注FITC-葡聚糖20 KD（0.5毫克/毫升）的。荧光血管会逐渐增加，达到最大值。继续输注60分钟。
- 然后切换到林格氏输液洗掉管腔荧光。输液维持超过10分钟。在洗涤过的继续图像采集在1/min极限。
6，图像分析
- 打开图像采集文件。
- 地方区域利息在图像帧中的微血管。
- 播放的图像文件的帧接一帧并记录在感兴趣的所有帧的每个区域的荧光强度。
- 绘制荧光强度的变化的利息作为时间的函数的每个区域。
- 量化的最大荧光强度和冲刷10分钟后残留的荧光强度。
- 计算最大值之比，以在每个感兴趣的区域残留的荧光强度，以获得与所关注该区域相关联的微血管的渗透性指数。
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Representative Results
分离的血液灌注肺制剂连接到灌注管道和相关设备示于图2。出于演示的目的，我们使用了一个只SD大鼠，虽然本文所描述的程序，可以用任何鼠种使用。通过左心房微导管输注到达肺的一小区域。该注入区域可通过输注引起的变色（ 图3）来识别。作为定位于实时成像的肺制剂示于图4。
图2的分离血液灌注肺制剂 。图为连接到灌注管和灌注自体血离体大鼠肺。需要注意的是肺的膈面朝向英里croscope目标。
图3。微导管输注区域 。通过左心房插入的microcathether被用来注入林格氏液进入肺的准备。图为左肺（圆）接受林格氏输液的区域。作为林格氏注射置换血液通过血管灌注，相比于其他肺部区域中的注入区域出现苍白。注意，林格氏注射被限制到肺的小分明的区域。
为隔离肺的准备图4。成像位置 。照片笑WS定位显微镜物镜准备用于成像下的分离的肺制剂。注意的是，肺表面覆盖有塑料套，以保持肺表面湿润。一个O形环在成像期间保持肺表面是水平的。
阿里的一个广泛使用的模型：;在本研究中，我们针对细菌脂多糖（B4血清型0111 LPS）处理决定改变血管通透性。朝向这一点，我们输注LPS（100微克/毫升）到微血管30分钟，随后用林格氏洗60分钟11。然后，我们注入的FITC葡聚糖20 kD的量化通透性指数。剩余的FITC荧光低与林格治疗微血管，但高在那些与LPS（ 图5A-D）处理。此外，相较于林格氏注射，输注LPS引起了显著减少透气性指数，这表明图象FIEL内的磁导率的全球增加所有船只D（ 图5E）。分别量化为小静脉和毛细血管的通透性指数表明，LPS诱导的通透性增加，降低比静脉毛细血管，虽然差异不显著（ 图5F）。
图5。LPS增加血管通透性 。肺微血管与任何林格氏或LPS（100微克/毫升）处理30分钟进行处理。 60分钟后，FITC右旋糖酐20 kD的输注其次是林格洗和实时成像捕获的荧光变化。那么血管在肺部的施工部位的透气性指数确定为最大残留FITC荧光葡聚糖的比例AD）图片显示最大值（A，C）和剩余（B，D）FITC氟escence在Ringer's - （A，B）和LPS处理（C，D），肺微血管E）脂多糖注射的通透性指数显著在所有血管段图像框内下降。F）的 LPS处理导致通透性指数降低两个小静脉和毛细血管（* P <0.05相比林格氏控制;每次重复3次;平均值±SEM）。毛细管（ 帽 ）和静脉（VEN）确定了从输液FITC右旋糖酐20 kD的前拍摄的明场图像获取容器的尺寸。显示的图像是一个850 850倍微米图像帧的裁剪部分。 N =船只数目。
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Discussion
孤立的血液灌注肺标本加上实时成像提供了确定在单肺微血管通透性改变一个简单的工具。我们采用该方法来定义响应于LPS输注渗透性的变化。我们的数据清楚地表明，脂多糖注射引起的增加微血管通透性。此外，数据还表明，LPS诱导的通透性的改变是相似的在两个小静脉和毛细血管。因此，这种技术的主要优点是定义单个微血管的泄漏，以及一个全局血管网络的能力。鉴于这种技术也产生全球通透性的改变，有可能将这些值与使用其他常用的方法，如重分析得到的比较。因此，本发明的方法还允许对微血管流体泄漏的信息与在其他研究报告进行比较。
相比于更广泛使用的技术，以确定血管通透性的改变，实时基础的成像方法不需要后处理的肺组织样品。荧光团的保留程度是荧光团的输液和随后的冲刷中被俘。这显然消除了保留组织标本，并与他们处理相关的任何错误。除了经由通透性指数建立单独的微血管的渗透性，当前的方法也有利于限定的示踪荧光增加的幅度，示踪剂的荧光的变化的速率的两相性质，以及示踪荧光衰减过程中洗掉的速率。这些额外的参数可以用来反应比较不同的治疗方法，以及在微血管分部间的差异，在我们以前的报告14所述。
我们这里所描述响应于炎性过程，以确定渗透率的变化代理通过血管灌注交付。然而，也能够适应的程序，以确定渗透率变化通过其它途径以及递送剂。因此，我们先前已经决定微血管通透性增加，以酸肺泡灌注14交付。
如显而易见的，从肺的照片时，基于微导管递送方法限制了产品交付到肺的一个小区域。因此，通过操纵微导管以不同肺部区域，一系列的实验，可以在相同的肺进行。因此，该方法对需要一个完整的研究的动物的数目显著影响。在此数据及其他研究报道都在同一个肺4,11,12,14,16利用多次输注。而在来自不同区域的反应没有差异是很明显的，由于通过在本研究的灌注液的输注剂可以再循环，这种可能性应当缺点idered中的实验设计。因此利用相同的肺进行实验的不同区域时，它可能是有益的，以确定基线渗透性是否在不同的肺区域的类似。
本发明方法的成功的关键取决于建立良好灌注的肺制剂。肺制剂应色泽均匀，没有任何红色斑点，流体出来气管导管，血液泄漏，或高肺动脉压力，这些都表明了一个损坏的肺。此外，应注意插入microcathether的过程中必须考虑到肺部，作为强制插入会导致小静脉穿刺和肺的损伤。
本完好的肺法限制可视化胸膜和胸膜下血管，从而使肺血管的一个子集渗透率的估计。对于更深的血管可视化，双光子显微成像可以是一种可能的选择。插入通过左心房套管限制输注到小静脉和毛细血管在逆行方向在微导管的离子。否定这种限制可能的方式将是通过肺动脉插管插入导管。需要此替代程序的唯一修改是将附加的导管的延伸管上的肺吸入侧。
这些程序使用大鼠肺为模型开发的。然而，可用于与一些小的修改相同的步骤，以确定在小鼠肺微血管通透性改变。对小鼠肺的实验中，激动剂和示踪剂可以被添加到灌注液和透气性量化为类似于对大鼠肺。进一步，不同的荧光示踪剂可以被取代，以适应用户的显微镜的功能。葡聚糖分子的大小可以取决于激动剂诱导的通透性增加的预期大小来改变，应决定基于从最初的实验数据。因此，整体而言，隔离肺与制备荧光成像一起提供了一个功能强大的工具，以确定在ALI的标准动物模型单一血管通透性。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
该研究是由美国国立卫生研究院HL75503以KP支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tygon Tubing | Fisher Scientific | #18 | |
| Pressure Transducer | Data Sciences International | P23XL | Need quantity 3 |
| Butterfly Needle | Greiner Bio-One | 450081 | 21 G |
