Articolo metodologico

Quantitative Immunofluorescence Assay misurare la variazione dei livelli di proteine ​​ad centrosomi

DOI:

10.3791/52030

⸱

20 dicembre 2014

 , 
1Department of Molecular Genetics, The Ohio State University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, viene sviluppato un nuovo test di fluorescenza quantitativa per misurare i cambiamenti nel livello di una proteina specificamente nei centrosomi normalizzando l'intensità di fluorescenza di quella proteina a quella di uno standard interno appropriato.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Centrosomi sono piccoli ma importanti organelli che servono come i poli di mitotico mandrino per mantenere l'integrità genomica o assemblare cilia primario per agevolare le funzioni sensoriali nelle cellule. Il livello di una proteina può essere regolata in modo diverso a centrosomes rispetto ad altre posizioni .cellular, e la variazione nel livello centrosomica di diverse proteine ​​in punti diversi del ciclo cellulare sembra essere cruciale per la corretta regolazione del complessivo centriolo. Abbiamo sviluppato un microscopio a fluorescenza dosaggio quantitativo che misura variazioni relative del livello di una proteina a centrosomes in cellule fisse di diversi campioni, come in diverse fasi del ciclo cellulare o dopo trattamento con vari reagenti. Il principio di questo test consiste nel misurare l'intensità di fluorescenza di fondo corretta corrispondente ad una proteina in una piccola regione, e normalizzare che misura contro lo stesso per un'altra proteina che non varia con il c sperimentale presceltoondition. Utilizzando questo test, in combinazione con l'impulso BrdU e la strategia caccia di studiare cicli cellulari imperturbati, abbiamo quantitativamente convalidato la nostra recente osservazione che il pool di centrosomica VDAC3 è regolata a centrosomi durante il ciclo cellulare, probabilmente dalla degradazione proteasoma-mediata specificamente a centrosomi.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Centrosomi costituiti da una coppia di centrioli circondate da materiale pericentriolar (PCM). Essendo i principali centri di organizzazione dei microtubuli (MTOC) in cellule di mammifero, centrosomi servono come i due poli di fusi mitotici nelle cellule in divisione, e quindi aiutano a mantenere l'integrità genomica 1. Nelle cellule quiescenti (ad esempio, durante la fase G0), uno dei due centrioli del centrosoma, cioè centriolo madre, si trasforma in un corpo basale per assemblare il cilium primaria, un organello sensoriale sporge dalla superficie cellulare 2. Una volta che le cellule ri-entrare nel ciclo cellulare, cilia primaria sono smontati e ogni centriolo dirige il montaggio di un procentriole alla sua estremità prossimale che allunga progressivamente a formare una centriolo maturo 3. All'inizio della fase S, una struttura di carro-like che fornisce la simmetria 9 volte al centriolo è formata sulla superficie di ciascun centriole esistente e diventerà la base di ogni procentriole. SAS6 tcappello è indispensabile per il montaggio centriolo viene reclutato per formare il fulcro della Cartwheel 4-6. Altre proteine ​​centriolar vengono poi assemblati sul cartwheel in un altamente regolamentato, prossimale a distale maniera 7. Dopo aver completato proprio centriolo duplicazione, cellule assemblare materiali pericentriolar supplementari per la costruzione di due centrosomi funzionali entro la fine della fase G2 8. Oltre ai componenti centriolar base 9-11, diverse altre proteine ​​tra cui chinasi, fosfatasi, accompagnatori, componenti del ponteggio, proteine ​​associate membrana e macchinari degrado sono associate a centrioli, corpi basali e PCM in momenti diversi del ciclo cellulare 12-16. Si è spesso osservato che i livelli centrosomica di molte proteine ​​sono temporalmente regolati da meccanismi di targeting centrosomica e / o degradazione del proteasoma in centrosomes. È importante sottolineare che le fluttuazioni del livello centrosomica di diverse proteine ​​come Plk4, Mps1, SAS6, e CP110 unt diversi punti del ciclo cellulare sembra essere essenziale per regolare centriole assemblaggio 5,17-22, e nel caso di Mps1 prevenire questa degradazione centrosomica porta alla formazione di centrioli eccesso 19. D'altra parte, le frazioni centrosomica di diverse proteine ​​sono meno labile rispetto alle piscine citosolici. Per esempio siRNA-mediata down-regulation di Centrin 2 (Cetn2) ha comportato solo una riduzione moderata del livello di proteine ​​nelle centrioli nonostante grande riduzione dei suoi livelli di cellule intere 23. E 'quindi fondamentale per misurare le variazioni del livello delle proteine ​​centrosomica al centrosoma, piuttosto che misurare i livelli di proteine ​​intere cellule nel valutare le loro funzioni specifiche centrosoma.

