Introduction
أمراض العضلات والعظام تؤثر على الملايين من الناس في الولايات المتحدة وعواقب وخيمة الحاضر على النظم الصحية الوطنية والمحلية 1. وتتميز هذه الاضطرابات بسبب فقدان العظام وظيفة مشتركة التي تتطلب معالجة مكثفة وفترات طويلة من الانتعاش. عادة، زيادة نسبية في عدد و / أو نشاط الخلايا الآكلة، وخلايا متخصصة ليرتشف العظام، في ترقق العظام والتهاب المفاصل لوحظ 2. في ظل الظروف الفسيولوجية وينظم عدد ونشاط الخلايا الآكلة بواسطة مستقبلات عامل منشط النووية κ-B يجند (RANKL)، الذي تنتجه الخلايا بانية العظم. Osteoprotegerin (OPG)، وينتج مستقبلات شرك لRANKL أيضا بانيات 3 في الجسم الحي النماذج الحيوانية التي تنطوي من overexpression النظامية من sRANKL، أو حذف OPG هي قيمة للغاية في مجال البحوث هشاشة العظام.؛ ومع ذلك، وهذه الأساليب تتطلب جيل من الفئران المعدلة وراثيا 4،5. هنا، بديل الروايةيوصف أسلوب overexpressing sRANKL لدراسة الاضطرابات المرتبطة العضلات والعظام. على وجه التحديد، واستخدمت minicircle (MC) تكنولوجيا الحمض النووي وطرق التسليم الهيدروديناميكية لتحقيق نقل الجينات من sRANKL في الجسم الحي وoverexpress الماوس sRANKL جهازيا 6.
هذا الأسلوب هو أيضا مكملة للأخرى في الجسم الحي نماذج من ترقق العظام، مثل التشكيل الهرمونية من الآكلة التالية استئصال المبيض 7 والتدخل الغذائي من خلال اتباع نظام غذائي منخفض الكالسيوم 8. هذه النماذج هي مفيدة جدا لدراسة جوانب مختلفة من الاضطرابات العضلية الهيكلية ذات الصلة إلا أنها تتطلب عمليات جراحية ويمكن أن يستغرق فترة تصل الى عدة أشهر، بتكلفة كبيرة 9. مستأصلة المبيض (وفك) نموذج القوارض هو نموذج على حيوانات التجارب حيث إزالة المبايض يؤدي إلى نقص هرمون الاستروجين بعد سن اليأس وهشاشة العظام وبالتالي محاكاة الإنسان 10. الإنسان بهشاشة العظام بعد انقطاع الطمث، شرط فيها هرمون الاستروجين deficiency يؤدي إلى زيادة خطر كسور العظام وهشاشة العظام يؤثر على ما يقرب من ثمانية ملايين امرأة في الولايات المتحدة وحدها. على الرغم من أن نموذج وفك مفيد لهشاشة العظام بعد انقطاع الطمث أنه يوفر مزايا محدودة في دراسة هشاشة العظام بشكل عام. الاستروجين يمنع فقدان العظام، عن طريق حفز ناقضة العظم وتثبيط بناء العظم موت الخلايا المبرمج، وبالتالي في غيابها لوحظ زيادة النشاط ناقضة العظم 10-12. ويلاحظ وجود RANKL-OPG نسبة الخلل الذي يفضل ارتشاف العظام أيضا 13. ومع ذلك، ويرافق نقص هرمون الاستروجين في الجسم الحي أيضا من انخفاض مستويات عامل النمو تحويل β (TGF β)، وزيادة انترلوكين 7 (IL-7) وTNF، IL-1 و IL-6 14،15. لأن هذه السيتوكينات قد عرفت وظائف تغييري إعادة تشكيل العظام مستقلة عن المسار RANKL، فإنه من المستحيل أن ينسب أي تفعيل ناقضة العظم فقط إلى المحور RANKL رتبة. نموذج صفها في هذه الورقة تمكن الباحثون للدراسة في فيفس محور RANKL رتبة في osteoclastogenesis وفقدان العظام دون السيتوكينات الموالية للالتهابات مقارنة نماذج القوارض وفك.