| Peristaltic pump | Cole Parmer | Masterflex L/S | |
| PE-90 tubing | Becton Dickinson | 427421 | 30 cm needed |
| PE-10 tubing | Becton Dickinson | 427401 | 40 cm needed |
| Syringe Pump | Braintree Scientific | BS8000 | |
| O-ring | Custom made with a 20 mm diamter hole and a handle to secure O-ring to holder | ||
| Upright fluorescence microscope | Olympus America | BX61WI | |
| Image Acquisition Software | Molecular Devices | Metamorph | |
| FITC Dextran 20KD | Sigma Aldrich | 0.5 mg/ml (A dextran of different molecular size can be selected, if trial experiments indicate its suitability based on the calculated permeability index values) | |
| Lipopolysaccharide | Sigma Aldrich | Serotype 0111:B4 |
References
- Ware, L. B., Matthay, M. A. The acute respiratory distress syndrome. N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).
- Matthay, M. A., et al. The acute respiratory distress syndrome. J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).
- Bhattacharya, J., Matthay, M. A. Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury. Annu Rev Physiol. 75, 593-615 (2013).
- Parthasarathi, K., et al. Connexin 43 mediates spread of Ca2+-dependent proinflammatory responses in lung capillaries. J Clin Invest. 116, 2193-2200 (2006).
- Parthasarathi, K., Bhattacharya, J. Localized Acid instillation by a wedged-catheter method reveals a role for vascular gap junctions in spatial expansion of Acid injury. Anat Rec (Hoboken). 294, 1585-1591 (2011).
- Gorin, A. B., Stewart, P. A. Differential permeability of endothelial and epithelial barriers to albumin flux. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 47, 1315-1324 (1979).
- Boutoille, D., et al. FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin. Exp Lung Res. 35, 263-271 (2009).
- Thorball, N. FITC-dextran tracers in microcirculatory and permeability studies using combined fluorescence stereo microscopy, fluorescence light microscopy and electron microscopy. Histochemistry. 71, 209-233 (1981).
- Stevens, T. Functional and molecular heterogeneity of pulmonary endothelial cells. Proc Am Thorac Soc. 8, 453-457 (2011).
- Ofori-Acquah, S. F., et al. Heterogeneity of barrier function in the lung reflects diversity in endothelial cell junctions. Microvasc Res. 75, 391-402 (2008).
- Kandasamy, K., et al. Real-time imaging reveals endothelium-mediated leukocyte retention in LPS-treated lung microvessels. Microvasc Res. 83, 323-331 (2012).
- Kandasamy, K., et al. Lipopolysaccharide induces endoplasmic store Ca2+-dependent inflammatory responses in lung microvessels. PloS One. 8, (2013).
- Qiao, R. L., Bhattacharya, J. Segmental barrier properties of the pulmonary microvascular bed. J Appl Physiol. 71, 2152-2159 (1991).
- Parthasarathi, K. Endothelial connexin43 mediates acid-induced increases in pulmonary microvascular permeability. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 303, (2012).
- Wu, Y., Perlman, C. E. In situ methods for assessing alveolar mechanics. J Appl Physiol 1985. 112, 519-526 (2012).
- Kuebler, W. M., et al. A novel signaling mechanism between gas and blood compartments of the lung. Journal Clin Invest. 105, 905-913 (2000).
