Abstract
Den sebra finch (Taeniopygia guttata) er blitt en stadig viktigere modellorganisme i mange områder av forskning inkludert toksikologi 1, 2, atferd tre, og hukommelse og læring 4,5,6. Som den eneste sangfuglen med en sekvensert genomet, har sebra finch stort potensial for bruk i utviklingsstudier; Men de tidlige stadier av sebra finch utvikling er ikke godt undersøkt. Mangel på forskning i sebra finch utviklingen kan tilskrives vanskelighetene med å dissekere den lille egg og embryo. Følgende disseksjon metoden minimerer embryonale vev skade, som gjør det mulig for etterforskningen av morfologi og genuttrykk i alle stadier av embryoutvikling. Dette tillater både lyse felt og fluorescens bildekvalitet av befruktede egg, bruk i molekylære prosedyrer som for eksempel in situ hybridisering (ISH), celleproliferasjon analyser, og RNA ekstraksjon for kvantitative analyser som kvantitativ real-time PCR (qtRT-PCR). Denne teknikken gjør det mulig for etterforskerne å studere tidlige stadier av utviklingen som tidligere var vanskelig tilgjengelig.
Introduction
Det overordnede målet med denne teknikken er å skaffe sebra finch (Taeniopygia guttata) embryoer fra de tidligste stadier av embryogenesis for bruk i et bredt spekter av utviklingsstudier. Zebra Finch har blitt den dominerende songbird modellorganisme og har blitt brukt mye i en rekke felt, inkludert toksikologi 1,2, atferd 3, hukommelse og læring 4,5,6, komparativ nevroanatomi 7,8, og språkutvikling 9,10 . Som den eneste sangfuglen med en sekvensert genomet, gjør at sebra finch molekylær og genetisk studie av Passeriformes orden, som representerer over 50% av kjente fuglearter 11, 12,13.
Til tross for bruk av voksne og juvenile sebra finch i et variert utvalg av felt, har få studier utført på sebra finch embryoer, særlig i tidlige stadier av utviklingen. Dette kan tilskrives den lille størrelsen på sine egg ennd embryoer, og deres nyere status som modellorganisme 14,15,16 for studier der kylling (Gallus gallus domesticus) ble tidligere brukt som en dominerende modell system 17,18,19,20,21. Men som ikke-vokal elever, kyllinger er ikke en passende modellsystem for å studere det genetiske grunnlaget for vokal læring, utvikling av vokal læring, arvbarhet, atferd, og kortikale-basalgangliene kretser involvert i motorisk læring 10.
Det er viktig å merke seg at sebra finch embryoer er mye mer delikat og lettere skadet enn kyllingembryo under disseksjon og molekylære prosedyrer. Spesielt er større forsiktighet som kreves når du utfører permeabilization trinnene på sebra finch embryoer. Sterke vaskemidler og enzymer som ikke ville skade en chick embryo kan skade sebra finch embryoer. Når det gjelder generell omsorg, er det nødvendig å sette sebra finch egg i små kopper før plassering i en inkubatorfor å hindre dem fra å bryte når rulle under inkubasjon.
Zebra Finch er mottagelig for atferdsstudier, lett og frodig avle året i fangenskap, og er vokal elever. Disse egenskapene tillate bruk av sebra finch å ivareta behovet for en modellorganisme som integrerer utvikling, genetikk, og atferdsmessige aspekter ved språk. Disseksjonene metoder beskrevet nedenfor, kombinert med en nylig utviklet iscenesettelse guide spesifikt for sebra finch 22, gjør sebra finch en stadig mer nyttig standardisert utviklingsmodellorganisme. Men å skaffe embryoer på tidlige stadier kan være skremmende. Protokollen lar etterforskerne å lett få tidlig stadium embryoer. Studier som undersøker den tidlige utvikling og molekylær utviklings grunnlag av komplekse atferd i sebra finch, eller de toksikologiske effekter på utviklingen i andre små, vil spurvefugler finner denne disseksjon metodikk nyttig.
Protocol
Etikk Uttalelse: Metodene ble gjennomført med tamme sebra finker fra ynglekoloni ved College of William and Mary. Alle prosedyrer fulgt RSPCA retningslinjer 23 og ble godkjent av College of William and Mary OLAW (Office of Laboratory Animal Welfare) Animal Welfare Assurance (# A3713-01) og hadde Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) godkjenning (# 2013-06 -02-8721-Dacris).
En. Egg Collection og Inkubasjon
- Etablere sebra finch parene på en 14:10 lys: mørke-syklusen. Levere mat, vann, høy, og et reir boks ad libitum. Merk: Rutinemessig stell og avl for sebra finker har blitt godt beskrevet 23.
- Forbered en standard chick inkubator med vippe hyller. Merk: opprettholde den kunstige inkubator ved 37.5 (+ / - 1) ° C med 80 til 95% fuktighet ved å tilsette vann til bunnen av inkubatoren på en daglig basis. Tillat inkubatoren ekvilibrering i to døgnfør du bruker.