In questo studio abbiamo sviluppato un saggio con immunofluorescenza indiretta (IIF) per quantificare il livello relativo di una proteina a centrosomi. Questo test è stato sviluppato in particolare per analizzare cellule che sono da diversi campionie quindi non può essere ripreso contemporaneamente. Questi campioni possono essere le cellule che sono stati trattati con diversi reagenti (cioè, farmaco contro controllo), raccolti in diversi momenti (ad esempio, impulsi contro chase), o sono in diverse fasi del ciclo cellulare. Il principio di questo test consiste nel misurare l'intensità di fluorescenza di fondo corretta corrispondente ad una proteina in una piccola regione e per normalizzare tale valore contro lo stesso per un'altra proteina i cui livelli non variano nelle condizioni sperimentali adottate. Diversi studi in biologia centrosome hanno recentemente utilizzato varie tecniche di microscopia quantitative, in entrambe le cellule vive o fissi, per determinare la funzione specifica centrosoma di proteine ​​candidate 24-27. Simile a tali saggi, la tecnica attuale misura anche il fondo corretta intensità di fluorescenza della proteina. Tuttavia, l'inclusione della normalizzazione usando uno standard interno in questo saggio sarebbe probabilmente offrire maggiorela precisione e la fiducia ad analizzare due campioni diversi che si trovano su due lamelle differenti. Inoltre, oltre ad esaminare il livello di proteine ​​a centrosomes, con piccole modifiche questo metodo può essere applicato ad un insieme eterogeneo di condizioni sperimentali o in altri siti cellulari.

Qui, uniamo la nostra analisi di microscopia quantitativa con una strategia di pulse-chase BrdU per confrontare le cellule provenienti da diverse fasi del ciclo cellulare. Invece di utilizzare tecniche di arresto del ciclo cellulare normale e rilascio di studiare vari momenti del ciclo cellulare, le cellule in modo asincrono in crescita sono incubate con BrdU per etichettare le cellule in fase S, e le cellule marcate sono inseguiti per diverse volte (in genere 4-6 hr). La maggior parte delle cellule marcate saranno in fase S immediatamente dopo l'impulso. La lunghezza della caccia è scelto in modo che dopo la caccia, cellule marcate saranno in ritardo S, G2 o mitosi, che può essere verificata da caratteristiche morfologiche tale posizione as- di centrosomi rispetto nuclei, distanza tra centrosomi, condensazione di cromosomi ecc Quindi, la lunghezza della caccia dipende dalla durata media di S, G2 e M di fase di un particolare tipo di cellula. Poiché questo approccio evita inibitori del ciclo cellulare come idrossiurea, afidicolina, nocodazole, ecc, permette una analisi più fisiologicamente rilevanti ciclo cellulare.

Così, abbiamo dimostrato qui che la microscopia a fluorescenza quantitativa dosaggio soli, o in combinazione con BrdU test pulse-chase, è una tecnica semplice ma potente per misurare con precisione le relative variazioni del livello centrosomica di una proteina candidato durante un ciclo cellulare imperturbato. Abbiamo misurato il livello di centrosomica VDAC3, una proteina che abbiamo recentemente identificato in centrosomi, oltre ai mitocondri 16,28, con questi test. I risultati ottenuti qui verificare la nostra osservazione precedente che il pool di centrosomica VDAC3 è regolato da degrado, e varia anche in un dependen ciclo cellularet modo 16, inoltre, convalida l'applicabilità di questo metodo.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cultura 1. Cella

  1. Utilizzare telomerasi umana trascrittasi inversa (hTERT) cellule epiteliali del pigmento retinico immortalati (hTERT-RPE1, di cui qui RPE1).
    NOTA: le cellule RPE1 sono quasi diploide, non trasformati cellule umane che sono comunemente usati per studiare l'assemblaggio centriolo e ciliogenesis. Queste cellule seguono un normale ciclo di duplicazione centriolo coordinato con un ciclo cellulare regolamentato.
  2. Passaggio un quasi confluenti 100 millimetri piatto di coltura cellulare delle cellule RPE1 a diluizione 1: 5 della coltura originale in un piatto dolce 100 mm avente 10 ml di DME / F-12 (1: 1) media supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS), 100 U / ml di penicillina G e 100 ug / ml di streptomicina (terreno completo è fatto riferimento come DME / F-12 di media). Grow cellule a 37 ° C in presenza di 5% CO 2.
    1. Incubare 12 millimetri rotondi vetrini in 50 ml di HCl 1 N in un bicchiere di vetro coperto, O / N senza agitazione, a 60 ° C in un bagno d'acqua o incubatore.
    2. After scartando la soluzione di acido, lavare i coprioggetti tre volte in 100 ml di acqua distillata incubando per 15 min, con agitazione intermittente. Ripetere il lavaggio simile in 70% etanolo e il 95% di etanolo.
    3. Asciugare i coprioggetti dai loro diffusione singolarmente su una carta assorbente da laboratorio in un armadio biosicurezza, seguita da sterilizzazione con radiazioni UV per 60 min.
  3. Mettere 2-4 coprioggetto secco in un piatto di coltura cellulare di 35 mm. Diluire la soluzione di fibronectina o fibronectina come polimero ingegnerizzato (concentrazione archivio di 1 mg / ml) ad una concentrazione di 25 ug / ml in PBS coltura cellulare.
    1. Mettere 80-100 ml di soluzione diluita su ogni coprioggetto e incubare per 60 min per rivestire il lato superiore del vetrino. Lavare i coprioggetti tre volte con PBS prima di aggiungere terreno completo.

