Abstract
التصاق خلية خلية هو الأساسي في الحياة متعددة الخلايا وبوساطة مجموعة متنوعة من بروتينات سطح الخلية. ومع ذلك، يتم مفهومة التفاعلات لاصقة لكثير من هذه البروتينات. هنا نقدم طريقة بسيطة وسريعة لوصف خصائص لاصقة من المفترضة مقتصر على المطابق جزيئات التصاق الخلية. و transfected خلايا HEK293 مثقف مع بلازميد الحمض النووي ترميز يفرز،، حاتمة الموسومة ectodomain من بروتين سطح الخلية. باستخدام الخرز بين functionalized محددة للعلامة حاتمة، يتم التقاط القابلة للذوبان، انصهار بروتين يفرز من مستنبت. ويمكن بعد ذلك حبات المغلفة استخدامها مباشرة في حبة المقايسات التجميع أو في حبة الفلورسنت فرز فحوصات لاختبار التصاق مقتصر على المطابق. إذا رغبت، الطفرات يمكن بعد ذلك أن تستخدم لتوضيح الأحماض الأمينية المحددة أو المجالات المطلوبة للالتصاق. هذا الاختبار يتطلب سوى كميات صغيرة من البروتين المعبر عنها، لا يتطلب إنتاج خطوط الخلايا مستقرة، ويمكن عكاmplished في 4 أيام.
Introduction
التصاق خلية خلية ضروري لتطوير وسلامة الكائنات متعددة الخلايا وبوساطة مجموعة متنوعة من جزيئات سطح الخلية. وقد تم تحديد العديد من هذه جزيئات الالتصاق ويتميز، رغم أن الكثيرين لا يزال يتعين اكتشافها. وتستخدم عدة طرق لتحقيق خصائص خلية التصاق جزيئات (الحدب)، بما في ذلك الخلايا فرز فحوصات، فحوصات تجميع خلية 1-8 والأساليب الفيزيائية الحيوية، مثل مجهر القوة الذرية والسطحية قوة التحليل الطيفي 9-12.
تعقيد حتى مبسطة في أنظمة المختبر باستخدام خطوط الخلايا يجعل من الصعب تحديد خصائص لاصقة من المفترض CAM. عادة، يعتبر جزيء وCAM إذا كان يدفع تجميع الخلايا عندما transfected في خط خلية غير لاصقة. ومع ذلك، فمن الواضح أن هذا ليس دليل مباشر على النشاط اصقة. على سبيل المثال، وتسهيل إيصال سطح الخلية أو استقرارسوف CAM يؤدي أيضا إلى زيادة تجميع خلية 1،13. وعلاوة على ذلك، قد تفشل CAM صحيح للتوسط تجميع خلية إذا كان خط الخلية تفتقر العوامل المشتركة الأخرى المطلوبة للتسليم سطح الخلية أو الاستقرار.
لتجنب هذه العوامل المعقدة، والمزيد من المقايسات المباشرة يمكن استخدامها التي تستند على فكرة أن التفاعلات لاصقة يجب أن تكون خاصية البيوكيميائية الجوهرية المجال خارج الخلية. بينما الخرز المستخدمة في البداية لوصف NG-CAM 2، وقد تم تمديد هذه المقايسات من أجل التحقيق بوساطة كادهيرين التصاق 12،14،15. باستخدام الانصهار من C-كادهيرين اندماج ectodomain-FC، أظهر مختبر Gumbiner أن يكرر كادهيرين متعددة تساهم في التفاعلات مقتصر على المطابق 14. عن طريق مقارنة المقايسات حبة التجميع، E-كادهيرين وN-كادهيرين التصاق كما تم يتميز 12،15، وكذلك عدد من protocadherins 1،15-18 والإسوية Dscam من ذبابة الفاكهة
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. خلية إعداد (اليوم -2 إلى 0)
- انقسام خلايا HEK293 1: 5 باستخدام 0.05٪ التربسين-EDTA الحل واحتضان وسائل الإعلام في النمو عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 حتى 60-80٪ متموجة (2 - 3 أيام). لكل حالة، وخلايا الثقافة في 2 × 100 ملم الأطباق.