- Velg små fôr kopper (5 x 7,6 cm) på minst 2,5 cm dype å holde egg i inkubator. Linje bunnen og nedre kanten av koppen med to lag av papirhåndkle, slik at koppen er polstret, og som samtidig gir egg for enkelt rulle. Plasser disse koppene på den skråstilte hyller av inkubatoren. Merk: For mye polstring kan hemme rullende, noe som vil hindre vellykket inkubasjon grunn til embryonale vedheft til skallet innvendig.
- Samle eggene på to timer etter start av det lys syklus. Merk: Dette reduserer avvik i fasen for utvikling av en gitt inkubasjonstid på grunn av foreldre inkubasjon.
- Plukk opp egg forsiktig med tommel og pekefinger på spissen og basen langs lengden av egget. Bruk en matt, mykt 4B grafitt blyant til å merke dato lagt og tid samlet inn fra redet. Merk: Jo mykere 4B blyant reduserer risikoen for blyanten bryte den skjøre eggeskall.
- 1.3.2) Plasser 1-5 merket egg i hver copp i inkubatoren, slik at eggene kan fritt rulle for å hindre embryonale adhesjon til det indre av skallet. Merk: Plassering mer enn fem egg i en kopp kan hindre rulling av de enkelte egg og redusere levedyktigheten av embryoer.
2. Fjerning av embryo fra Egg
- For å forberede for disseksjon, montere følgende materialer: en ren skalpell, fin tippet tang, og to ekstra fine tippet tang. Plasser 10 x 10 cm veie papir på basis av dissekere omfang å tilveiebringe en ren, ikke-absorberende overflate for disseksjon. Merk: veie papir er viktig fordi det gir enkel manipulering av eggeplomme og er den beste overflaten for å kutte de delikate membraner med en skalpell.
- Tilbered en delmengde av fosfatbuffer saltvann (1X PBS) i et 50 ml polypropylenrør, og tilegne seg i det minste tre overføringspipetter og en liten avfalls bøtte. Hvis fikse embryoene, forberede en delmengde av 4% Paraformaldehyde (PFA). Forsiktig: PFA damper er giftige, end alle trinnene involverer PFA bør gjøres inne i en avtrekkshette for å minimere eksponering. Hvis blitsen fryse embryo, få flytende nitrogen og holde den i nærheten av dissekere omfang. Sterilitet er ikke et problem for denne disseksjon protokollen, men sikre at alle materialer er rene.
- Ta egget fra inkubatoren på tidspunktet nødvendig for den ønskede scenen som beskrevet i sebra finch iscenesettelse guide 22. Merk: Fjern egg etter 36 timer med inkubasjon å dissekere stadium seks embryoer (Figur 4A) 22 og fjerne egg etter 56 timer med inkubasjon å dissekere stadium 12 embryoer (figur 3A) 22.
- Ved hjelp av en lampe fiberoptisk-lys, stearinlys egget ved å holde den langs den vertikale aksen og skinne lys gjennom egget til å lyse interiøret. Plasser tuppen av lyset bak egg og finn plomme og utvikling av embryo.
- Plasser skalpell på motsatt side av eggeplomme og skjær langs egg fra tuppenbase med svak trykk.
- Fjern innholdet i egget ved forsiktig påføring av trykk på spissen og bunnen av egg med tommel og pekefinger, eller ved å lirke hverandre eggeskallet langs kuttet med pinsett. Åpne egg rett over veie papiret slik at plommen forsiktig ruller ut.
- Undersøke eggeplomme for den hvite sonen i veikryss, som er synlig som en svak hvit ring omkranser embryoutvikling og orientere plommen bruker ekstra fin tippet tang slik at fosteret ligger i sentrum.
Merk: Hvis en svak hvit sirkel på overflaten av eggeplomme ikke observeres, kan de fine pinsetter og forsiktig rulle eggeplomme over før fosteret er på toppen av eggeplomme. Merk: For trinn 1-9 22, er den embryoniske disk mindre enn 6 mm i diameter og er synlig som en svak, lett blakket disk på overflaten av eggeplomme - se figur 1 som referanse. For etapper 10 og eldre 22, blod bassenger tillate forbedret visibility av embryoet, men pass på å unngå punktering av plommesekken, da dette gjør finne embryo vanskelig.
Tre. Separasjon av embryo fra Extra-embryonale Tissue
- Punkterings kantene av eggeplomme for å avlaste trykket (figur 1B), og foreta enkle kutt på tvers av lengden av eggeplomme diameter ved siden av den embryoniske disk. Gjenta gjøre disse diagonale linjer til den delen av eggeplomme inneholder embryoet har blitt separert (Figur 1B). Merk: I dette trinnet kan plommemassen til å forbli intakt, men redusert trykk på overflaten av plommen tillater for økt nøyaktighet ved skjæring rundt embryoet, og hindrer skade på embryoniske strukturer.