بالإضافة إلى ذلك، في المختبر تقنيات osteoclastogenesis هي أدوات أساسية لدراسة تفعيل ناقضة العظم لعلاج العلاجية المحتملة للأمراض العضلات والعظام. وقد أظهرت الدراسات السابقة أيضا أن زراعة نخاع العظم الضامة الماوس المستمدة (BMMs) مع الماوس بلعم مستعمرة عامل تحفيز (M-CSF) والماوس sRANKL يمكن أن تؤدي إلى التمايز ناقضة العظم 3،16،17. هنا، يتم وصف البروتوكولات لتوليد الخلايا ناقضة العظم مثل الماوس متعددة النوى من نخاع العظم وكذلك من الخلايا المحيطية وحيدات النوى الإنسان الدم (PBMCs) في المختبر 18. كما وصفها بإيجاز المقايسات خلية مقرها المطلوبة لتحديد ناقضة العظم متباينة عضال وتعمل بكامل طاقتها ناضجة. هذه في المختبر تقنيات تكمل الرواية في الجسم الحي والنهج معا بمثابة عأدوات التحقيق owerful لدراسة التمايز ناقضة العظم والتنشيط. باستخدام هذه الأنظمة، والعلماء قادرون على توليد الخلايا الآكلة في الجسم الحي في المختبر وتحديد المحفزات والإشارات اللازمة لانتشارها وتفعيل وكذلك اختبار فعالية مثبطات الدوائية والبيولوجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. التسليم هيدرودينامي من sRANKL MC الحمض النووي
- توصيل ماوس الهيدروديناميكية عبر الوريد الذيل
- وزن الماوس قبل حقن الوريد الذيل. تمييع sRANKL أو بروتين الفلورية الخضراء (GFP) MC في حل رينغر (قبل دافئ عند 37 درجة مئوية) في إجمالي حجم ~ 10٪ من وزن جسم الفأر.
- الاحماء الماوس في قفص لمدة 10 دقيقة قبل الحقن وذلك لتمدد الأوعية الدموية والأوردة جعل الجانبي (لفس) مرئية. رصد الماوس بعناية لتجنب الجفاف وارتفاع الحرارة.
- حالما يتم المتوسعة لفس ومرئية، ونقل الماوس إلى كابح وتضاف المكونات بعيدا بما فيه الكفاية في برميل لكبح جماح الحركة. رصد الماوس للنشاط العادي مثل التنفس. ضبط المكونات من كابح إذا لزم الأمر.
- تطهير منطقة الحقن 3/4 من غيض من الذيل مع الكحول مسح. استخدام إبرة G 27-30 للماوس حقن الوريد الذيل. عقد ذيل بحزم مع يد واحدة وادخال الإبرة فيإلى الوريد الذيل. الضغط على حقنة واستكمال الحقن داخل 5-7 ثانية.
- إزالة الإبرة من الوريد الذيل والضغط مع كرة القطن على موقع الحقن لوقف النزيف. رصد الماوس ل15-30 دقيقة، ثم نقل الماوس مرة أخرى إلى الحظيرة مرة واحدة يتم خفض معدل التنفس إلى المعدل العادي.
- تأكيد الجهازية ماوس sRANKL التعبير والكمي لنقل ماوس سيروم TRACP5b آخر الجينات
- الاحماء الماوس في قفص لمدة 5-10 دقيقة من أجل تمدد الأوعية الدموية وجعل لفس مرئية. رصد الماوس بعناية لتجنب الجفاف وارتفاع الحرارة.
- إجراء شق صغير بشفرة إلى ذيل الماوس، في موقع واحد عليها من طرف الذيل.
- جمع ما يقرب من 100 ميكرولتر من الدم في أنابيب فصل المصل.
- احتضان أنابيب فصل المصل في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- عينات الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 5 دقائق وجمع المصل. ستورمصل الإلكترونية في -80 درجة مئوية لمزيد من التحليل.
- أداء sRANKL ELISA والماوس TRACP5b المصل فحص على عينات المصل باستخدام طقم التجارية المتاحة.