2. ترنسفكأيشن الخلية (يوم 1)
- بالنقل خلايا HEK293 مع ترميز البلازميد FC-الانصهار باستخدام كاشف ترنسفكأيشن مثل Lipofectamine. كما يمكن استخدام طرق بديلة تؤدي إلى الكفاءة ترنسفكأيشن مماثلة.
- العودة الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة.
3. خلية الانتشار (اليوم 2)
- وسائط النمو سخن دون مصل بقري جنيني (-FBS) إلى 37 درجة مئوية.
- شطف الأطباق 2X مع 10 مل نمو وسائل الإعلام -FBS، والعودة الأطباق إلى الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- شطف الأطباق الثقافات واحد المزيد من الوقت مع 10 مل نمو وسائل الإعلام -FBS، أي ما مجموعه 3 يغسل.
- Incuباتي الخلايا HEK293 transfected عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة أخرى دون FBS قبل جمع سائل الإعلام.
4. الخرزة تجميع (اليوم 4)
- لجمع وسائل الاعلام من الأطباق الثقافة، ونقل وسائل الاعلام من كل زوج من الأطباق إلى 50 مل أنابيب مخروطية وتدور في 500 x ج لمدة 5 دقائق لتكوير الحطام الخلوي.
- فلتر وسائل الاعلام من 50 مل أنبوب مخروطي إلى تصفية الطرد المركزي باستخدام حقنة 30 مل و 0.45 ميكرون فلتر حقنة.
- تدور مرشحات الطرد المركزي في 4000 x ج و 4 درجات مئوية حتى حجم سائل الإعلام والثقافة المركزة حوالي 500 ميكرولتر (حوالي 15 دقيقة). كرر حتى تمت إضافة كافة وسائل الإعلام والثقافة، وتتركز.
- إضافة 1.5 ميكرولتر من بروتين G حبات مغناطيسية إلى 1 مل من الجليد الباردة الاحتياطي ملزم في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل لكل عينة، ومكان على المغناطيس وإزالة العازلة. على الفور إضافة وسائل الإعلام الثقافة المركزة للبروتين G حبات المغناطيسي.
- تدوير أنابيب في 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
- ررأنابيب الآس على المغناطيس وإزالة وسائل الإعلام. تغسل حبات بسرعة مرتين مع الجليد الباردة 1 مل الاحتياطي ملزم، وresuspend ثم الخرز في 300 ميكرولتر الاحتياطي ملزم.
- سبليت معلق حبات في 2 أنابيب، 150 ميكرولتر إلى كل أنبوب، ثم قم بإضافة 1.5 ميكرولتر من 200 مم CaCl 2 أو 200 ملي EDTA ل "الكالسيوم" والشروط "لا الكالسيوم"، على التوالي.
- نقل 100 ميكرولتر من كل حالة إلى الاكتئاب الشريحة بشكل جيد وجمع الميكروسكوب باستخدام مجهر الضوء المرسل (الشكل 2). جمع الصور من 5 حقول نظر لكل تجربة في كل نقطة زمنية المطلوب.
تحليل البيانات 5.
- باستخدام يماغيج، أو يعادل برنامج تحليل الصور، وفتح واحدة من مجموعات البيانات باستخدام صورة خمس استيراد / صورة تسلسل ... من القائمة المنسدلة ملف. سيتم فتح هذه باعتبارها كومة الصورة.
- في الصور / ... خصائص مربع الحوار، تغيير طوحدات بركه إلى بكسل ووضع العرض بكسل والارتفاع إلى 1.0 بكسل.