- Fjern kantene av eggeplomme med en overførings pipette. Merk: Fjern så mye eggeplomme som mulig, men la et lite beløp, slik at fosteret ikke overholder den tørre overflaten på veie papir og slitasje.
- Vask den embryonale disken ved dispensing 1X PBS i 45 ° vinkel mot bunnen av embryoet. Plasser spissen av overføringspipetten ved-ikke over-embryonale disk. Hvis ytterligere plomme må fjernes, skille noe plomme med skalpell på veie papiret før du overfører embryo til petriskål. Merk: Denne metoden fjerner embryoet fra overflaten av veiepapir.
- Overfør embryoet ved hjelp av en overførings pipette sammen med et minimalt volum av 1X PBS til en liten, plast petriskål. Vask embryo ved å legge mer 1X PBS inn i petriskål og dryppende 1X PBS nær, men ikke direkte på, fosteret. Virvle petriskål for å vaske og fjerne rester av eggeplomme, vippe petriskål, og fjerne avfall 1X PBS med overføring pipette.
MERK: Når 1X PBS fjernes, embryoet vanligvis ikke holder seg til bunnen av petriskålen, fordi plastoverflaten er glatte med rest 1X PBS. Imidlertid kan mer 1X PBS legges om embryoet fester seg til parabolen.
Hvis feste than embryo, følger du trinn 3,5 og 3,6. Hvis blitsen fryse embryo, hopp til trinn 3,8 umiddelbart. - Hvis fikse embryo for in situ hybridisering, straks legge 4% PFA til petriskål å senke embryo. Drypp 4% PFA direkte på toppen av embryoet for å flate det; dette hindrer embryo fra curling. Fest embryo i 4% PFA ved 4 ° C i 12 timer.
- Etter fiksering, dehydrerer embryoer i gradert metanol (MeOH) løsninger og oppbevar ved -20 ° C i 100% MeOH.
- Hvis fosteret er mellom trinnene 1 - 8 22, fjerne vitelline membran levd opp til embryoet. Merk: Dette trinnet kan gjøres under eller etter fiksering. Embryoer yngre enn stadium 8 22 er ikke lett å visualisere fordi de holder seg til vitelline membran, skjule viktige strukturer som vist på figur 2A.
- Grip kanten av membranen som strekker seg utover den sonen av krysset med ekstra fin pinsett. Carefully flip embryoet over flere ganger for å vaske bort gjenværende plommegranuler og å løsne klebing av embryonale disk til vitelline membran. Merk: Ikke ta på midten av embryo, da dette vil skade embryonale strukturer.
- Hvis et gap ikke vises mellom sonen av krysset og vitelline membran, forsiktig skrape i sonen av krysset med ekstra fin tippet tang for å løsne den fra vitelline membran. Grip vitelline membran med ekstra fin tippet pinsett og dra det forsiktig bort fra embryo. Hvis det er nødvendig, dra forsiktig embryoet bort fra vitelline membranen ved å ta tak i perifere kanten av embryonale disken på sonen av krysset.
- Kast vitelline membran i biohazard en avfall (biosikkerhet nivå 1) etter fjerning.
- Når du driver en ISH analysen på unge embryonale stadier, følger standard hele mount ISH protokoller for kyllingembryo 24, 25, men vurdere følgende forslag.
- For embryoer trinn 0-6 22, behandle med 5 ug / ml proteinase K i 1X Ptw i 5 min ved romtemperatur. Treat embryoer trinnvis 7 - 12 22 med 10 ug / ml proteinase K i 1X Ptw i 10 min ved 37 ° C for å redusere bakgrunnsfarging.
- For å produsere en tilstrekkelig farge-reaksjonen for å detektere lave nivåer av genekspresjon i trinn 1 - 10 22, inkuberes med 10 ug / ml probe-konsentrasjon i 12 timer. For eldre stadier, inkuberes med en & #956 g / ml probe-konsentrasjon ved 60 ° C.
4. Edu Cell Proliferation analysen. Innlemmelse og Påvisning av Edu i Zebra Finch embryo.
- Candle egget ved hjelp av en lampe fiberoptisk lyset for å finne embryo eller eggeplomme.
- Merk den side av egget motsatt plasseringen av embryoet eller eggeplomme i egget for å sikre at embryoet ikke skades under mikroinjeksjon prosessen.
- Linje en 60 mm plast-tallerken med modelleringsleire og forme det i form av en skål for å holde egget i den ønskede retning. Den merkede stedet bør væreorientert for å tillate innsetting av mikroinjeksjon nålen ved hjelp av mikromanipulator. Merk: leire vil stabilisere egg under mikroinjeksjon, og i løpet av inkuberingen i trinn 4.11.
- Trekk to glass kapillær mikroinjeksjon nåler. Sløv en som stikker et hull inn i egget på den markerte stedet. Klargjør andre mikroinjeksjon nål for injeksjon av returlast den med mineralolje og setter det inn i microinjector.
- Sett volumet på løsning utgitt per injeksjon til 59,8 nl på microinjector.
