Abstract
De zebravink (Taeniopygia guttata) is uitgegroeid tot een steeds belangrijker modelorganisme in vele gebieden van onderzoek, waaronder toxicologie 1, 2, 3 gedrag, en het geheugen en het leren 4,5,6. Als enige zangvogel met een gesequenced genoom, de zebravink heeft een groot potentieel voor gebruik in ontwikkelingsstudies; echter, de vroege stadia van ontwikkeling zebravink niet goed bestudeerd. Gebrek aan onderzoek in zebravink ontwikkeling kan worden toegeschreven aan de moeilijkheid van het ontleden van de kleine ei en embryo. De volgende dissectie methode kunnen embryonaal weefsel schade, die zorgt voor het onderzoek van de morfologie en genexpressie in alle stadia van embryonale ontwikkeling. Dit kan zowel helderveld en fluorescentie beeldvorming van kwaliteit embryo, gebruiken moleculaire procedures zoals in situ hybridisatie (ISH), celproliferatie assays en RNA-extractie voor kwantitatieve assays zoals kwantitatieve real-time PCR (qtRT-PCR). Deze techniek kunnen onderzoekers de vroege stadia van ontwikkeling die voorheen moeilijk toegankelijk waren studeren.
Introduction
Het algemene doel van deze techniek is om zebravink (Taeniopygia guttata) embryo's te verkrijgen vanaf de vroegste stadia van de embryogenese voor gebruik in een breed scala van ontwikkelingsstudies. Zebravinken zijn geworden van de overheersende zangvogel modelorganisme en zijn uitgebreid gebruikt in een verscheidenheid van terreinen, waaronder toxicologie 1,2, gedrag 3, het geheugen en het leren 4,5,6, vergelijkende neuroanatomie 7,8 en taalontwikkeling 9,10 . Als enige zangvogel met een gesequenced genoom, de zebravink maakt moleculaire en genetische studie van de Passeriformes orde, die meer dan 50% van de gekende vogelsoorten 11, 12,13 vertegenwoordigt.
Ondanks het gebruik van volwassen en jonge zebravink in een uiteenlopende reeks van gebieden, hebben weinig studies zijn uitgevoerd op zebravinken embryo's, met name tijdens de vroege stadia van ontwikkeling. Dit kan worden toegeschreven aan de geringe omvang van de eieren eennd embryo en de nieuwere status als modelorganisme 14,15,16 voor studies waarin de kip (Gallus gallus domesticus) eerder als overheersende modelsysteem 17,18,19,20,21. Echter, als niet-vocale leerlingen, kippen zijn niet geschikt modelsysteem voor het bestuderen van de genetische basis van vocale leren, ontwikkeling van de vocale leren, erfelijkheid, gedrag, en de corticale-basale ganglia circuits betrokken bij motorische leren 10.
Het is belangrijk op te merken dat de zebravink embryo's zijn veel gevoeliger en gemakkelijker beschadigd dan kippenembryo's tijdens dissectie en moleculaire procedures. In het bijzonder wordt een grotere zorgvuldigheid vereist bij het uitvoeren van permeabilization stappen op zebravink embryo's. Sterke reinigingsmiddelen en enzymen die niet schadelijk zou een kippenembryo kan zebravinken embryo beschadigen. In termen van algemene zorg, is het noodzakelijk om zebravink eieren in kleine kopjes in een incubator gebracht vóór plaatsingom te voorkomen dat ze breken bij het rollen tijdens incubatie.
Zebravink vatbaar zijn voor gedragsonderzoek, het hele jaar door in gevangenschap gemakkelijk en vruchtbaar ras, en zijn vocale leerlingen. Deze kenmerken maken het gebruik van zebravink tot de noodzaak van een modelorganisme dat ontwikkeling, genetica, en gedragsmatige aspecten van taal integreert pakken. De dissecties methoden hieronder beschreven, in combinatie met een recent ontwikkelde enscenering gids specifiek voor zebravinken 22, maken de zebravink een steeds nuttig gestandaardiseerde ontwikkelings modelorganisme. Echter, het verkrijgen van embryo's in een vroeg stadium kan ontmoedigend zijn. Dit protocol kunnen onderzoekers vroeg stadium embryo gemakkelijk te verkrijgen. Studies die de vroege ontwikkeling en de moleculaire ontwikkelingsbiologie basis van complexe gedragingen in zebravinken, of de toxicologische effecten op de ontwikkeling in andere kleine, zal zangvogels vinden dit dissectie methode bruikbaar.
Protocol
Ethiek Verklaring: De methoden werden uitgevoerd met gedomesticeerde zebravinken uit de broedkolonie in het College of William and Mary. Alle procedures gevolgd RSPCA richtlijnen 23 en werden goedgekeurd door het College of William and Mary's OLAW (Office of Laboratory Animal Welfare) Dierenwelzijn Assurance (# A3713-01) en had Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) goedkeuring (# 2013-06 -02-8721-Dacris).
1. Egg Collection en incubatie
- Vestigen zebravink paren op een 14:10 licht: donker cyclus. Leveren voedsel, water, hooi, en een nestkast ad libitum. Opmerking: Algemene verzorging en fokken voor zebravinken is goed beschreven 23.