2. في المختبر الجيل ناقضة العظم من ماوس BMMs
- العزلة والتثقيف من BMMs
- العزلة من الساق وعظم الفخذ العظام: الموت ببطء الماوس المانحة مع CO 2، وتطهير الساقين مع الايثانول 70٪. تشريح من عظم العانة حتى العظم العقبي، لإزالة عظم الفخذ والظنبوب عظام سليمة.
- إزالة الجلد والعضلات بعناية دون الإضرار العظام. وضع عظم الفخذ والساق معالجة العظام في طبق بتري تحتوي على الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
- إزالة نخاع العظم: قطع قبالة الطرف على جانب واحد من عظم الفخذ والساق وعظام طرد نخاع العظام في أنبوب 50 مل باستخدام حقنة 1ML مع 25 G إبرة، محملة α-MEM تحتوي على 1٪ البنسلين / الستربتوميسين (ناقضة العظم الثقافة متوسطة / OCM).
- ثقافة الضامة
- عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو خلية مكافحة التلقائي.
- لوحة 1 × 10 6 خلايا لكل بئر لوحة 6 جيدا أو 3 × 10 5 خلايا إلى coverslips الزجاج (5 ملم) أو شرائح عاج وضعها في لوحة 96 جيدا واحتضان عند 37 درجة مئوية.
- نضح كل وسائل الإعلام التي تحتوي على الخلايا غير ملتصقة واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع OCM الطازجة (+) التي تحتوي على 25 نانوغرام / مل الماوس M-CSF لمدة 48 ساعة.
- نضح جميع وسائل الإعلام واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع OCM الطازجة (+) وسائل الإعلام التي تحتوي على 25 نانوغرام / مل الماوس M-CSF، و 30 الماوس نانوغرام / مل sRANKL لبدء osteoclastogenesis. تجديد وسائل الاعلام كل 3 أيام كما هو مطلوب.
- تنمو الخلايالحوالي 6-8 أيام لتشكيل خلايا متعددة النووية العملاقة قادرة على resorbing العظام. حالما تظهر خلايا متعددة النوى، نفذ فخ (طرطرات الفوسفاتيز الحمضي مقاومة) تلطيخ استخدام عدة التجارية المتاحة، وعندما نضجت تماما، نفذ المقايسات الفنية. تصور حلقات F-الأكتين coverslips على استخدام وصمة عار phalloidin وصورة تعلق على الخلايا عاج شرائح بواسطة المجهر الإلكتروني (SEM) كما هو موضح سابقا 19.
3. في المختبر الجيل ناقضة العظم من PBMCs الإنسان
- عزل PBMCs الإنسان
- إضافة 10 مل من قبل تحسنت Histopaque-1077 في أنبوب 50 مل.
- فارغة تصفية الكريات البيض التي تم الحصول عليها من بنك الدم مع برنامج تلفزيوني العقيمة في أنبوب 50 مل (نسبة 1:1 من الدم مع PBS). طبقة الدم المخفف على حل histopaque ببطء شديد، والتأكد من أن الدم لا يمتزج مع histopaque.
- عينات الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 20 دقيقة في 18 درجة مئوية. تابعالطرد المركزي جي، عزل بعناية طبقة معطف الشهباء البيضاء التي تحتوي على خلايا الدم البيضاء ونقل إلى أنبوب جديد 50 مل.
- تمييع الخلايا مع برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 650 x ج لمدة 5 دقائق لجمع الخلايا.
- إزالة طاف والخلايا resuspend في OCM (-) وسائل الإعلام وعدد الخلايا باستخدام عداد الخلية.
- الطلاء وزراعة PBMCs
- resuspend الخلايا في OCM (+) وسائل الإعلام وصفيحة 8 × 10 6 خلية / مل لكل بئر في لوحة 6 جيدا أو 1 × 10 6 خلية / مل لكل بئر في لوحة 96 جيدا. خلايا لوحة على coverslips الزجاج (5 ملم) كما هو مطلوب للتصوير المناعي فضلا عن شرائح العظام مناسبة لفحوصات ارتشاف العظم كما هو موضح سابقا 20.