- Laste mikroinjeksjon nål med 10 mM lager Edu løsning.
- Lag et hull i skallet på det markerte stedet med avstumpet glass capillary, ta vare å ikke knuse skallet eller slippe biter av skallet inn i egget hulrom. Orientere egg, slik at hullet er i 45 ° vinkel, slik at mikroinjeksjon nål som skal settes inn direkte gjennom hulrommet til eggeplomme eller embryo.
- Ved hjelp av mikromanipulator, setter dulastet nålen omtrent 1,0 cm inn i hulrommet.
- Injisere ønsket mengde av Edu løsningen direkte på utvikling av embryo eller eggeplomme. Merk: Maksimalt 478 nl av Edu kan injiseres uten at det resulterer i embryonale død.
- Umiddelbart vikle egget og leire holder med flere lag med plastfolie for å dekke egg og parabolen for å hindre uttørking av embryo under inkubasjon. Tape kantene av plastfolie til bunnen av skålen for å hindre at plasten fra pakker opp under inkubering. Merk: plastfolie bør bare fjernes umiddelbart før disseksjon.
- Tillat den nylig prolifererende celler til å innlemme edu ved inkubering av egg ved 37 ° C inntil det ønskede stadium er nådd. Etter injeksjon, ikke returnerer egg å vippe hyller i kuvøse. Legg plast-innpakket leire foret rett på stabilt underlag inne i inkubatoren.
- Fjern plastfolie og dissekere embryoet etter den nevnte protokoll.Fest embryo i 4% PFA og inkuberes 12 timer ved 4 ° C som beskrevet ovenfor. Etter fiksering, vaskes med 100% etanol (EtOH) i 5 min og lagre i friskt 100% EtOH ved -20 ° C inntil videre analyse.
5. Edu "Klikk" Reaction Protocol
Følgende trinn er alle utført i glassflasker.
- Rehydrere embryoer med påfølgende 5 min vasker av følgende:
- EtOH, 75% EtOH og 25% sterilt avionisert destillert (SDD) vann, 50% EtOH og 50% sdd vann, 25% EtOH og 75% 1X Ptw, 100% 1X Ptw
- Vask tre ganger i 100% 1X PTW for 10 min hver.
- Fortynn reaksjonsbuffer additiv (Kit Komponent F) ved å kombinere en del av 10X lagerbufferløsning (10 ul) til 9 deler sdd vann (90 mL).
- Forbered reaksjonsblandingen i et separat rør ved å blande følgende: 875 ul 1X PBS, 20 ul CuSO 4, 5 pl azid, 100 ul fortynnede reaksjonsbuffer additiv.Merk: Volum av reaksjonsblandingen kan bli skalert ned. Reaksjonen vil fungere dersom embryoet er helt dekket i reaksjonsblandingen. Til den fortynnede reaksjonsbuffer additiv (trinn 5.3) umiddelbart før bruk. Alle etterfølgende trinn utføres i mørket. Dekk embryoene med folie for å beskytte mot lys.
- Dekk til ampuller med aluminiumsfolie, og inkuber dem vertikalt ved værelsetemperatur i to timer ved å plassere dem i en styrofoam stativ festet til en nutator.
- Vask embryoene tre ganger i frisk 1X PBS i 10 minutter hver.
- Inkuber embryoene i frisk 4% PFA natten ved 4 ° C.
- Vask tre ganger i 1X PBS i 10 min hver og lagre i frisk 1X PBS ved 4 ° C. Dekk embryoene med folie inntil videre analyse.
Representative Results
Trinnene vist skjematisk i figur 1 indikerer fremkomsten av embryoet mens festet til vitelline membran (A) og viser den riktige fremgangsmåten for å separere embryoet fra eggeplomme (B). Embryoet kan identifiseres ved den sone av veikryss, som er mye lettere enn vitelline membran. Embryoet seg selv er ofte vanskelig å skille inntil plomme er skåret bort. Når embryoet blir dissekert fra egg, kan den være fast, eller flash-frosset for senere bruk. Ved en in situ-hybridisering er planlagt for dissekert embryo, er det nødvendig å fjerne vitelline membran som er festet til embryoet via sonen av krysset. Figur 2 illustrerer den forbedrede synligheten av embryoet når denne membranen er fjernet (C), og den riktige måten å skrelle vitelline membran (A, B). Etter disseksjon og fiksering, hele montering in situ hybridisering ble utført som vist i figur 3 (A, A ', B, B') Og Figur 4 (A, A', B, B '), og fig 5 (A, B, C) for å detektere forskjeller i orthodenticle homeobox 2 (Otx2) ekspresjon i embryoer utviklingsmessig er utsatt for lave doser av metylkvikksølv. Figur 5 viser forstand probe resultater, viser mangel på bakgrunn. I figur 4, til tross for at dissekert fra egg samtidig punkt, embryoet developmentally utsatt for metylkvikksølv (MeHg) utviklet seg til stadiet 5 22 (B, B '), mens kontrollgruppen embryoet utvikles til trinn 6. 22 (A, A '). Gruppen av embryoer dissekert og vist i figur 4, ble oppsamlet fra redet og tatt fra inkubatoren på samme tid. Selv om noen naturlig variasjon er tilstede i utvikling, basert på tidligere disseksjon data, er det lite sannsynlig at temperatursvingninger i inkubatoren ville føre bare 2,4 ppm metylkvikksølv embryoer å være utvikledepmentally forsinket. Forskjellene i etapper indikerer endringer i celle spredning i embryoer utviklingshemmede utsatt for metylkvikksølv.