- Bereid een standaard kuiken incubator met kantelen planken. Opmerking: Houd de kunstmatige incubator bij 37,5 (+ / - 1) ° C 80 - 95% vochtigheid door toevoeging van water aan de onderkant van de incubator op een dagelijkse basis. Laat de incubator equilibreren twee dagenvoor gebruik.
- Selecteer klein-feed cups (5 x 7,6 cm) van ten minste 2,5 cm diep om eieren te houden in de incubator. Bekleed de bodem en de onderkant van de beker met twee lagen keukenpapier zodat de beker is opgevuld, terwijl u toch de eieren gemakkelijk rollen. Plaats deze koppen op de kantelen planken van de incubator. Er zijn te veel padding kan rollen remmen, die zal voorkomen dat succesvolle incubatie wijten aan embryonale hechting aan de shell interieur.
- Verzamel de eieren twee uur na het begin van de lichtcyclus. Opmerking: Dit minimaliseert verschillen in fase van ontwikkeling voor een bepaalde incubatietijd wegens ouderlijke incubatie.
- Neem eieren voorzichtig met duim en wijsvinger op de top en de basis langs de lengte van het ei. Gebruik een doffe, zachte 4B grafiet potlood om de vastgestelde datum en tijd verzameld uit het nest te labelen. Opmerking: De zachtere 4B potlood vermindert het risico van het potlood breken de breekbare eierschaal.
- 1.3.2) Plaats 1-5 gelabeld eieren per cin de incubator zodat eieren vrij kan rollen embryonale hechting aan het inwendige van het reservoir voorkomen. Opmerking: Als u meer dan 5 eieren in een kopje kan rollen van de individuele eieren voorkomen en te verminderen levensvatbaarheid van embryo's.
2. Verwijdering van Embryo van Egg
- Ter voorbereiding van dissectie, assembleren de volgende materialen: een schone scalpel, fijne getipt tang, en twee extra fijne tip pincet. Plaats 10 x 10 cm weegt papier op basis van het ontleden scope een schone, niet-absorberend oppervlak voor dissectie. Opmerking: De wegen papier is van cruciaal belang omdat het mogelijk maakt eenvoudige manipulatie van de dooier en is de beste ondergrond voor het snijden van de delicate membranen met een scalpel.
- Bereid een hoeveelheid fosfaatbuffer zoutoplossing (1X PBS) in een 50 ml polypropyleen buis, en het verwerven van ten minste drie pipetten en een kleine afval emmer. Indien herstel van embryo's, bereiden een hoeveelheid van 4% paraformaldehyde (PFA). Let op: PFA dampen zijn giftig, eend alle stappen waarbij PFA moet gebeuren in een zuurkast om blootstelling te minimaliseren. Als flits bevriezen van de embryo's, verkrijgen vloeibare stikstof en bewaar deze in de buurt van het ontleden scope. Steriliteit is geen probleem voor deze dissectie protocol, maar ervoor zorgen dat alle materialen schoon zijn.
- Verwijder het ei uit de incubator op het tijdstip nodig is voor de gewenste fase zoals beschreven in de zebravink staging geleiding 22. Opmerking: Verwijder de eieren na 36 uur incubatie te ontleden etappe 6 embryo's (Figuur 4A) 22 en verwijder de eieren na 56 uur incubatie te ontleden stadium 12 embryo's (Figuur 3A) 22.
- Met behulp van een glasvezel-verlichting lamp, kaars het ei door vast te houden langs de verticale as en glans licht door het ei om het interieur te verlichten. Plaats de punt van het licht achter het ei en zoek de dooier en het zich ontwikkelende embryo.
- Plaats de scalpel op de zijde tegenover de dooier en snijd langs het ei van top totbase met vage druk.
- Verwijder de inhoud van het ei door nauwkeurige toepassing door op de punt en de basis van het ei met de duim en de wijsvinger of voorzichtig wrikken elkaar de schalen langs de snijlijn met een tang. Open het ei direct boven de wegen papier, zodat de dooier voorzichtig rolt.
- Onderzoek de dooier voor de witte zone van splitsing, die zichtbaar is als een vage witte ring rondom de embryonale ontwikkeling en oriënteren de dooier met behulp van extra fijne getipt tang zodat het embryo is gelegen in het centrum.
Opmerking: Als een vage witte cirkel op het oppervlak van de dooier niet wordt waargenomen, neemt de fijne tang en voorzichtig rollen de dooier over totdat het embryo is op de top van de dooier. Opmerking: Voor stap 1 - 9 22, de embryonale schijf minder dan 6 mm in diameter en is zichtbaar als een zwakke licht ondoorzichtige schijf op het oppervlak van de dooier - zie Figuur 1 voor referentie. Voor podia 10 jaar en ouder 22, bloed zwembaden toestaan verbeterd visibility van het embryo, maar zorg om te voorkomen dat aanprikken van de dooierzak, want dit maakt het lokaliseren van de embryo moeilijk.
3. Scheiding van Embryo van extra-embryonaal weefsel
- Doorprik de randen van de dooier druk (figuur 1B) te verlichten, en maak steekslagen over de lengte van de dooier diameter langs de embryonale schijf. Herhaal maken van deze diagonale lijnen tot het gedeelte van de dooier die het embryo met succes gescheiden (Figuur 1B). Opmerking: deze stap kan de dooier massa intact, maar de verlaagde druk op het oppervlak van de dooier zorgt voor meer precisie bij het snijden in het embryo, het voorkomen van schade embryonale structuren.