- تحويل الصور إلى ثنائي باستخدام ضبط / عتبة ... الأمر في القائمة المنسدلة صورة. تعيين عتبة لتشمل بكسل التي تساهم في حبة الخرز أو المجاميع، ولكن تستبعد الخلفية والجسيمات الصغيرة. تنطبق على جميع الصور في المكدس.
- في مربع الحوار القياسات مجموعة، حدد المربعات منطقة والمكدس الموقع.
- تشغيل تحليل الجسيمات ... في تحليل القائمة المنسدلة. هذا سوف إنشاء قائمة من الجسيمات التي تم تحديدها، بما في ذلك حجمها (منطقة) والصورة التي تم تحديدها.
- كرر هذه العملية التي تجربة وحالة تجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتقدم تجربة سبيل المثال في الشكل 2، مما يدل تعتمد على الكالسيوم حبة تجميع من قبل ectodomain من N-كادهيرين تنصهر لجنة التيسير (NcadEC-FC). في غياب الكالسيوم، والخرز تظهر نزعة ضئيلة أو معدومة لتجميع وليس هناك زيادة في الحجم الكلي مع الزمن (الشكل 1A، C). في وجود الكالسيوم، وحبات مغلفة مع عرض NcadEC-FC تجميع قوية، مع الحجم الكلي يتزايد مع مرور الوقت (الشكل 1B، C). وتكررت هذه التجربة ثلاث مرات، مع كل حالة تتكون من الصور من خمسة حقول غير متداخلة. تم تحديد حجم الجسيمات في منطقة بكسل لكل مجموع المباراتين في المجالات الخمسة. وبلغ متوسط هذه البيانات لكل نقطة في الوقت في كل تجربة. وبلغ متوسط البيانات من ثلاث تجارب لتحديد الوسائل والأخطاء المعيارية للقياس في كل نقطة زمنية (الشكل 2C).
1762 / 51762fig1highres.jpg "/>
الرقم 1. استخدام يفرز، ectodomains الموسومة حاتمة في المقايسات حبة التجميع. (A) تخطيطي يبين تنظيم نموذجي، تمرير واحد جزيء التصاق الخلايا عبر الغشاء (أعلى)، والتي لديها تسلسل إشارة (S)، وهو ectodomain، مجال الغشاء (T) ومجال الخلايا (ICD). لإنشاء نموذج يفرز من ectodomain، وهي القطعة التي تفتقر إلى وتنصهر في المنطقة التيسير للمفتش الإنسان (القاع). (B) عندما transfected في الخلايا المستزرعة عبر الغشاء والمجالات داخل الخلايا، يتم التعبير عن الانصهار ectomain-FC ويفرز في مستنبت، حيث يمكن التقاط وتنقيته على البروتين أو بروتين G حبات المغناطيسي. وتظهر البروتين A أو G البروتين والدوائر السوداء على الخرز. (C) بعد الغسيل، ويسمح حبات مغناطيسية ectodomain-FC المغلفة لتجميع، واختبار التفاعلات لاصقة مقتصر على المطابق.ig1highres.jpg "الهدف =" _ على بياض "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 2. حبة تجميع الفحص. (A) وcadherins الكلاسيكية، مثل N-كادهيرين وE-كادهيرين، التوسط تعتمد على الكالسيوم والتصاق مقتصر على المطابق. في غياب الكالسيوم (لا يضاف الكالسيوم و 2 ملي EDTA)، تفشل cadherins للتوسط التفاعلات لاصقة. يظهر هنا هو صورة من البروتين G حبات المغناطيسي المغلفة مع ectodomain من الزرد N-كادهيرين تنصهر لجنة التيسير (NcadEC-FC). سمح (B) NcadEC-FC حبات المغلفة لتجميع لمدة 1 ساعة في وجود 2 مم CaCl 2. التصاق مقتصر على المطابق قبل ectodomains N-كادهيرين هو واضح من تشكيل المجاميع حبة كبيرة. (C) وكإجراء شبه الكمية للالتصاق، ويمكن قياس حجم الركام. طريقة واحدة لتحقيق ذلك هو قياس المنطقة التي تحتلهاالمجاميع واضحة في الصور الضوئية المرسلة. حجم متوسط مساحة إجمالية يمكن رسم