Introduction
Metodi di rilevamento proteine precisi e rapidi sono molto importanti nella diagnostica medica e della proteomica. Array di proteine rilevamento classici, come biochip, si basano sul "tasto lock-e-" principio di riconoscimento e richiedono recettori specifici come aptameri, anticorpi, o mimetici.
Negli ultimi anni, il rilevamento differenziale ispirato alla olfatto umano e gustation è emerso come alternativa 1. Questo naso elettronico / lingua (/ eT eN) approccio si basa sul legame di analiti ad una serie di recettori cross-reattivi (CRRS), che non hanno bisogno di essere altamente specifico e selettivo per le molecole target differenziale permettere così a superare il laborioso processo di sviluppo di recettori altamente selettivi. È la risposta combinata di tutti i recettori che crea un modello distinto per ogni campione, come un'impronta digitale, permettendo la sua identificazione.
Le due sfide fondamentali per lo sviluppo di elettronic naso / lingua per il rilevamento della proteina efficace sono la produzione di elementi sensibili che hanno la capacità di distinguere tra analiti strutturalmente simili e il sistema di trasduzione appropriata per l'evento vincolante. Fino ad oggi, gli studi hanno riportato vari approcci allo sviluppo di matrice 2. Ad esempio, in uno studio di una identificazione basata su array di proteine è stato sviluppato utilizzando CRRS preparati derivati tetra-carboxyphenylporphyrin accoppiando i gruppi carbossilici ai vari amminoacidi o dipeptidi per fornire recettori differenziali in possesso di un nucleo idrofobico per affinità con le proteine e periferie cariche distinte per impartire differenziale vincolante. Utilizzando questo sistema, diverse proteine e miscele proteiche sono stati identificati mediante misurazione della fluorescenza dei recettori seguito all'interazione con gli analiti 3,4. In un altro studio, una biblioteca di 29 CRRS contenenti tripeptide e frazioni di acido boronici sintetizzato in modo combinatorio su una hexasubstistituito patibolo benzene è stato sviluppato per il rilevamento di proteine con un rilevamento colorimetrico indicatore-assorbimento 5,6. Con un tale disegno, ogni recettore ha mostrato capacità di legame differenziale con le proteine in base alla varianza tra le braccia peptide, e gli acidi boronici assistiti nella differenziazione delle proteine da glicoproteine. Più di recente, una serie composta da diversi cationici funzionalizzati nanoparticelle d'oro coniugati con un poli anionico polimero fluorescente (p-phenyleneethynylene) (PPE) è stato creato per rilevare ed identificare le proteine 7. Il legame concorrenziale tra analiti proteici e bonificato PPE / oro complessi nanoparticelle artificiali fluorescenza, producendo modelli di riconoscimento distinti per le proteine. In questo studio, le interazioni proteina-nanoparticelle funzionalizzate sono stati sintonizzati variando le proprietà fisico-chimiche dei gruppi terminali nanoparticelle. Inoltre, è stato dimostrato che questo approccio è efficace per l'analisi delle proteine in complessi e proteine ricche supporto, adcome siero umano a concentrazioni fisiologicamente rilevanti, mostrando in tal modo il potenziale di eT in profilatura campioni reali per la diagnosi di stati di malattia 8.
Anche se molto promettente, questi sistemi hanno alcune limitazioni intrinseche. Essi richiedono la progettazione e la sintesi di 5-29 CRRS con strutture molto complesse. Inoltre, a differenza del sistema olfattivo che è resettato dopo ciascuna misurazione, rilevamento proteina richiede la preparazione di una matrice per campione. Infine, monitoraggio eventi vincolanti in tempo reale sono estremamente difficili.
In questo contesto, un approccio combinatorio è stato proposto con un piccolo numero di molecole semplici e facilmente accessibili con diverse proprietà fisico-chimiche (idrofili, idrofobici, carica positiva, carica negativa, neutra, ecc.) Come blocchi da costruzione (BBS) 9. Mescolando bbs di variabili e proporzioni controllate e permettendo le miscele di auto-assemblarsi sulla superficie d'oro di unprisma, una vasta gamma di superfici combinatorie che caratterizzano le proprietà appropriate per la proteina di legame è stato creato. In particolare, i monostrati auto-assemblati su questo sistema consentono una facile messa a punto di una serie di proprietà di superficie in modo altamente divergente, consentendo diversi recettori cross-reattivi combinatorie (CoCRRs) per essere prodotta rapido ed efficiente. Rilevamento delle proteine è stata effettuata utilizzando un sistema di rilevamento ottico, risonanza plasmonica di superficie per immagini (SPRI). Brevemente, un ampio fascio monocromatico luce polarizzata da un LED illumina l'intera area matrice CoCRR sulla superficie del prisma. Una videocamera CCD ad alta risoluzione offre immagini di differenza in tempo reale in tutti i punti della matrice CoCRR. Cattura tutte le modifiche locali alla superficie della matrice CoCRR fornire informazioni dettagliate sugli eventi di legame e processi cinetici 10. Nel frattempo, con l'aiuto di software di imaging, immagini SPR corrispondenti a punti vengono convertiti automaticamente alle variazioni di riflettività versus tempo, generando una serie di curve cinetiche di legame chiamato sensorgrams. Così, SPRI permette un'osservazione, sincrono, in parallelo, privo di etichetta e in tempo reale degli eventi vincolanti. Inoltre, la matrice CoCRR ottenuto è rigenerabile e riutilizzabile per analisi delle proteine.