- Verwijder de randen van de dooier met een transferpipet. Opmerking: Verwijder zoveel dooier mogelijk, maar laat een klein bedrag, zodat het embryo zich niet houdt aan de droge ondergrond van de wegen papier en scheuren.
- Was de embryonale schijf door dispensing 1X PBS bij 45 ° naar de bodem van het embryo. Plaats de punt van de pipet naast-niet boven de embryonale schijf. Indien extra dooier moet worden verwijderd lijk is dooier met de scalpel op de wegen papier alvorens het embryo de petrischaal. Opmerking: Deze methode verwijdert het embryo uit het oppervlak van het papier te wegen.
- Breng de embryo met een pipet met een minimaal volume 1X PBS tot een kleine plastic petrischaal. Was de embryo door het toevoegen van meer 1X PBS in de petrischaal en druipend 1X PBS in de buurt, maar niet direct op, het embryo. Swirl de petrischaal te wassen en te verwijderen resterende dooier, kantel de petrischaal en verwijder afval 1X PBS met de overdracht pipet.
OPMERKING: Bij de 1X PBS wordt verwijderd, het embryo meestal niet hecht aan de bodem van de petrischaal omdat het kunststof oppervlak is glad met residuele 1X PBS. Echter, meer 1X PBS worden toegevoegd indien het embryo kleeft aan het gerecht.
Als bevestiging thij embryo, volg dan de stappen 3.5 en 3.6. Als flits bevriezen van de embryo, doorgaan naar onmiddellijk stap 3.8. - Indien herstel van het embryo voor in situ hybridisatie, onmiddellijk aan toevoegen 4% PFA aan de petrischaal om het embryo dompelen. Druppel 4% PFA direct op de bovenkant van het embryo om het plat; dit voorkomt dat het embryo van curling. Bevestig de embryo in 4% PFA bij 4 ° C gedurende 12 uur.
- Na fixatie dehydrateren embryo gegradeerde methanol (MeOH) oplossingen en bewaar bij -20 ° C in 100% MeOH.
- Als het embryo tussen fasen 1-8 22, verwijder de vitelline membraan gehecht aan het embryo. Opmerking: Deze stap kan worden uitgevoerd tijdens of na fixatie. Embryo jonger dan 8 fase 22 niet gemakkelijk zichtbaar omdat zij zich aan de vitelline-membraan, verduistert sleutelstructuren zoals getoond in figuur 2A.
- Pak de rand van het membraan dat buiten de zone van de kruising met de extra fijne pincet. Carefully flip het embryo over meerdere malen weg te wassen resterende dooier korrels en de hechting van de embryonale schijf naar de vitelline membraan los. Opmerking: Raak het midden van het embryo, omdat dit embryonale structuren beschadigen.
- Als een kloof lijkt er niet tussen de zone van knooppunt en de vitelline membraan, zachtjes krassen op de zone van de kruising met de extra fijne getipt tang om het los te maken van de vitelline membraan. Pak de vitelline membraan met de extra fijne tip pincet en trek het voorzichtig uit de buurt van het embryo. Indien nodig, trek het embryo uit de buurt van de vitelline membraan door het vastgrijpen van de perifere rand van de embryonale schijf op de zone van kruising.
- Gooi de vitelline membraan in biohazard 1 afval (bioveiligheid niveau 1) na verwijdering.
- Bij het uitvoeren van een ISH test op jonge embryonale stadia, volgt standaard hele mount ISH protocollen voor kippenembryo's 24, 25, maar rekening houden met de volgende suggesties.
- Voor embryo stadium 0-6 22, behandelen met 5 ug / ml proteïnase K in 1X PTW gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Behandel embryo opgevoerd 7 - 12 22 met 10 ug / ml proteïnase K in 1X PTW gedurende 10 min bij 37 ° C om achtergrondkleuring te verminderen.
- Om voldoende kleurreactie produceert lage niveaus van genexpressie te detecteren in stap 1 - 10 22, geïncubeerd met 10 ug / ml probe concentratie 12 uur. Voor oudere stadia, incubeer met 1 & #956, g / ml concentratie probe bij 60 ° C.
4. Edu celproliferatietest. Oprichting en Detectie van Edu in Zebravinken Embryo's.
- Kaars het ei met behulp van een glasvezel-verlichting lamp voor het embryo of de dooier te lokaliseren.
- Markeer de kant van het ei tegenover de locatie van het embryo of dooier in het ei zodat het embryo niet wordt beschadigd tijdens de micro-injectie proces.
- Bekleed een 60 mm kunststof schaal met klei en schimmels in de vorm van een kom om het ei te houden in de gewenste oriëntatie. De gemarkeerde plaats moetgericht op het inbrengen van de micro-injectie naald met de micromanipulator mogelijk. Opmerking: De klei wordt het ei stabiliseren tijdens micro-injectie en gedurende de incubatie in stap 4.11.