- التغيير سائل الإعلام والثقافة، وتجديد الخلايا مع الإنسان M-CSF كل 2-3 أيام أو حسب الحاجة. ثم انتقل إلى الخطوة التمايز في يوم 5 عن طريق إضافة 30 نانوغرام / مل من sRANKL الإنسان جنبا إلى جنب مع 25 نانوغرام / مل الإنسان M-CSF في OCM (+) وسائل الإعلام لبدء osteoclastogenesهو.
- تنمو الخلايا لحوالي 14 إلى 21 يوما لتشكيل خلايا متعددة النووية العملاقة. حالما تظهر خلايا متعددة النوى، ويمكن بعد ذلك أن هذه الخلايا مرقوم للشرك، وعندما نضجت تماما، المقايسات الفنية لا يمكن أن يؤديها. يمكن تصور حلقات F-الأكتين coverslips على استخدام phalloidin صمة عار. يمكن فحص مورفولوجيا الخلايا في الخلايا تعلق على عاج شرائح بواسطة SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هنا، توصف تقنية نقل الجينات الرواية لتمايز الخلايا الآكلة في الجسم الحي والبروتوكولات الثقافة خلية للتمييز بين الخلايا الآكلة في السلائف في المختبر كوسيلة لدراسة آثار السيتوكينات على osteoclastogenesis. في الشكل 1، وأظهرت نتائج ممثل نقل الجينات الناجح لGFP والماوس sRANKL MC في الفئران. في الشكل 2، وتظهر الصور ممثل الماوس نخاع العظم أو الإنسان PBMC تمايز الخلايا دوام الثقافات من الخلايا الآكلة تمهيدا لجانب مشرق المجهري الميدان. الشكل 3، وتظهر الصور ممثل من ثلاث طرق مستقلة لوصف الماوس نخاع العظام المستمدة الآكلة . وجود الماوس sRANKL ينشط التعبير عن فخ (أرقام 3A وباء) وتشكيل حلقات F-الأكتين (أرقام 3C وD). مسح كهربائيترون المجهر (SEM) يكشف عن أن الماوس sRANKL الحث على تكوين خلايا عملاقة قادرة على resorbing العظام (أرقام 3E وF). الشكل 4، وأساليب توصيف نفسه على PBMC حقوق الإنسان مستمد تظهر الخلايا الآكلة.
الشكل 1. sRANKL في الجسم الحي تحويل الجينات يؤدي إلى زيادة osteoclastogenesis. عرض الأمامي من A، B) الماوس إإكسبلنتس الكبد وC، D) وصور الجسم كله لمدة 12 أسبوعا من العمر C57BL / 6 الفئران الذكور حقنوا 5 ميكروغرام من GFP أو sRANKL MC الحمض النووي. السهم يشير التعبير GFP في الجسم الحي في نقل الجينات GFP الماوس. الفئران نقل الجينات بمثابة RANKL لا مضان الخلفية. الصور التي تم التقاطها بواسطة مايسترو 2 تصوير، ليوم واحد آخر تحويل الجينات (الأحمر والأخضر دخلفية enote وGFP، على التوالي). خريطة E) البلازميد من sRANKL بناء MC-DNA وF) مستوى sRANKL في المصل تحليلها في 1 و 5 و 11 آخر أيام GFP أو sRANKL نقل الجينات. G) الفأر مستوى TRACP5b مصل تحليل 11 يوما بعد GFP أو sRANKL نقل الجينات. أشرطة النطاق تشير إلى 5 مم في A، B، و 10 ملم في C، D.
الرقم 2. في المختبر osteoclastogenesis في كل من الفأر وأنظمة زراعة الخلايا البشرية. المجهر مشرق الميدان من خلايا فأر المعزولة من نخاع العظم والمثقف في وجود 25 نانوغرام / مل الماوس M-CSF و 30 الماوس نانوغرام / مل sRANKL يظهر التمايز بالطبع الوقت في الأيام A)، 2 ب) 5، وC) 8. المجهر مشرق الميدان من الخلايا البشرية معزولةمن الدم المحيطي والمثقف في وجود 25 نانوغرام / مل الإنسان M-CSF و 30 نانوغرام / مل sRANKL الإنسان يدل على دوام التمايز في أيام D)، 4 E) 14، وجمعة) 21. أشرطة النطاق تشير إلى 20 ميكرون.