Questo protocollo descrive la costruzione della lingua elettronica utilizzando solo due piccole molecole come blocchi di costruzione e illustra la sua applicazione per l'analisi delle proteine comuni basate su modelli di riconoscimento continui ottenuti con spri.
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Protocol
1 Preparazione di varie soluzioni e proteine Campioni
- Preparare 100 ml di tampone fosfato (PBS-G) contenente 50 mM di NaH 2 PO 4, 50 mM NaCl, e 10% glicerolo a pH 6,8.
- Preparare 250 ml di soluzione tampone HEPES contenente HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, 0,005% di Tween 20 a pH 7,4.
- Preparare la soluzione madre di building block 1 (BB1), lattosio e la costruzione blocco 2 (BB2) solfato lattosio (Figura 1) a 0.2 mM in PBS-G.
- Preparare 1 ml di soluzioni di proteine in HEPES: Un lectine rachide hypogaea (AHL) a 500 nm, la mioglobina a 1 micron, e lisozima a 500 nm.
- Preparare 20 ml di 1% SDS in acqua ultrapura.
2 Preparazione del Array CoCRR
- Pulire la superficie d'oro del prisma 48 ore prima dell'uso con un detergente plasma per 3 min in queste condizioni: 75% ossigeno, 25% di Argon, 0,6 mbar, potenza 40 W.
- Preparare undici SOLUTIO puri e mistins di BB1 e BB2 con [BB1] / ([BB1] + [BB2]) rapporti tra 0 e 100% con incrementi del 10% ad una concentrazione totale di BB di 0,1 mM in PBS-G.
- Cassetta di 8 gocce nl di queste soluzioni puri e misti sulla superficie del prisma con un spotter senza contatto in quadruplice copia per ciascun rapporto con 44 punti in totale (Figura 2).
NOTA: 10% glicerolo aggiunto in PBS-G è molto importante per ridurre l'evaporazione del solvente e la variazione della concentrazione di BB dopo la deposizione. - Posizionare il prisma all'interno di una capsula Petri contenente 1 ml di acqua ultrapura e lasciarlo O / N a RT per l'auto-assemblaggio di BB1 e BB2 sulla superficie di oro. Qui, si ipotizza che la composizione superficiale media nel misto SAM riflette la composizione della soluzione mista di deposizione (Figura 3) 11.
- Lavare accuratamente il prisma con acqua ultrapura e quindi asciugare sotto un flusso di argon.
3. proteine rilevamento da spri
- Impostare il incubator in cui l'apparato SPRI è posto a 25 ° C per evitare variazioni dell'indice di rifrazione indotte da variazioni di temperatura durante il rilevamento di proteine.
- Inserire un prisma non funzionalizzata risciacquo in polietere etere chetone 10 microlitri (PEEK) cella di flusso collegato ad una pompa a siringa controllata dal computer, un sistema di degasaggio e una valvola di iniezione media pressione 6 porte (Figura 4). Compilare il sistema di flusso con appena filtrata e degassificati esecuzione HEPES tampone.
- Rimuovere il prisma risciacquo e inserire il prisma contenente la matrice CoCRR nella cella di flusso. Esegui HEPES a / flusso min 100 ml. Con l'aiuto della camera CCD eliminare eventuali bolle d'aria presenti sulla superficie del prisma passando tampone di corsa rapidamente.
- Definire area di studio per ogni spot disegnando un cerchio con lo stesso diametro per l'area di interesse sulla base di un'immagine ben contrastata, della matrice e con l'aiuto di un software integrato nel sistema di spri.
- Tracciare le curve di plasmoni, che rappresentano rifletterecurve ivity in funzione dell'angolo incidente, per tutti i punti.
- Scegliere l'angolo (posizione in cui verranno registrate le curve cinetiche) che lavorano alla massima pendenza delle curve di riflettività. Ruotare lo specchio di scansione per fissare l'angolo di lavoro selezionato per misure cinetiche.