Før disseksjon ble EDU injisert i en dag 2 egg og inkuberes over natten. Etter disseksjon og fiksering av scenen 16 22 embryo, ble EDU visualisert ved hjelp av "klikk" kjemi, slik at påvisning av prolifererende celler som vist på figur 6 (A, B, C). Det er viktig å nøye overvåke tidspunkter når du plasserer eggene i kuvøse og under disseksjoner, som eksponering for metylkvikksølv eller utfører edu analysen kan forstyrre utviklings progresjon. Den tidligste injeksjon ble utført på dag 0, som var den dagen av samlingen som angitt i trinn 1.3. Dette embryo ble dissekert ca 38 timer senere (stadium 7 22). Overlevelse ble funnet å være omtrent 90% (samme hastighet som kontroll-embryoer) så lenge som injeksjons mengden var under 478 nl.
22 embryoer, ble et RNA-ekstraksjon utført i henhold til produsentens protokoll uten optimering er nødvendig, som vist i Figur 7.. Fjerningen av vitelline membranen var unødvendig for RNA-ekstraksjon og senere QRT-PCR-applikasjoner.
Merk: Alle embryo tall er orientert slik at de fremre og bakre områder er på toppen og bunnen av bildene, respektivt.
Figur 1. Prosedyre for å finne og dissekere sebra finch embryoer, iscenesetter 1-10 22. Finn embryo av bølgende eggeplomme til svak hvit disk er tydelig (A). Straksembryo er plassert i sentrum av eggeplomme, blir eggeplomme dissekert på en trinnvis måte (B), hvor det første kuttet avlaster trykket av vitelline membranen (1) og etterfølgende kutt (2) avgrenser den sone av kobling (zj) som ligger holdt vitelline membran. Scale barer representerer en mm.
Figur 2. Fjerning av vitelline membran og synlighet av embryonale strukturer. Etter fjerning av embryo fra eggeplomme, place embryo i en petriskål inneholdende 4% PFA. Ved en in situ-hybridisering som må utføres, er synligheten av embryonale strukturer essensielle og kan oppnås ved å fjerne vitelline membran (A). Grip vitelline membran med ekstra fin tippet tang og forsiktig skrelle den bort fra embryo ved håndtering av embryo direkte på den ytterste kanten, om nødvendig(B). Vitelline membran fjerning øker klarheten i embryonale strukturer, og tillater embryoer som skal avbildes eller behandlet med in situ-hybridisering (C). Scale barer representerer en mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Whole mount in situ hybridisering utføres på sebra finch embryoer utviklingshemmede utsatt for metylkvikksølv. Expression mønstre orthodenticle homeobox 2 (Otx2) ble karakterisert i embryoer eksponert for 0,0 ppm metylkvikksølv (A, A ') og 2,4 ppm metylkvikksølv (B, B ') via foreldre kosthold. Den gjørRsal (A) og ventral (A ') ekspresjon av Otx2 er synlig gjennom midthjernen og optiske vesikler under fasen 12 22. behandlingsgruppen embryoer ble dissekert på samme tidspunkt, men ble utviklingsmessig forsinket som vist i dorsal (B) og ventral (B ') syn på hodet strukturer, som er karakteristisk for scenen 11 22 Forkortelser:. mb, midthjernen; op, optisk vesikkel. Scale barer representerer en mm.
Figur 4 Whole mount. in situ hybridisering utført på sebra finch embryoer utviklingshemmede utsatt for metylkvikksølv. Expression mønstre orthodenticle homeobox 2 (Otx2) ble karakterisert i stadium 6 22 Embry os eksponert for 0,0 ppm metylkvikksølv (A, A ') og trinn 5 22 embryoer eksponert til 2,4 ppm metylkvikksølv (B, B') via foreldre diett. Forkortelser: AM, fremre margin av mesoderm; nei, ryggstreng, notochord mesoderm; po, proamnion, anterior blastopore; ps, primitive streak 22. Scale barer representerer en mm.
Figur 5. Whole mount in situ hybridisering utført på sebra finch embryoer ved hjelp av fornuft probe. (A) Stage 5 22 embryo. (B) Tidlig stadium 6 22 embryo. (C) Stage 11 22 embryo. Scale barer representerer en mm.