الرقم 3. جيل وتوصيف الخلايا الآكلة الماوس. تلطيخ فخ (الوردي) من خلايا فأر معزولة عن نخاع العظام وتربيتها لمدة 6 أيام بحضور أ) 25 نانوغرام / مل الماوس M-CSF أو B) الماوس 25 نانوغرام / مل M -CSF و 30 الماوس نانوغرام / مل sRANKL. Phalloidin (الخضراء) ودابي (الأزرق) تلطيخ من خلايا فأر معزولة عن نخاع العظام وتربيتها لمدة 8 أيام في حضور C) 25 نانوغرام / مل الماوس M-CSF أو D) 25 نانوغرام / مل الماوس M-CSF و 30 نانوغرام / مل الماوس sRANKL يظهر تشكيل فاحلقة ctin في خلايا متعددة النوى. photomicrographs SEM من خلايا فأر معزولة عن نخاع العظام وتربيتها لمدة 8 أيام في حضور E) 25 نانوغرام / مل الماوس M-CSF أو F) 25 نانوغرام / مل الماوس M-CSF و 30 نانوغرام / مل الماوس sRANKL يظهر تشكيل المناطق ارتشاف على العظام كما يتبين من السهام. أشرطة النطاق تشير إلى 40 ميكرون في ميلادي، و 30 ميكرومتر في E، F.
الشكل 4. جيل وتوصيف الخلايا الآكلة الإنسان. تلطيخ فخ (الوردي) من الخلايا البشرية المعزولة من PBMCs وتربيتها لمدة 15 يوما في وجود A) 25 نانوغرام / مل الإنسان M-CSF أو B) 25 نانوغرام / مل الإنسان M- CSF و 30 نانوغرام / مل sRANKL الإنسان. Phalloidin (الخضراء) ودابي (الأزرق) تلطيخ الخلايا البشرية المعزولة من PBMC وتربيتها لمدة 19 يوما في وجود C) D) 25 نانوغرام / مل الإنسان M-CSF و 30 نانوغرام / مل يظهر sRANKL الإنسان تشكيل حلقات F-الأكتين في الخلايا متعددة النوى. photomicrographs SEM من الخلايا البشرية المعزولة من PBMC وتربيتها لمدة 18 يوما في حضور E) 25 نانوغرام / مل الإنسان M-CSF أو F) 25 نانوغرام / مل الإنسان M-CSF و 30 نانوغرام / مل يظهر sRANKL الإنسان تشكيل ارتشاف المناطق على العظام كما يتبين من السهام. أشرطة النطاق تشير 10 ميكرومتر في A، B، 20 ميكرومتر في C، D 15 ميكرومتر في E، F.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ظروف العضلات والعظام تقود أسباب الاعتلال والعجز وتتألف من أكثر من 150 من الأمراض والمتلازمات؛ التي تؤثر على ما يقرب من 90 مليون أميركي اليوم. التهاب المفاصل وتدمير العظام هي السمات الغالبة من الحالات العضلية الهيكلية، بما في ذلك التهاب المفاصل وهشاشة العظام. هشاشة العظام هو شرط أن يضعف سلامة العظام، وغالبا ما تؤدي إلى كسور في العظام. التهاب المفاصل هو مرض مزمن، المنهكة مرض يتميز التهاب في المفاصل التي تصبح متورمة، والعطاء وتقييد الحركة الطبيعية شديدة ويمكن أن تؤدي إلى الإعاقة. على الرغم من أن المرضية للأمراض العضلات والعظام يختلف كثيرا عن بعضها البعض، وتدمير العظام هو سمة مشتركة شاملة. ويتسبب تدمير العظام في ظروف العضلات والعظام في المقام الأول من اختلال التوازن بين ارتشاف العظام وتكوين العظام 21،22. نهج واحد العلاجية هو محاولة لمنع قدرة هذه الخلايا لتدمير العظام