- Trek twee glazen capillaire micro-injectie naalden. Blunt een naald om een gaatje te prikken in het ei op de gemarkeerde plek. Bereid de tweede micro-injectie naald voor injectie door back-loaden met minerale olie en deze in de microinjector.
- Stel het volume van de oplossing vrijkomt per injectie 59,8 nl op de microinjector.
- Plaats de micro-injectie naald met de 10 mM voorraad EDU oplossing.
- Maak een gat in de schelp op de gemarkeerde plek met de afgestompte glazen capillair, zorg ervoor dat niet breken de shell of drop stukken van de schaal in het ei holte. Richt het ei, zodat het gat in een hoek van 45 °, waardoor de micro-injectie naald rechtstreeks door de holte worden ingebracht om de dooier of embryo.
- Met behulp van de micromanipulator, plaatst u degeladen naald ongeveer 1,0 cm in de holte.
- Injecteer de gewenste hoeveelheid van de EDE oplossing direct op het ontwikkelende embryo en de dooier. Opmerking: Er kunnen maximaal 478 nl van Edu kan worden geïnjecteerd zonder dat dit tot embryonale sterfte.
- Onmiddellijk wikkel het ei en de houder klei met meerdere lagen plasticfolie het ei en de schotel verdroging van het embryo tijdens incubatie voorkomen dekken. Tape de randen van de plastic wikkel om de bodem van de schaal te voorkomen dat de kunststof uitpakken tijdens incubatie. Opmerking: De plastic verpakking mag alleen onmiddellijk vóór versnijding worden verwijderd.
- Laat de nieuw prolifererende cellen de EDE nemen door incuberen van de eieren bij 37 ° C totdat het gewenste stadium is bereikt. Na injectie, doe ei niet terug naar kantelen planken in incubator. Plaats de plastic verpakte klei beklede schaal op stabiele ondergrond in de couveuse.
- Verwijder de plasticfolie en ontleden het embryo na de eerder genoemde protocol.Bevestig het embryo in 4% PFA en incubeer 12 uur bij 4 ° C zoals hierboven beschreven. Na fixatie, wassen met 100% ethanol (EtOH) gedurende 5 min en opslag in vers 100% EtOH bij -20 ° C tot verdere analyse.
5. Edu "Klik" Reactie Protocol
De volgende stappen zijn allemaal uitgevoerd in glazen flesjes.
- Rehydrateren embryo's met telkens 5 min wasbeurten van de volgende:
- EtOH, 75% EtOH en 25% steriel gedeïoniseerd gedistilleerd (SDD) water, 50% EtOH en 50% sdd water, 25% EtOH en 75% 1X PTW, 100% 1X PTW
- Was driemaal 100% 1X PTW gedurende 10 min. elk.
- Verdun de buffer additiereactie (Kit Component F) door combinatie van 1 deel van de 10X voorraad bufferoplossing (10 pl) tot 9 delen sdd water (90 ui).
- Bereid het reactiemengsel in een afzonderlijke buis door mengen van de volgende: 875 pi 1X PBS, 20 gl CuSO 4, 5 pl azide, 100 ul verdund reactiebuffer additief.Opmerking: Het volume van het reactiemengsel kan worden afgebouwd. De reactie werkt als het embryo volledig bedekt in het reactiemengsel. Voeg de verdunde reactie buffer additief (stap 5.3) direct voor gebruik. Alle volgende stappen worden uitgevoerd in het donker. Bedek de embryo's met folie ter bescherming tegen het licht.
- Bedek de flesjes met aluminiumfolie en incubeer ze verticaal bij kamertemperatuur gedurende twee uren door ze in een piepschuim rek bevestigd aan een nutator.
- Was de embryo 3 maal in vers 1X PBS gedurende 10 min. elk.
- Incubeer de embryo in vers 4% PFA gedurende de nacht bij 4 ° C.
- Was 3 keer in 1X PBS gedurende 10 min. elk en bewaar in vers 1X PBS bij 4 ° C. Bedek de embryo's met folie tot verdere analyse.
Representative Results
De stappen schematisch in figuur 1 geven de verschijning van het embryo, terwijl aan de vitelline-membraan (A) en is de juiste methode om het embryo te scheiden van de dooier (B). Het embryo kan worden geïdentificeerd door de zone van de splitsing, dat is veel lichter dan de vitelline membraan. De embryo zelf is vaak moeilijk te onderscheiden totdat de dooier wordt weggesneden. Wanneer het embryo wordt ontleed uit het ei, kan worden vastgesteld of flash voor toekomstig gebruik ingevroren. Indien een in situ hybridisatie is voorzien voor de ontleed embryo, moet de vitelline membraan dat is gehecht aan het embryo via de zone van overgang verwijderen. Figuur 2 illustreert de verbeterde zichtbaarheid van het embryo na de membraan is verwijderd (C), en de juiste manier om de vitelline membraan (A, B) schillen. Na dissectie en fixatie, geheel mount in situ hybridisatie werd uitgevoerd zoals in figuur 3 (A, A ', B, B") En figuur 4 (A, A ', B, B') en Figuur 5 (A, B, C) verschillen in orthodenticle homeobox 2 (Otx2) expressie in embryo ontwikkelingsgebied blootgesteld aan lage doses methylkwik detecteren. Figuur 5 toont sense probe resultaten, waaruit blijkt gebrek aan achtergrond. In figuur 4, ondanks wordt ontleed uit het ei op hetzelfde tijdstip, de embryo ontwikkelingsgebied blootgesteld aan methylkwik (MeHg) gevorderd stadium 5 22 (B, B '), terwijl de controlegroep embryo ontwikkeld op stand 6 22 (A, A '). De groep van embryo's uitgesneden en figuur 4 werden vanuit het nest en uit de incubator op dezelfde tijden. Hoewel sommige natuurlijke variatie aanwezig is in ontwikkeling is, gebaseerd op eerdere dissectie gegevens, is het onwaarschijnlijk dat temperatuurschommelingen in de incubator zou veroorzaken slechts 2,4 dpm methylkwik embryo ontwik zijnpmentally vertraagd. De verschillen in fasen geven veranderingen in celproliferatie in embryo ontwikkelingsgebied blootgesteld aan methylkwik.