- Continuare a eseguire HEPES attraverso il sistema di flusso fino a quando il segnale di riflessione per tutti i punti è stabile e costante.
- Iniettare 1 ml di soluzione AHL con una siringa nel loop del campione (500 microlitri) con la valvola di iniezione in posizione "carico". Poi mettere la valvola di iniezione in posizione "iniezione". La portata utilizzata per tutti l'iniezione proteina era di 100 microlitri / min.
- Inizia misure cinetiche monitorando le variazioni di riflettività contro il tempo simultaneamente su tutti i punti.
- Al termine dell'iniezione proteine, sciacquare la matrice con tampone di corsa per 8 min. Infine, iniettare 1 ml di 1% SDS per rigenerarlo.
- Ripetere la stessa procedura per l'altro proteins.
4 Elaborazione dati e analisi
- Dopo l'entrata di soluzione proteica nella cella di flusso, molecolare di legame si verifica e induce uno spostamento delle curve plasmon e una variazione di riflettività. Il software di acquisizione delle immagini converte i valori di intensità luminosa misurata al grigio livelli di scala, dando immagini SPR Figura 5A, e genera la variazione di riflettività in funzione del tempo, dando sensorgrams (Figura 5B).
- Utilizzare un software di calcolo matematico per tracciare la riflettività (R%) alla fine di ogni iniezione proteina contro il [BB1] / ([BB1] + [BB2]) rapporto di generare 2D profilo evoluzione continua (CEP) per ogni campione (Figura 5C).
- Aggiungere il [BB1] / ([BB1] + [BB2]) in rapporto sensorgrams (Figura 5B) per generare 3D continua evoluzione del paesaggio (CEL) per ogni proteina (Figura 5D).
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Representative Results
Per sondare la capacità della lingua elettronica per analisi comune proteine, sono stati usati tre proteine: AHL, mioglobina e lisozima. Per ogni proteina, un profilo distinto 2D continua evoluzione, CEP, è stato generato dal eT, come mostrato nella Figura 6.
Inoltre, grazie alla SPRI, che è in grado di monitorare in tempo reale i adsorbimento e desorbimento cinetica, per ogni proteina un tempo dipendente modello riconoscimento continuo, chiamati 3D continua evoluzione del paesaggio (CEL), è stato generato. Nella Figura 7, sono mostrati CEL caratteristici di queste tre proteine.
Figura 1 strutture chimiche dei due blocchi utilizzati nel presente protocollo per preparare la matrice CoCRR.51901 / 51901fig1highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 Una foto di un prisma dopo aver depositato i 44 gocce delle soluzioni puri e misti di BB1 e BB2 con un non-contatto piezoelettrico spotter con ogni rapporto in quattro esemplari. Il prisma è stato posto accanto ad un tubo Eppendorf da 1,5 ml.
Figura 3 Schema di matrice CoCRR contenente 11 recettori differenziali che sono stati preparati con le soluzioni puri e misti di BB1 e BB2 a vari rapporti e permettendo le miscele di auto-assemblano in sur orofaccia del prisma.
Figura 4 Rappresentazione schematica del sistema di rivelazione SPRI combinato con un sistema di microfluidica.
Figura 5 Schema di trattamento dei dati per la generazione di due tipi di pattern di riconoscimento continuo con sviluppata lingua elettronica: profilo continua evoluzione 2D e 3D continua evoluzione del paesaggio.
Figura 6 Continuous profili evoluzione per tre proteine pure:. AHL (500 nM), mioglobina (1 mM), e lisozima (500 nM) Sono stati generati tracciando la variazione di riflettività (R%) alla fine dell'iniezione proteina contro il [BB1 ] / ([BB1] + [BB2]) rapporto.
Figura 7 Paesaggio del gusto: tipico CEL 3D di AHL, mioglobina e lisozima generato dalla lingua elettronica.
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Discussion
Le fasi più critiche per la costruzione di questa eT sono dedicati per garantire una buona riproducibilità del sistema. Ad esempio, la pulizia della superficie d'oro del prisma con una procedura standardizzata prima dell'uso, aggiungendo il 10% di glicerolo nelle undici soluzioni puri e misti di BB1 e BB2 per eliminare l'evaporazione del solvente durante BB autoassemblante sulla superficie di oro del prisma, depositando più replicati per ogni [BB1] / ([BB1] + [BB2]) rapporto, ecc. Come per il rilevamento delle proteine mediante SPRI, la scelta dell'angolo di lavoro è critico. Di solito, è fissato alla massima pendenza delle curve di riflettività. Inoltre, è molto importante utilizzare condizioni sperimentali standardizzate per ciascun rilevamento di proteine, come la temperatura di lavoro, portata, ecc. Dopo ogni iniezione proteina, l'array CoCRR deve essere rigenerato reimpiegate con una soluzione adeguata che permette la rigenerazione completa del sistema senza danni ai recettori.