بوصفها وظيفة من الزمن، كما هو موضح هنا، أو يمكن حساب نسبة متوسط المساحة الإجمالية في وجود أو عدم وجود الكالسيوم. تم تحديد تجميع NcadEC-FC حبات المغلفة في وجود الكالسيوم (الدوائر المغلقة) وفي حالة عدم وجود الكالسيوم (الدوائر المفتوحة) في 15 دقيقة على مدار فترات من 1 ساعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التصاق الخلية هو سمة أساسية من سمات الحياة متعددة الخلايا وبوساطة مجموعة واسعة من بروتينات سطح الخلية. من هذه، وفهم الخصائص التفصيلية لاصقة سوى نسبة صغيرة نسبيا. هنا، التي وصفناها بروتوكول بسيطة وسريعة للتحقيق في قدرة لاصقة مقتصر على المطابق من ectodomains يفرز تنصهر علامة حاتمة مريحة. هذا النهج لديه عدد من المزايا الهامة. أولا، وخطوط الخلايا مستقرة غير مطلوب 14،20، كما يمكن توليد كميات كافية من البروتين عن طريق ترنسفكأيشن عابرة من 100 ملم الأطباق. وهذا يسمح للفحص أعداد أكبر من بنيات - على سبيل المثال، نقطة أو الحذف المسوخ - دون جهد ونفقة توليد والحفاظ على أعداد كبيرة من خطوط الخلايا. ثانيا، هذه المقايسات حبة هي الاختبارات المباشرة للخصائص الكيميائية الحيوية من جزيئات الالتصاق المفترضة في نظام انخفاض. لذا، التصاق يمكن أن تعزى مباشرة إلى بروتينقيد التحقيق، بدلا من الآثار غير المباشرة المحتملة. ثالثا، للتحقيق في آثار العوامل المشترك الممكنة، خلايا يمكن أن يشترك transfected مع أشكال يفرز من جزيء التصاق المفترض والمفترض المشارك عامل لها، ولكل منها علامة حاتمة متميزة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذا النهج هو مرن، ويمكن تكييفها للاستخدام مع مجموعة متنوعة من العلامات حاتمة المناسبة. على سبيل المثال، هي حبات مغناطيسية موحد الحجم المتاحة التي مترافق إلى البروتين A أو G (FC علامة)، Streptavidin (بكتيريا علامة II)، الجلوتاثيون (علامة GST)، أو TALON أو ني: NTA (6X صاحب العلامة). أخيرا، وتوافر الخرز الفلورسنت يسمح نفس البروتوكول ليتم تكييفها لفحوصات الفرز بسيطة للتحقيق خصوصية مقتصر على المطابق. في هذا السيناريو، الأحمر والأخضر الخرز الفلورسنت، المغلفة مع كل CAM متميزة، يتم خلط ويتم تقييم درجة اختلاط أو الفصل.
على الرغم من هذه المزايا، هناك أيضا المحاذير. أولا، شظايا البروتين على حبات في حل لاألخص تعقيد الوضع في الجسم الحي. الخلايا الفردية تعبر عن يكمل محددة للبروتينات سطح الخلية والمؤثرات الخاصة داخل الخلايا. كل هذه قد يكون لها آثار إما مباشرة أو غير مباشرة على التصاق، وكثير من هذه الآثار لن تنعكس في المقايسات حبة. على سبيل المثال، جزيء قد توسط قوي، التصاق غيروي (وهو CAM)، ولكن لن لحث التجميع حبة في هذه المقايسات. ثانيا، المقايسات حبة ليست سوى نصف الكمية ولا توفر موثوق بها، معلومات كمية عن القوة النسبية للتفاعلات لاصقة. أخيرا، كل من الجزيئات التي حققنا فيها هي من النوع الأول، تمرير واحد بروتينات الغشاء الذي موجود على واحد، ببتيد متجاورة المجال لاصقة. ومن المرجح أن العديد من الحدب يمكن أن تكون متعددة تمرير البروتينات عبر الغشاء أن يكون واجهة لاصقة بنيت من المناطق ectodomain متعددة. أن هذا الاختبار لا تكون قابلة للتكيف بسهولة لمثل هذه الجزيئات.