Vóór versnijding, werd Edu geïnjecteerd in een dag 2 ei en overnacht incuberen. Na dissectie en fixatie van het podium 16 22 embryo, werd edu gevisualiseerd met "click" chemie, waardoor detectie van prolifererende cellen zoals in figuur 6 (A, B, C). Het is belangrijk tijdstippen nauwlettend bij het plaatsen van eieren in de broedmachine en tijdens dissecties, blootstelling aan methylkwik of uitvoeren van de test kan EDU ontwikkeling progressie verstoren. De eerste injectie werd uitgevoerd op dag 0, die de dag van verzameling was zoals gespecificeerd in stap 1.3. Dit embryo is ongeveer 38 uur later (fase 7 22) ontleed. De overleving werd gevonden ongeveer 90% (met dezelfde snelheid als controle embryo) zijn zolang de injectie bedroeg onder 478 nl.
22 embryo, werd een RNA-extractie volgens het protocol van de fabrikant zonder optimalisatie nodig, zoals in figuur 7. Het verwijderen van de vitelline membraan nodig was voor RNA extractie en later qRT-PCR toepassingen.
Opmerking: alle embryo cijfers zijn georiënteerd dat de voorste en achterste gebieden zijn bovenaan en onderaan de afbeeldingen respectievelijk.
Figuur 1. Procedure voor het lokaliseren en het ontleden van zebravinken embryo's, podia 1-10 22. Locate embryo door zacht glooiende de dooier tot de vage witte schijf blijkt (A). Zodra deembryo is gelegen in het centrum van de dooier, wordt de dooier ontleed op een stapsgewijze manier (B) waar de eerste snede verlicht de druk van de vitelline membraan (1) en de daaropvolgende bezuinigingen (2) grenzen aan de zone van splitsing (zj) dat is gehecht aan de vitelline membraan. Schaalbalken vertegenwoordigen 1 mm.
Figuur 2. Verwijdering van vitelline membraan en zichtbaarheid van embryonale structuren. Na verwijdering van het embryo uit de dooier, plaats embryo in een petrischaal met 4% PFA. Indien een in situ hybridisatie moet worden uitgevoerd, zichtbaarheid van de embryonale structuren is essentieel en kan worden bereikt door verwijdering van de vitelline-membraan (A). Pak de vitelline membraan met extra fijne tip pincet en voorzichtig afpellen het weg van het embryo door het hanteren van het embryo direct aan de buitenste rand, indien nodig(B). Vitelline membraan verwijdering verhoogt helderheid van embryonale structuren en laat embryo's worden afgebeeld of verwerkt met in situ hybridisatie (C). Schaalbalken vertegenwoordigen 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Ganse berg in situ hybridisatie uitgevoerd op zebravink embryo ontwikkelingsgebied blootgesteld aan methylkwik. Expressie patronen van orthodenticle homeobox 2 (Otx2) werden gekenmerkt in embryo's worden blootgesteld aan 0,0 ppm methylkwik (A, A ') en 2.4 ppm methylkwik (B, B ') via ouderlijke dieet. De dorsal (A) en ventrale (A) expressie van Otx2 is zichtbaar in de middenhersenen en optische blaasjes tijdens fase 12 22. de behandelingsgroep embryo's werden ontleed op hetzelfde tijdstip, maar waren ontwikkelingsgebied vertraging gezien in de dorsale (B) en ventrale (B ') visie van het hoofd structuren, die kenmerkend zijn voor het podium 11 22 afkortingen zijn:. mb, middenhersenen; op, optische blaasje. Schaalbalken vertegenwoordigen 1 mm.
Figuur 4. Whole mount in situ hybridisatie uitgevoerd op zebravink embryo ontwikkelingsgebied blootgesteld aan methylkwik. Expressie patronen van orthodenticle homeobox 2 (Otx2) kenmerkten zich in fase 6 22 embry os blootgesteld aan 0,0 ppm methylkwik (A, A ') en fase 5 22 embryo's worden blootgesteld aan 2,4 ppm methylkwik (B, B') via ouderlijke dieet. Afkortingen: am, voorste rand van mesoderm; nee, notochorda, notochorda mesoderm; po, proamnion, anterior blastopore; ps, primitieve streep 22. Schaalbalken vertegenwoordigen 1 mm.