في الجسم الحي نموذج الموصوفة هنا يستخدم minicircles، والتي هي ناقلات صغيرة episomal الحمض النووي (~ 4KB) تحررت من العمود الفقري البكتيرية، والتي أيضا بمثابة ناقلات التحوير 24. Minicircles التعبير عن الجينات المحورة 10-1،000 أعلى أضعاف ثم البلازميدات البكتيرية طبيعية مع تعبير مستقرة لمدة تصل إلى عدة أشهر. حجم أصغر الجزيئية من minicircles يساهم في معدل ترنسفكأيشن أكثر كفاءة والتعبير كبيرة مقارنة البلازميدات البكتيرية العادية 24. لذلك، يتم الآن تطبيق على نطاق واسع في الدراسات minicircles نقل الجينات ما قبل السريرية 25،26. تسليم الهيدروديناميكية هي طريقة متطورة تقوم على الضغط الهيدروديناميكية في الشعيرات الدموية لتسليم الحمض النووي البلازميد في الجسم كله على فأرة الحاسوب. إيصال الجينات إلى خلايا الكبد الهيدروديناميكية عبر حقن الوريد الذيل في الفئران هو ر راسخةس تعبير عن التحوير بواسطة الحمض النووي البلازميد 6. في هذه الدراسات، overexpressing الماوس sRANKL في الجسم الحي في نموذج الفأر يتحقق من خلال sRANKL MC والتسليم الهيدروديناميكية عبر الذيل حقن الوريد. الماوس sRANKL ELISA يمكن استخدامها للكشف عن مستويات المصل RANKL في الفئران. لوحظ ارتفاع كبير في الماوس TRACP5b المصل، علامة ارتشاف العظم 27، في sRANKL الفئران نقل الجينات. والجدير بالذكر أن هذه التقنية لا تقتصر على overexpression من sRANKL؛ فإنه يمكن أيضا أن تطبق كذلك على overexpress البروتينات الأخرى يفرز 28. صعوبة التقنية الرئيسية في هذا الإجراء هو تسليم الهيدروديناميكية عبر الوريد الذيل. وبصرف النظر عن العادية حقن الوريد الذيل، والتسليم الهيدروديناميكية يتطلب تسليم minicircles في كميات كبيرة من محلول الفسيولوجية في الفئران ضمن 5-7 ثانية. وبالتالي، التعامل مع تقنيات الحقن وثابتة ضرورية لتحقيق النجاح مع هذا الإجراء. توليد الفئران المعدلة وراثيا sRANKL هو نهج آخر في الجسم الحي osteoclastogenesis. ومع ذلك، على مستوى عال من sRANKL يمكن أن يؤدي إلى الفتك الجنينية 4 وتوليد الفئران المعدلة وراثيا هي أيضا مكلفة وتستغرق وقتا طويلا.
في نموذج القوارض وفك، سواء السيتوكينات الالتهابية مثل TNF، IL-1 و IL-6 وsRANKL خلوى غير التهابية في الجسم الحي المساهمة في osteoclastogenesis وفقدان العظام. sRANKL نموذج نقل الجينات يؤدي إلى overexpression من فقط خلوى sRANKL غير التهابية. وبالتالي، فإن نموذج نقل الجينات sRANKL الموصوفة هنا يقدم الباحثون أداة قوية لدراسة مساهمة محور RANKL رتبة في إعادة تشكيل العظام في غياب الالتهاب.