FOالمقايسات ص حبة لتكون موثوقة، تحتاج إلى أن تكون الظروف استنساخه. هناك نوعان من المصادر المحتملة للتقلبات في هذه المقايسات. الأول هو التغير في مستويات البروتين. إذا كان هناك تباين في مستويات التعبير، وذلك بسبب الاختلاف في كفاءة ترنسفكأيشن أو بروتين أعرب سيئة، قد لا تكون مشبعة الخرز وقد تكون النتائج غير موثوق بها. تطبيقات مسبقة التجميع حبة تستخدم كمية محددة من البروتين النقي ectodomain الانصهار. عادة، يتم تنقية هذا البروتين الانصهار في دفعات كبيرة من خطوط الخلايا مستقرة، ويمكن استخدامها في تجارب متعددة. وكمية من الخرز المستخدمة في كل تجربة وكمية البروتين المطلوبة هي صغيرة جدا، يمكن تحقيق استنساخ للمقارنة مع ترنسفكأيشن عابر. حبات مغناطيسية التي نستخدمها لديها قدرة ملزمة من ~ 250 نانوغرام / L من الخرز معلق. وترنسفكأيشن نموذجي 2 × 100 ملم أطباق النتائج في وجود فائض كبير من البروتين، والتي يمكن التحقق منها مع خطوة ملزمة الثانوية، وذلك باستخدام السوبرnatant بعد الربط الأولي من البروتين الانصهار إلى الخرز. مصدر محتمل الثاني من التباين هو كمية من الخرز المستخدمة. يتم توفير حبات مغناطيسية التي نستخدمها و30 ملغ / مل الطين الذي يستقر بسرعة. للاستنساخ، يجب معلق حبات تماما وحجم ذات الصلة استخراج بسرعة، قبل أن تبدأ حبات لتسوية. بديل واحد هو قبل تمييع كمية محددة من الخرز في حجم أكبر. هذه الخرز المخفف قبل ويمكن أن يضاف في حجم أكبر (15 L بدلا من 1.5 L) لتجنب الأخطاء pipetting ل. إذا لم تتخذ الرعاية المناسبة، سيكون هناك تقلبات التجربة إلى التجربة في كمية من الخرز المستخدمة. وهذا يمكن أن يؤثر على معدل التجميع، مما يؤدي إلى اختلافات في الحجم الكلي في وقت محدد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pFc-N1 plasmid | Addgene | To be submitted | |
| HEK293 cells | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| DMEM | Mediatech - Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| 100x Pen-Strep (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668030 | |
| Dynabeads – Protein G | Life Technologies | 10003D | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3294 | |
| Depression slides | Electron Microscopy Sciences | 71878-06 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC901024 | |
| 0.45 mm syringe filter | Sarstedt | 83.1826 | |
| Dynamag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Fiji (ImageJ) Image Analysis Software | http://fiji.sc/Fiji | ||
| Table of Buffers/Solutions | |||
| Growth Media | DMEM + 10% FBS + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4 °C. | |
| Growth Media –FBS | DMEM + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4 °C. | |
| Binding Buffer | 50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0.2% BSA | Vortex until dissolved, keep on ice. | |
References
- Chen, X., Gumbiner, B. M. Paraxial protocadherin mediates cell sorting and tissue morphogenesis by regulating C-cadherin adhesion activity. J. Cell Biol. 174 (2), 301-313 (2006).