Figuur 5. Whole mount in situ hybridisatie uitgevoerd op zebravink embryo's met behulp van sense probe. (A) Etappe 5 22 embryo. (B) Vroeg stadium 6 22 embryo. (C) Etappe 11 22 embryo. Schaalbalken vertegenwoordigen 1 mm.
6 "src =" / files/ftp_upload/51596/51596fig6highres.jpg "/>
Figuur 6. Edu integratie en de bescherming in zebravinken embryo. Edu "click" chemie werd gebruikt om delende cellen te detecteren in een fase 16 22 embryo (A, B, C). Edu wordt opgenomen in het DNA in plaats van thymidine 26, 27 en gedetecteerd met klikchemie 27. Proliferatie is duidelijk zichtbaar in de zijranden van de somieten en de tailbud. Paneel A toont proliferatie uitsluitend voorkomen in de achterkant van het embryo en toont ook individuele proliferatieve cellen. Paneel B toont de proliferatieve locaties in het hele embryo. Paneel C toont het voorste gebied, en toont de zeer proliferatieve telencephalon (te) meer in detail. Afkortingen: af, vruchtwater voudig; FLB, voorpoot knop; HLB, achterbeen knop; le, lens blaasje; ms, mesencephalon; mt, Metencephalon; opc, optic cup; pa, keelboog; sm, somiet mesoderm; tb, tailbud; te, telencephalon. Schaalbalken vertegenwoordigen 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7. Kwaliteit van RNA geëxtraheerd uit ontleed zebravinken embryo. Controle (0.0 ppm) en 1,2 ppm methylkwik embryo's werden ontleed en flash bevroren zoals beschreven in stap 3.8. Elke baan toont RNA geëxtraheerd uit twee gehomogeniseerd embryo's van elke behandelingsgroep.
Discussion
Recente ontwikkeling van een embryologische enscenering gids 22 en genoomannotatie maken de zebravink een wenselijke modelorganisme voor ontwikkelingsstudies. Echter, de geringe omvang en de kwetsbaarheid van de zebravink embryo's, die variëren van 3 tot 7 mm in stappen 1 - kan 10 22, dissecties moeilijk 11, 14 maken. Lokaliseren en schoon verwijderen van embryo's van het oppervlak van de dooier kan een uitdaging zijn. Dit protocol biedt voldoende gedetailleerd zijn om de procedure uit te voeren met gemak. Dit protocol toont de kritische stappen die niet bekend staat, maar zijn noodzakelijk om een succesvolle dissectie waarborgen. Zo is het essentieel om een laagje eigeel tussen het embryo en vel papier wegen uit te sluiten plakken verlaten.
Zowel de identificatie en verwijdering van het embryo kan moeilijk zijn. Om problemen met het identificeren van de embryo op het oppervlak van de dooier, schijnen licht direct boven de dooier nadat zijverwijderd uit het ei, en kijk naar de dooier op een 45 ° hoek met de embryo vinden. Zodra het embryo ligt, snijd de dooier op weeg papier en zorg ervoor dat niet scheurt het embryo.
Als verdere toepassingen omvatten imaging anatomische verschillen, in situ hybridisatie of celproliferatie assays, is het belangrijk om de vitelline membraan te verwijderen in fase 1-8 22 voor een betere visualisatie van structuren. Als moeilijkheden ondervindt bij het verwijderen van de dooier of het vitelline membraan in een vroeg stadium, bevestig de embryo in 4% PFA vóór het wassen in 1X PBS om embryonale kwetsbaarheid te verminderen. Door eerst de vitelline membraan tijdens dissectie zoals beschreven, structuren zijn duidelijk zichtbaar en intact in zebravink embryo's na het uitvoeren van een in situ hybridisatie.
Een beperking van Edu is dat toediening van de dosering volumes meer dan 478 nl leidt tot embryonale fataliteit. Echter, de overgrote doseringstraject laat varying niveaus van proliferatieve cel tagging.
De "klik" reactie die in deze kit is de Koper (I)-gekatalyseerde-Alkyn-azide-Cycloadditiereacties (Cu (I) AAC). In dit specifieke reactie, is een-alkyn bevattende thymidine analoog molecuul (EDU) opgenomen door actief delende cellen. De alkyn groep in de EDU uitsteekt uit de helixstructuur van het DNA, en wordt gedetecteerd door blootstelling aan een azide molecuul geconjugeerd aan een groen, fluorescent molecuul dat bindt aan het vrije alkyn groep. De groene fluorescentie geeft de nieuw prolifererende cellen in de embryo. De bio-orthogonaliteit van het azide en alkyn groepen voorkomt niet-specifieke kleuring, omdat deze reactieve soorten niet van nature aanwezig in organismen. Ook, omdat het DNA niet te worden gedenatureerd zodat de reactie optreedt, kan verder DNA-afhankelijke analyse gemakkelijk uitgevoerd 27.