6 "src =" / files/ftp_upload/51596/51596fig6highres.jpg "/>
Figur 6. Edu innlemmelse og de beskyttelse i sebra finch embryoer. Edu "klikk" kjemi ble brukt til å detektere prolifererende celler i en scene 16 22 embryo (A, B, C). Edu er innlemmet i DNA i stedet for tymidin 26, 27 og blir detektert ved hjelp av klikk-kjemi 27. Spredning er klart synlig i sidekantene av de somites, og tailbud. Panel A viser spredning forekommer utelukkende i den bakre av embryoet og viser individuelle proliferative celler også. Panel B viser den proliferative steder i hele embryoet. Panel C viser det fremre område, og viser den meget proliferative telencephalon (te) i større detalj. Forkortelser: af, fostervann fold; FLB, forbena knopp; HLB, bakben knopp; le, linse vesikkel; ms, mesencephalon; mt, Metencephalon; opc, optic cup; pa, svelget bue; sm, somitt mesoderm; tb, tailbud; te, telencephalon. Scale barer representerer en mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Quality of RNA ekstrahert fra dissekert Sebrafink embryoer. Kontroll (0,0 ppm), og 1,2 ppm metylkvikksølv embryoer ble dissekert og flash-frosset som beskrevet i trinn 3.8. Hvert kjørefelt viser RNA hentet fra to homogeniserte embryoer fra hver behandlingsgruppe.
Discussion
Nyere utvikling av en embryological iscenesettelse guide 22 og genom annotering gjør sebra finch en ønskelig modellorganisme for utviklingsstudier. Men den lille størrelsen og skjørhet av sebra finch embryo, som spenner fra 3 til 7 mm i etapper 1 - kan 10 22, gjør disseksjoner vanskelig 11, 14. Isere og rent fjerne embryoer fra overflaten av eggeplomme kan være utfordrende. Denne protokollen gir tilstrekkelig detalj for å utføre prosedyren med letthet. Denne protokollen demonstrerer de kritiske trinnene som ikke er vanligvis kjent, men er nødvendig for å sikre en vellykket disseksjon. For eksempel er det viktig å la et lite lag av eggeplomme mellom embryoet og ark av papir veie for å utelukke stikker.
Både identifikasjon og fjerning av embryo kan være vanskelig. For å løse problemer å identifisere embryoet på overflaten av eggeplomme, skinne lys direkte over plomme etter at det harblitt fjernet fra egg, og se på eggeplomme i en 45 ° vinkel for å finne embryo. Når fosteret ligger, kutte plommen på veie papir ta vare å ikke rive fosteret.
Dersom ytterligere bruksområder er tenkelig for anatomiske forskjeller, in situ hybridisering, eller celleproliferasjon assays, er det viktig å fjerne vitelline membranen i trinn 1 - 8 22 for bedre visualisering av strukturer. Hvis opplever problemer når du fjerner eggeplomme eller vitelline membran i tidlige stadier, fikse embryoet i 4% PFA før du vasker den i 1X PBS å redusere embryonale skjørhet. Ved først å fjerne vitelline membranen under disseksjon som beskrevet, strukturer er klart synlige og intakt i Sebrafink embryoer etter å ha utført en in situ-hybridisering.
En begrensning av Edu er at administrasjon av doseringsmengder enn 478 nl fører til embryonale dødsfall. Imidlertid lar det store doserings-område variasjong nivåer av proliferativ celle tagging.
"Klikk" reaksjon som brukes i dette settet er kobber (I)-katalysert-alkyne-Azid-cycloaddition (Cu (I) AAC). I denne spesifikke reaksjon, er en alkynet holdig tymidin analog molekyl (EDU) inkorporert ved aktivt delende celler. Den alkynet gruppe i edu stikker ut fra den spiralformede strukturen av DNA, og detekteres ved eksponering av en azid-molekyl konjugeres til et grønt, fluorescerende molekyl som binder seg til den frie alkynet gruppe. Den grønne fluorescens viser de nylig prolifererende celler i embryo. Den bio-ortogonalitet av azid og alkynet grupper forhindrer ikke-spesifikk farging, fordi disse reaktive arter ikke er naturlig tilstede i organismene. Også fordi DNA behøver ikke å være denaturert for at reaksjonen skal skje, kan ytterligere DNA-avhengig-analyse være lett utføres 27.