طريقة الثقافة ناقضة العظم في المختبر، والذي ينطوي على التعاون زراعة خلايا نخاع العظام والخلايا بانية العظم، وقد تم تأسيسها في أواخر 1980s قبل اكتشاف RANKL في أواخر عام 1990 في 29،30. المؤتلف M-CSF وRANKL لحث على التمايز ناقضة العظم بكفاءة في المختبر لالأسلوب الثاني تم وصفها سابقا في دراسات أخرى 3،31. ومن المعروف M-CSF لتحفيز مراتب التعبير في السلائف ناقضة العظم في وقت مبكر و32 ليكون بمثابة عامل البقاء على قيد الحياة لالسلائف ناقضة العظم والخلايا الآكلة ناضجة 33. RANKL أمر ضروري لتمايز ناقضة العظم والتنشيط 3. هنا، يتم وصف أسلوب في المختبر osteoclastogenesis. زراعة ناجحة وتمايز الخلايا الآكلة تتطلب تمهيدا لعزل الخلايا العقيمة وتقنيات الطلاء المناسب فضلا عن فهم دقيق للخلية الحصاد في الوقت المناسب. الطلاء حساب الخلايا أمر بالغ الأهمية لأن التمايز ناقضة العظم يتطلب اندماج الخلايا ناقضة العظم وسوف السلائف 34 عدد كاف من خلايا السلائف ناقضة العظم لا تسهل اندماج وتمايز الخلايا السلائف في الخلايا الآكلة. وبالمثل، فإن عددا من الخلايا الزائدة السلائف ناقضة العظم، ويؤدي إلى تشكيل تتجمع وموت الخلايا في نهاية المطاف. إزالة غيرالخلايا الملتصقة-2 ساعة بعد طلاء الخلايا يمكن أن تساعد في الحفاظ على عدد الخلايا الأمثل. أخيرا، وقت الحصاد خلية أمر بالغ الأهمية كما الآكلة هي الخلايا عضال لم يدم طويلا متباينة مع عمر ما يقرب من 48 ساعة 35. وبالتالي، ينبغي أن تحصد الخلايا في غضون 48 ساعة بعد الملاحظة الأولى من خلايا متعددة النوى. ويمكن بعد ذلك تتميز هذه الخلايا عن طريق فخ وF-الأكتين تلطيخ بواسطة المناعية والعظام يمكن أن يتم الكشف عن النشاط ارتشاف عن طريق المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM). تمكين هذه الطرق التجريبية تعريف واضح للالآكلة من حيث النمط الظاهري وظيفة.
في الجسم الحي وفي المختبر التقنيات الموصوفة هنا سيسهل تطوير مثبطات ناقضة العظم حاليا في الدراسات ما قبل السريرية، مما يؤدي إلى استراتيجيات علاجية فعالة لملايين من هشاشة العظام والتهاب المفاصل المرضى في جميع أنحاء العالم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alpha-MEM | Life Technologies | 12561-056 | |
| Human M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-096-492 | |
| Mouse M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-094-643 | |
| Human RANK-Ligand - soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-631 | |
| Mouse RANK-Ligand - soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-076 | |
| Tailveiner Restrainer for mice | Braintree | TV-150 STD | |
| Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit | R&D systems | MTR00 | |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma | 387A | |
| MouseTRAP assay | immunodiagnostic systems | SB-TR103 |
References
- Yelin, E. Cost of musculoskeletal diseases: impact of work disability and functional decline. The Journal of rheumatology. Supplement. 68, 8-11 (2003).
- Boyce, B. F., Rosenberg, E., de Papp, A. E., Duong le, T. The osteoclast, bone remodelling and treatment of metabolic bone disease. European journal of clinical investigation. 42, 1332-1341 (2012).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, 165-176 (1998).
- Mizuno, A., et al. Transgenic mice overexpressing soluble osteoclast differentiation factor (sODF) exhibit severe osteoporosis. Journal of bone and mineral metabolism. 20, 337-344 (2002).
- Bucay, N., et al. osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification. Gene., & development. 12, 1260-1268 (1998).
- Suda, T., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 15, 2063-2069 (2007).
- Wronski, T. J., Dann, L. M., Scott, K. S., Cintron, M. Long-term effects of ovariectomy and aging on the rat skeleton. Calcified tissue international. 45, 360-366 (1989).
- Seto, H., Aoki, K., Kasugai, S., Ohya, K. Trabecular bone turnover, bone marrow cell development, and gene expression of bone matrix proteins after low calcium feeding in rats. Bone. 25, 687-695 (1999).
- Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research. Comparative medicine. 58, 424-430 (2008).
- Sherman, B. M., West, J. H., Korenman, S. G. The menopausal transition: analysis of LH, FSH, estradiol, and progesterone concentrations during menstrual cycles of older women. The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 42, 629-636 (1976).
- Hughes, D. E., et al. Estrogen promotes apoptosis of murine osteoclasts mediated by TGF-beta. Nature medicine. 2, 1132-1136 (1996).
- Kousteni, S., et al. Nongenotropic, sex-nonspecific signaling through the estrogen or androgen receptors: dissociation from transcriptional activity. Cell. 104, 719-730 (2001).
- Ominsky, M. S., et al. RANKL inhibition with osteoprotegerin increases bone strength by improving cortical and trabecular bone architecture in ovariectomized rats. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 23, 672-682 (2008).
- Kitazawa, R., Kimble, R. B., Vannice, J. L., Kung, V. T., Pacifici, R. Interleukin-1 receptor antagonist and tumor necrosis factor binding protein decrease osteoclast formation and bone resorption in ovariectomized mice. The Journal of clinical investigation. 94, 2397-2406 (1994).
- Weitzmann, M. N., Pacifici, R. Estrogen deficiency and bone loss: an inflammatory tale. The Journal of clinical investigation. 116, 1186-1194 (2006).
- Suda, T., Nakamura, I., Jimi, E., Takahashi, N.
- Asagiri, M., Takayanagi, H. The molecular understanding of osteoclast differentiation. Bone. 40, 251-264 (2007).
- Matsuzaki, K., et al. Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures. Biochemical and biophysical research communications. 246, 199-204 (1998).
- Adamopoulos, I. E., et al. Synovial fluid macrophages are capable of osteoclast formation and resorption. The Journal of pathology. 208, 35-43 (2006).
- Adamopoulos, I. E., et al. Interleukin-17A upregulates receptor activator of NF-kappaB on osteoclast precursors. Arthritis researc., & therapy. 12, (2010).
- Jones, D., Glimcher, L. H., Aliprantis, A. O. Osteoimmunology at the nexus of arthritis, osteoporosis, cancer, and infection. J Clin Invest. 121, 2534-2542 (2011).
- Sato, K., Takayanagi, H. Osteoclasts, rheumatoid arthritis, and osteoimmunology. Curr Opin Rheumatol. 18, 419-426 (2006).
- Das, S., Crockett, J. C. Osteoporosis - a current view of pharmacological prevention and treatment. Drug design, development and therapy. 7, 435-448 (2013).
- Chen, Z. Y., He, C. Y., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 8, 495-500 (2003).
- Kay, M. A., He, C. Y., Chen, Z. Y. A robust system for production of minicircle DNA vectors. Nature biotechnology. 28, 1287-1289 (2010).
- Chen, Z. Y., He, C. Y., Kay, M. A. Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo. Human gene therapy. 16, 126-131 (2005).
- Halleen, J. M., et al. Tartrate-resistant acid phosphatase 5b: a novel serum marker of bone resorption. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 15, 1337-1345 (2000).
- Adamopoulos, I. E., et al. IL-23 is critical for induction of arthritis, osteoclast formation, and maintenance of bone mass. J Immunol. 187, 951-959 (2011).
- Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J.
- Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123, 2600-2602 (1988).
- Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
- Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors. The Journal of experimental medicine. 190, 1741-1754 (1999).
- Fuller, K., et al. Macrophage colony-stimulating factor stimulates survival and chemotactic behavior in isolated osteoclasts. The Journal of experimental medicin. 178, 1733-1744 (1993).
- Edwards, J. R., Mundy, G. R. Advances in osteoclast biology: old findings and new insights from mouse models. Nature reviews. Rheumatology. 7, 235-243 (2011).
- Weinstein, R. S., et al. Promotion of osteoclast survival and antagonism of bisphosphonate-induced osteoclast apoptosis by glucocorticoids. The Journal of clinical investigation. 109, 1041-1048 (2002).