Een inherente beperking van deze werkwijze is de geringe omvang en fragiliteit van zebravink embryo's. Het verwijderen van de vitelline membraan van embryo stadia 1-15 22 kan leiden tot schadelijke embryonale structuren wanneer niet met de nodige voorzichtigheid. Echter, dit protocol vereenvoudigt de uitsnijmethode, waardoor onderzoekers vroege embryonale stadia om structurele afwijkingen en genexpressie die niet eerder bestudeerd onderzoeken. Dit protocol maakt de weg vrij voor een overvloed van cellulaire-moleculaire testen waarmee de onderzoekers om de ontwikkelingsdoelen oorsprong van volwassen fenotypes te bepalen. Zo zal het mogelijk zijn onderzocht genexpressie betrokken bij oefendoeleinden onder verschillende omgevingscondities of volgende farmacologische behandelingen in de eerste ontwikkelingsfase 28, 29,30,31. Hoewel niet aangetoond in dit artikel, deze methode mogelijk maakt voor andere procedures, zoals radioactieve in situ hybridisatie op zebravink weefsel secties en elektroporatie / in ovo operatie 32, 33,34. Gezien het feit dat de zebravink is opgericht als een belangrijk modelorganisme in een enorme hoeveelheid literatuur, zoals studies onbenutte kansen om ontwikkelingsstoornissen mechanismen koppelen met volwassen fysiologie en gedrag, in het bijzonder de ontwikkeling van taal 7, 9.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs danken hun financieringsbronnen, Howard Hughes Medical Institute Undergraduate Science Education Program aan de Universiteit van William en Mary; Grant sponsor: NIH (MSS); Grant nummer: R15NS067566. Ze steun van het College of William and Mary, Departement Biologie en Hogeschool voor de Kunsten en Wetenschappen voor hulp bij de verzorging van dieren ook erkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken egg incubator | We use a Picture Window Hova-Bator Incubator, Circulated Air Model | ||
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging kit | Invitrogen | C10337 | Detection of cell proliferation. |
| Dissection microscope | We use Olympus SZ61 | ||
| 7'' Drummond capillary for Nanoject II injector | Drummond | 3-00-203-G/X | |
| Drummond Nanoject II microinjector | Drummond | ||
| Dumont Tweezers #55 | World Precision Instruments | 14099 | |
| Ethanol (EtOH) | |||
| 50 ml Falcon tube (polypropylene) | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| FastPrep Lysis Matrix H tubes | MP biomedicals | 6917-100 | Used for RNA extraction, used to homogenize embryos |
| Fiber optic illuminator lamps (High Intensity Illuminator) | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite MI-150 | |
| Glass vials with screw cap (DEPC treated) | Fisher Scientific | 03-338A | |
| Microcentrifuge eppe tube (1.5 ml) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M-8410 | |
| Modeling Clay | Any brand | ||
| Narshige PB-7 needle puller | Narshige | ||
| Omni Bead Ruptor Homogenizer | OMNI International | 19-010 | Used for RNA extraction |
| 4% Paraformaldehyde (4% PFA): 20 ml 8% PFA (32 g paraformaldehyde, 350 ml sdd H2O, adjust pH to 7.6, 400 ml sdd H2O), 20 ml 2x PBS | Fixation of embryos. Caution, is harmful and do not inhale. | ||
| Phosphate buffered saline (1x PBS): 200 ml 10x PBS, 1,800 ml Barnstead H2O, adjust pH to 7.4 | |||
| Phosphate buffered saline (10x PBS): 800 ml Barnstead, 2.013 g KCL, 80.063 g NaCl, 2.722 g KH2PO4 monobasic, 14.196 g Na2HPO4 dibasic, 200 ml Barnstead H2O, adjust pH to 6.5 | |||
| Phosphate buffered saline with 0.1% Tween-20 (1x PTw): 1,800 ml Barnstead H2O, 200 ml 10x PBS, adjust pH to 7.4, 2 ml Tween-20 | |||
| 35 ml Plastic Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| plastic wrap | Any brand | ||
| Prepease RNA Spin Kit | PrepEase, Affymetrix | 78766 1 KT | Used for RNA extraction, used to homogenize embryos |
| Reaction Mix: 875 μl 1xPBS, 100 mM 20 μl CuSO4 (Kit Component E), 5 μl Alexa Fluor 488 azide (Kit Component B), 100 μl diluted reaction buffer additive (Kit Component F) | Invitrogen | C10337 | Detection of cell proliferation. |
| sdd H2O | |||
| Seed cup | We use it as a container when incubating eggs | ||
| Stainless steel scalpel | |||
| Standard nest box | We use Abba Plastic Finch Nestboxes | ||
| 4 ml, Teflon Lined Cap, Glass Vials | Fisher Scientific | 02-912-352 | |
| Transfer pipettes (polyethylene) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| 4 x 4 weigh paper | Fisher Scientific | 09-898-12B |
References
- Eng, M. L., Elliott, J. E., MacDougall-Shackleton, S. A., Letcher, R. J., Williams, T. D. Early exposure to 2,2',4,4',5-pentabromodiphenyl ether (BDE-99) affects mating behavior of zebra finches. Toxicol Sci. 127, 269-276 (2012).
- Winter, V., Elliott, J. E., Letcher, R. J., Williams, T. D. Validation of an egg-injection method for embryotoxicity studies in a small, model songbird, the zebra finch (Taeniopygia guttata). Chemosphere. 90, 125-131 (2013).
- Maney, D. L., Goodson, J. L.
- Kirn, J. R. The relationship of neurogenesis and growth of brain regions to song learning. Brain and Language. 115, 29-44 (2010).