En iboende begrensning med denne metoden er den lille størrelsen og fragility av sebra finch embryoer. Fjerne vitelline membran av embryoer iscenesetter 1 - 15 22 kan føre til skadelige embryonale strukturer hvis ikke utført med forsiktighet. Men, forenkler denne protokollen disseksjon metoden, slik at etterforskerne å bruke tidlige embryonale stadier å undersøke strukturelle anomalier og genuttrykk som ikke tidligere er blitt studert i dybden. Denne protokollen åpner for en mengde cellulære-molekylære analyser som vil tillate etterforskerne å bestemme utviklings opprinnelsen til voksen fenotyper. For eksempel vil det være mulig å undersøke genuttrykk innblandet i vokal læring under ulike miljøforhold eller etter farmakologisk behandling ved de tidligste stadiene av utviklingen 28, 29,30,31. Selv om det ikke er påvist i denne papir, denne metoden potensielt åpner for andre prosedyrer som for eksempel radioaktivt i situ hybridisering på sebra finch vevssnitt og elektroporering / i ovo kirurgi 32, 33,34. Gitt at sebra finch er etablert som en viktig modellorganisme i en enorm mengde litteratur, slike studier gir uutnyttede muligheter for å knytte utviklingsmekanismer med voksen fysiologi og atferd, spesielt utviklingen av språket 7, 9.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker sine finansieringskilder, Howard Hughes Medical Institute Graduate Science Education Program til College of William and Mary; Grant sponsor: NIH (MSS); Grant Nummer: R15NS067566. De erkjenner også støtte fra College of William and Mary, Institutt for biologi og College of Arts and Sciences for å få hjelp med dyr omsorg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken egg incubator | We use a Picture Window Hova-Bator Incubator, Circulated Air Model | ||
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging kit | Invitrogen | C10337 | Detection of cell proliferation. |
| Dissection microscope | We use Olympus SZ61 | ||
| 7'' Drummond capillary for Nanoject II injector | Drummond | 3-00-203-G/X | |
| Drummond Nanoject II microinjector | Drummond | ||
| Dumont Tweezers #55 | World Precision Instruments | 14099 | |
| Ethanol (EtOH) | |||
| 50 ml Falcon tube (polypropylene) | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| FastPrep Lysis Matrix H tubes | MP biomedicals | 6917-100 | Used for RNA extraction, used to homogenize embryos |
| Fiber optic illuminator lamps (High Intensity Illuminator) | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite MI-150 | |
| Glass vials with screw cap (DEPC treated) | Fisher Scientific | 03-338A | |
| Microcentrifuge eppe tube (1.5 ml) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M-8410 | |
| Modeling Clay | Any brand | ||
| Narshige PB-7 needle puller | Narshige | ||
| Omni Bead Ruptor Homogenizer | OMNI International | 19-010 | Used for RNA extraction |
| 4% Paraformaldehyde (4% PFA): 20 ml 8% PFA (32 g paraformaldehyde, 350 ml sdd H2O, adjust pH to 7.6, 400 ml sdd H2O), 20 ml 2x PBS | Fixation of embryos. Caution, is harmful and do not inhale. | ||
| Phosphate buffered saline (1x PBS): 200 ml 10x PBS, 1,800 ml Barnstead H2O, adjust pH to 7.4 | |||
| Phosphate buffered saline (10x PBS): 800 ml Barnstead, 2.013 g KCL, 80.063 g NaCl, 2.722 g KH2PO4 monobasic, 14.196 g Na2HPO4 dibasic, 200 ml Barnstead H2O, adjust pH to 6.5 | |||
| Phosphate buffered saline with 0.1% Tween-20 (1x PTw): 1,800 ml Barnstead H2O, 200 ml 10x PBS, adjust pH to 7.4, 2 ml Tween-20 | |||
| 35 ml Plastic Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| plastic wrap | Any brand | ||
| Prepease RNA Spin Kit | PrepEase, Affymetrix | 78766 1 KT | Used for RNA extraction, used to homogenize embryos |
| Reaction Mix: 875 μl 1xPBS, 100 mM 20 μl CuSO4 (Kit Component E), 5 μl Alexa Fluor 488 azide (Kit Component B), 100 μl diluted reaction buffer additive (Kit Component F) | Invitrogen | C10337 | Detection of cell proliferation. |
| sdd H2O | |||
| Seed cup | We use it as a container when incubating eggs | ||
| Stainless steel scalpel | |||
| Standard nest box | We use Abba Plastic Finch Nestboxes | ||
| 4 ml, Teflon Lined Cap, Glass Vials | Fisher Scientific | 02-912-352 | |
| Transfer pipettes (polyethylene) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| 4 x 4 weigh paper | Fisher Scientific | 09-898-12B |
References
- Eng, M. L., Elliott, J. E., MacDougall-Shackleton, S. A., Letcher, R. J., Williams, T. D. Early exposure to 2,2',4,4',5-pentabromodiphenyl ether (BDE-99) affects mating behavior of zebra finches. Toxicol Sci. 127, 269-276 (2012).
- Winter, V., Elliott, J. E., Letcher, R. J., Williams, T. D. Validation of an egg-injection method for embryotoxicity studies in a small, model songbird, the zebra finch (Taeniopygia guttata). Chemosphere. 90, 125-131 (2013).
- Maney, D. L., Goodson, J. L.
- Kirn, J. R. The relationship of neurogenesis and growth of brain regions to song learning. Brain and Language. 115, 29-44 (2010).
- Fisher, S. E., Scharff, C. FOXP2 as a molecular window into speech and language. Trends in Genetics. 25, 166-167 (2009).
- Tokarev, K., Tiunova, A., Scharff, C., Anokhin, K. Food for Song: Expression of C-Fos and ZENK in the Zebra Finch Song Nuclei during Food Aversion Learning. PLoS One. 6, (2011).