e_content "> Per dimostrare che l'ET sviluppato non è efficace solo per lo studio delle proteine di legame di zucchero come riportato in precedenza 9, ma anche per le proteine comuni, uno AHL lectina insieme a due proteine-non-zucchero vincolante mioglobina e lisozima sono stati utilizzati. Essi sono stati scelti per avere una varietà di cariche in HEPES (pH 7.4):. AHL (punto isoelettrico (pI) 6.0), mioglobina (pI 7.2) e lisozima (pI 11) In particolare, come mostrato in figura 6, ciascuna proteina possiede un unico modello di risposta. AHL è leggermente caricata negativamente in HEPES. sua CEP mostra che ha forte interazione con i CoCRRs ricchi-BB2 carica negativa. Molto probabilmente, è dovuto all'interazione tra il dominio carica positiva della proteina e CoCRRs BB2-ricchi . Per la mioglobina, che è globalmente neutra in HEPES, non c'è molta differenza tra i segnali ottenuti con tutti CoCRRs. Quando si confrontano mioglobina nei CEP alle CEP di AHL e lisozima, anche ad una concentrazione maggiore è il segnale è molto lower. Quanto lisozima, che è caricato positivamente in HEPES, il segnale massima è stata ottenuta con la CoCRR contenente BB2 puro.Grazie ai vantaggi di Spri grado di monitorare in tempo reale i adsorbimento e desorbimento cinetica, per ogni proteina 3D continua evoluzione del paesaggio è stata generata. Questo tipo di modello di riconoscimento dipendente dal tempo porta i parametri di differenziazione complementari per l'analisi delle proteine. In particolare, potrebbe essere estremamente utile per analizzare due analiti presentano l'affinità per un insieme di CoCRRs ma differiscono per la loro cinetica di interazione. Come mostrato in figura 7, i CEL sono facilmente distinguibili. Questi risultati mostrano che l'interazione delle tre proteine con le CoCRRs dipende dalla loro caratteristiche superficiali quali la distribuzione dei residui di aminoacidi idrofobici, neutri e carichi. Sia CEP e CEL possono essere utilizzati come "impronte digitali" per la discriminazione proteine e prospecIdentificazione tiva. Così, l'eT è efficace per l'analisi di proteine comuni.
Il protocollo qui descritto utilizza un approccio combinatorio per costruire l'eT per l'analisi delle proteine. A differenza di altri approcci che utilizzano un numero di molecole che sono strutturalmente complicato e laborioso per sintetizzare, solo due piccole molecole sono stati usati per preparare la matrice recettore cross-reattivi in grado di differenziare le proteine con una buona risoluzione in studio. Inoltre, secondo l'indagine precedente, l'eT è stabile, riproducibile e riutilizzabile 9. Inoltre, SPRI permette di monitorare eventi vincolanti in tempo reale e di generare nuovi modelli di riconoscimento continuo con affidabilità senza precedenti. Nel prossimo futuro, saranno introdotte BB supplementari con complementari, proprietà fisico-chimiche per aumentare la diversità della CoCRR nelle matrici per l'analisi di miscele complesse di gas liquido o in.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SPRi apparatus | Horiba Scientific-GenOptics | SPRi apparatus is placed in a temperature regulated incubator at 25 °C. | |
| Incubator | Memmert | ||
| Syringe pump | Cavro scientific instruments | Cavro XLP 6000 | |
| Micro Elite Degasser | Alltech | AT590507 | |
| 6-port medium pressure injection valve | Upchurch Scientific | The volume of injection loop used is 500 µl. | |
| Femto plasma cleaner (version 7) | Diener Electronic | On-line degassing system with 2 channel. | |
| Spotter | Siliflow | It is a non-contact piezoelectric spotter. | |
| SPRi-Biochip | Horiba Scientific-GenOptics | 36000067 | The prism is made of a high refractive index glass prism coated with a thin gold film (45 nm) and specially developed for imaging purposes. |
| Erythrina cristagalli lectin | Sigma-Aldrich | L5390 | |
| Arachis hypogaea lectin | Sigma-Aldrich | L0881 | |
| Myoglobin | Sigma-Aldrich | M1882 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| CXCL12α | Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob; for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| CXCL12γ | Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob; for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| Lactose | Provided by Prof. David Bonnaffé; for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| Sulfated lactose | Provided by Prof. David Bonnaffé; for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 |
References
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