- Fisher, S. E., Scharff, C. FOXP2 as a molecular window into speech and language. Trends in Genetics. 25, 166-167 (2009).
- Tokarev, K., Tiunova, A., Scharff, C., Anokhin, K. Food for Song: Expression of C-Fos and ZENK in the Zebra Finch Song Nuclei during Food Aversion Learning. PLoS One. 6, (2011).
- Vargha-Khadem, F., Gadian, D. G., Copp, A., Mishkin, M. FOXP2 and the neuroanatomy of speech and language. Nat Rev Neurosci. 6, 131-138 (2005).
- Schulz, S. B., Haesler, S., Scharff, C., Rochefort, C. Knockdown of FoxP2 alters spine density in Area X of the zebra finch. Genes, Brain and Behavior. 9, 732-740 (2010).
- Jarvis, E. D., et al. Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution. Nat Rev Neurosci. 6, 151-159 (2005).
- Brainard, M. S., Doupe, A. J. Translating birdsong: songbirds as a model for basic applied medical research. Annu Rev Neurosci. 36, 489-517 (2013).
- Mayer, U., Watanabe, S., Bischof, H. J. Spatial memory and the avian hippocampus: Research in zebra finches. J Physiol Paris. , (2012).
- Warren, W. C., et al.
- Agate, R. J., Scott, B., Haripal, B., Lois, C., Nottebohm, F. Transgenic songbirds offer an opportunity to develop a genetic model for vocal learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17963-17967 (2009).
- Birkhead, T. R., et al. Internal incubation and early hatching in brood parasitic birds. Proceedings of the Royal Society Biological Sciences. 278, 1019-1024 (2011).
- Haesler, S., et al. FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners. J Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).
- Godsave, S. F., Lohmann, R., Vloet, R. P. M., Gahr, M. Androgen receptors in the embryonic zebra finch hindbrain suggest a function for maternal androgens in perihatchingsurvival. Journal of Comparative Neurology. 453, 57-70 (2002).
- Stern, C. D. The chick; a great model system becomes even greater. Dev Cell. 8, 9-17 (2005).
- Kuenzel, W. J., Medina, L., Csillag, A., Perkel, D. J., Reiner, A. The avian subpallium: new insights into structural and functional subdivisions occupying the lateral subpallial wall and their embryological origins. Brain Research. 1424, 67-101 (2011).
- Tickle, C. The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development. Mech Dev. 121, 1019-1029 (2004).
- Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development. Neural Development. 7, (2012).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenet Genome Research. 117, 231-239 (2007).
- Murray, J. R., Varian-Ramos, C. W., Welch, Z. S., Saha, M. S. Embryological staging of the zebra finch, Taeniopygia guttata. J Morphol. , (2013).
- Hawkins, P., Morton, D. B., Cameron, D., Cuthill, I., Francis, R., Freire, R., Gosler, A., Healy, S., Hudson, A., Inglis, I., Jones, A., Kirkwood, J., Lawton, M., Monaghan, P., Sherwin, C., Townsend, P. Laboratory birds: refinements in husbandry and procedures. Fifth report of BVAAWF/FRAME /RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement. Lab Anim. , (2001).
- Pearse II, R. V., Esshaki, D., Tabin, C. J., Murray, M. M. Genome-wide expression analysis of intra- and extraarticular connective tissue. Journal of Orthopaedic Research. 27, 427-434 (2009).
- Pizard, A., et al. Whole-mount in situ hybridization and detection of RNAs in vertebrate embryos and isolated organs. Current Protocols in Molecular Biology. 66, (2004).
- Warren, M., Puskarczyk, K., Chapman, S. C. Chick embryo proliferation studies using EdUlabeling. Developmental Dynamics. 238, 944-949 (2009).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA syntesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 105, 2415-2420 (2008).
- Hoogesteijn, A. L., DeVoogd, T. J., Quimby, F. W., De Caprio, T., Kollias, G. V. Reproductive impairment in zebra finches (Taeinopygia guttata). Environmental Toxicology and Chemistry. 24, 219-223 (2005).
- Winter, V., Williams, T. D., Elliott, J. E. A three-generational study of In ovo exposure to PBDE-99 in the zebra finch. Environmental Toxicology and Chemistry. 32, 562-568 (2013).
- Kitulagodage, M., Buttemer, W. A., Astheimer, L. B. Adverse effects of fipronil on avian reproduction and development: maternal transfer of fipronil to eggs in zebra finch Taeinopygia guttata and in ovo exposure in chickens Gallus domesticus. Ecotoxicology. 20, 653-660 (2011).
- Hallinger, K. K., Zabransky, D. J., Kazmer, K. A., Cristol, D. A. Birdsong differs between mercury-polluted and reference sites. The Auk. 127, 156-161 (2010).
- Chen, C. C., Wada, K., Jarvis, E. D. Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. Interspecies Avian Brain Chimeras Reveal That Large Brain Size Differences Are Influenced by Cell–Interdependent Processes. PLoS One. 7, (2012).
- Chen, C. C., Winkler, C. M., Pfenning, A. R., Jarvis, E. D. Molecular profiling of the developing avian telencephalon: Regional timing and brain subdivision continuities. The Journal of Comparative Neurology. 521, 3666-3701 (2013).