- Grumet, M., Friedlander, D. R., Edelman, G. M. Evidence for the binding of Ng-CAM to laminin. Cell Adhes. Commun. 1 (2), 177-190 (1993).
- Hatta, K., Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. Cloning and expression of cDNA encoding a neural calcium-dependent cell adhesion molecule: its identity in the cadherin gene family. J. Cell Biol. 106 (3), 873-881 (1988).
- Hirano, S., Nose, A., Hatta, K., Kawakami, A., Takeichi, M. Calcium-dependent cell-cell adhesion molecules (cadherins): subclass specificities and possible involvement of actin bundles. J. Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2501-2510 (1987).
- Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. Expressed recombinant cadherins mediate cell sorting in model systems. Cell. 54 (7), 993-1001 (1988).
- Nose, A., Takeichi, M. A novel cadherin cell adhesion molecule: its expression patterns associated with implantation and organogenesis of mouse embryos. J. Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2649-2658 (1986).
- Schreiner, D., Weiner, J. A. Combinatorial homophilic interaction between gamma-protocadherin multimers greatly expands the molecular diversity of cell adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (33), 14893-14898 (2010).
- Takeichi, M. Functional correlation between cell adhesive properties and some cell surface proteins. J. Cell Biol. 75, 464-474 (1977).
- Sivasankar, S., Brieher, W., Lavrik, N., Gumbiner, B., Leckband, D. Direct molecular force measurements of multiple adhesive interactions between cadherin ectodomains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (21), 11820-11824 (1999).
- Sivasankar, S., Gumbiner, B., Leckband, D. Direct measurements of multiple adhesive alignments and unbinding trajectories between cadherin extracellular domains. Biophys. J. 80, 1758-1768 (2001).
- Sivasankar, S., Zhang, Y., Nelson, W. J., Chu, S. Characterizing the initial encounter complex in cadherin adhesion. Structure. 17 (8), 1075-1081 (2009).
- Zhang, Y., Sivasankar, S., Nelson, W. J., Chu, S. Resolving cadherin interactions and binding cooperativity at the single-molecule level. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (1), 109-114 (2009).
- Yasuda, S., et al. Activity-induced protocadherin arcadlin regulates dendritic spine number by triggering N-cadherin endocytosis via TAO2beta and p38 MAP kinases. Neuron. 56 (3), 456-471 (2007).
- Chappuis-Flament, S., Wong, E., Hicks, L. D., Kay, C. M., Gumbiner, B. M. Multiple cadherin extracellular repeats mediate homophilic binding and adhesion. J. Cell Biol. 154 (1), 231-243 (2001).
- Emond, M. R., Biswas, S., Blevins, C. J., Jontes, J. D. A complex of Protocadherin-19 and N-cadherin mediates a novel mechanism of cell adhesion. J. Cell Biol. 195 (7), 1115-1121 (2011).
- Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. The clustered protocadherins Pcdhalpha and Pcdhgamma form a heteromeric complex in zebrafish. Neuroscience. 219, 280-289 (2012).
- Blevins, C. J., Emond, M. R., Biswas, S., Jontes, J. D. Differential expression, alternative splicing, and adhesive properties of the zebrafish delta1-protocadherins. Neuroscience. 199, 523-534 (2011).
- Morishita, H., et al. Structure of the cadherin-related neuronal receptor/protocadherin-alpha first extracellular cadherin domain reveals diversity across cadherin families. J. Biol. Chem. 281, 33650-33663 (1074).
- Wojtowicz, W. M., Flanagan, J. J., Millard, S. S., Zipursky, S. L., Clemens, J. C. Alternative splicing of Drosophila Dscam generates axon guidance receptors that exhibit isoform-specific homophilic binding. Cell. 118 (5), 619-633 (2004).
- Drees, F., Reilein, A., Nelson, W. J. Cell-adhesion assays: fabrication of an E-cadherin substratum and isolation of lateral and Basal membrane patches. Methods Mol. Biol. 294, 303-320 (2005).