- Vargha-Khadem, F., Gadian, D. G., Copp, A., Mishkin, M. FOXP2 and the neuroanatomy of speech and language. Nat Rev Neurosci. 6, 131-138 (2005).
- Schulz, S. B., Haesler, S., Scharff, C., Rochefort, C. Knockdown of FoxP2 alters spine density in Area X of the zebra finch. Genes, Brain and Behavior. 9, 732-740 (2010).
- Jarvis, E. D., et al. Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution. Nat Rev Neurosci. 6, 151-159 (2005).
- Brainard, M. S., Doupe, A. J. Translating birdsong: songbirds as a model for basic applied medical research. Annu Rev Neurosci. 36, 489-517 (2013).
- Mayer, U., Watanabe, S., Bischof, H. J. Spatial memory and the avian hippocampus: Research in zebra finches. J Physiol Paris. , (2012).
- Warren, W. C., et al.
- Agate, R. J., Scott, B., Haripal, B., Lois, C., Nottebohm, F. Transgenic songbirds offer an opportunity to develop a genetic model for vocal learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17963-17967 (2009).
- Birkhead, T. R., et al. Internal incubation and early hatching in brood parasitic birds. Proceedings of the Royal Society Biological Sciences. 278, 1019-1024 (2011).
- Haesler, S., et al. FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners. J Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).
- Godsave, S. F., Lohmann, R., Vloet, R. P. M., Gahr, M. Androgen receptors in the embryonic zebra finch hindbrain suggest a function for maternal androgens in perihatchingsurvival. Journal of Comparative Neurology. 453, 57-70 (2002).
- Stern, C. D. The chick; a great model system becomes even greater. Dev Cell. 8, 9-17 (2005).
- Kuenzel, W. J., Medina, L., Csillag, A., Perkel, D. J., Reiner, A. The avian subpallium: new insights into structural and functional subdivisions occupying the lateral subpallial wall and their embryological origins. Brain Research. 1424, 67-101 (2011).
- Tickle, C. The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development. Mech Dev. 121, 1019-1029 (2004).
- Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development. Neural Development. 7, (2012).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenet Genome Research. 117, 231-239 (2007).
- Murray, J. R., Varian-Ramos, C. W., Welch, Z. S., Saha, M. S. Embryological staging of the zebra finch, Taeniopygia guttata. J Morphol. , (2013).
- Hawkins, P., Morton, D. B., Cameron, D., Cuthill, I., Francis, R., Freire, R., Gosler, A., Healy, S., Hudson, A., Inglis, I., Jones, A., Kirkwood, J., Lawton, M., Monaghan, P., Sherwin, C., Townsend, P. Laboratory birds: refinements in husbandry and procedures. Fifth report of BVAAWF/FRAME /RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement. Lab Anim. , (2001).
- Pearse II, R. V., Esshaki, D., Tabin, C. J., Murray, M. M. Genome-wide expression analysis of intra- and extraarticular connective tissue. Journal of Orthopaedic Research. 27, 427-434 (2009).
- Pizard, A., et al. Whole-mount in situ hybridization and detection of RNAs in vertebrate embryos and isolated organs. Current Protocols in Molecular Biology. 66, (2004).
- Warren, M., Puskarczyk, K., Chapman, S. C. Chick embryo proliferation studies using EdUlabeling. Developmental Dynamics. 238, 944-949 (2009).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA syntesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 105, 2415-2420 (2008).
- Hoogesteijn, A. L., DeVoogd, T. J., Quimby, F. W., De Caprio, T., Kollias, G. V. Reproductive impairment in zebra finches (Taeinopygia guttata). Environmental Toxicology and Chemistry. 24, 219-223 (2005).
- Winter, V., Williams, T. D., Elliott, J. E. A three-generational study of In ovo exposure to PBDE-99 in the zebra finch. Environmental Toxicology and Chemistry. 32, 562-568 (2013).
- Kitulagodage, M., Buttemer, W. A., Astheimer, L. B. Adverse effects of fipronil on avian reproduction and development: maternal transfer of fipronil to eggs in zebra finch Taeinopygia guttata and in ovo exposure in chickens Gallus domesticus. Ecotoxicology. 20, 653-660 (2011).
- Hallinger, K. K., Zabransky, D. J., Kazmer, K. A., Cristol, D. A. Birdsong differs between mercury-polluted and reference sites. The Auk. 127, 156-161 (2010).
- Chen, C. C., Wada, K., Jarvis, E. D. Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. Interspecies Avian Brain Chimeras Reveal That Large Brain Size Differences Are Influenced by Cell–Interdependent Processes. PLoS One. 7, (2012).
- Chen, C. C., Winkler, C. M., Pfenning, A. R., Jarvis, E. D. Molecular profiling of the developing avian telencephalon: Regional timing and brain subdivision continuities. The Journal of Comparative Neurology. 521, 3666-3701 (2013).