2. crescita delle cellule e cellule Trattare con Proteasome Inhibitors

  1. Passaggio 2 x 10 5 asincrono crescerecellule ing RPE1 in ogni piatto 35 millimetri contenente coprioggetto e far crescere le cellule in 2 ml terreno completo. Sostituire il terreno di coltura ogni 24 ore con terreno completo fresco pre-riscaldato.
    1. Per analizzare l'effetto di inibizione del proteasoma a livello centrosomica della proteina di prova (qui VDAC3 o γ-tubulina), crescono le cellule in due 35 piatti mm per 44 ore. Sostituire il terreno di coltura con terreno completo e aggiungere sia MG115 o DMSO come solvente comando ad una concentrazione finale di 5 mM o 0,05% rispettivamente. Allo stesso tempo, aggiungere BrdU alle cellule ad una concentrazione finale di 40 mM e incubare cellule per 4 ore.
    2. Trasferire ogni coprioggetto in un 24-pozzetti. Aggiungere metanolo 500 microlitri refrigerata a ciascun pozzetto e incubare la piastra a -20 ° C per 10 minuti per fissare le cellule sui vetrini. Lavare immediatamente i vetrini tre volte con 500 microlitri tampone di lavaggio (PBS 1x contenente 0,5 mM MgCl 2 e il 0,05% Triton-X 100).
  2. Raccogliere il residuocellule dal piatto da 35 mm e centrifugare le cellule a 1000 xg per 5 min. Utilizzare il pellet di cellule per analizzare le proteine ​​mediante western blotting (punto 6).

3. BrdU Pulse e Chase test per analizzare i livelli di proteine ​​nelle diverse fasi del ciclo cellulare

  1. Per analizzare la variazione del livello di una proteina (qui VDAC3, SAS6 o Cep135) a centrosomes nelle diverse fasi del ciclo cellulare, crescere le cellule in due piatti 35 mm contenenti coprioggetti per 44 hr. Sostituire il terreno di coltura con terreno completo contenente 40 mM BrdU e incubare le cellule per 4 ore nell'incubatrice coltura cellulare.
  2. Da un piatto, di trasferire i coprioggetti di un 24-pozzetti per fissare le cellule utilizzando metanolo freddo come descritto al punto 2.1.2.
  3. Dopo l'impulso di BrdU 4 ore, rimuovere il terreno-BrdU contenente, lavare le cellule una volta con PBS ed una volta con mezzo completo, aggiungere mezzo fresco, e poi far crescere le cellule in assenza di BrdU per vari tempi (tipicamente un'altra 4 hrper le cellule RPE1) prima che fissa le cellule come descritto al punto 2.1.2.
    NOTA: Per le cellule RPE1, la maggior parte delle cellule BrdU-positive sono in ritardo S o G2-fase, dopo un inseguimento 4 ore. Questo deve essere determinata in modo indipendente per ciascun tipo di cellula.

4. Immunostaining

  1. Incubare le cellule fissate su vetrini in 200 microlitri di tampone bloccante (2% BSA e 0,1% TritonX-100 in PBS 1x) per 30 min.
    1. Incubare le cellule con una miscela di anticorpi primari (tipicamente un risalto in coniglio e un'altra sollevato nel topo) diluito in tampone di bloccaggio O / N a 4 ° C in una camera umidificata.
    2. Per fare una camera umidificata, mettere un tovagliolo di carta bagnata nella metà inferiore di un 1.000 ml box puntale vuota. Disporre una striscia di Parafilm sulla superficie cremagliera, e individuare una goccia (15-20 ml) della soluzione di anticorpi sulla Parafilm per ogni coprioggetto da incubate. Invertire un coprioggetto su una goccia di soluzione di anticorpi (in modo che le cellule sono immerse) e vicinoil coperchio della scatola punta.
    3. Capovolgere nuovamente coprioggetto e tornare al piatto 24-bene. Lavare coprioggetto e poi incubare 150 miscela anticorpo secondario microlitri (qui green-colorante fluorescente coniugato anti-coniglio e colorante rosso fluorescente coniugato anti-topo diluito in tampone di bloccaggio) per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare i coprioggetti tre volte.
      NOTA: Gli anticorpi secondari fluoroforo-coniugato sono fotosensibili. Proteggere i campioni dalla luce durante le fasi 4.1.3-5.1.2.
  2. Preparatevi per la colorazione anti-BrdU fissando cellule RPE1 colorate di nuovo con 500 microlitri metanolo raffreddato a -20 ° C per 10 minuti, come descritto al punto 2.1.2. Lavare i coprioggetti tre volte.
    NOTA: Questa fissazione assicura l'etichettatura anticorpo primario e secondario della proteina (s) di interesse durante il processo di idrolisi acida nel passaggio seguente.
    1. Incubare le cellule in 200 ml di 2 N HCl per 30 minuti a RT. Neutralizzare con 300 ml di 1 M Tris-Cl, pH 8 und lavare le cellule tre volte con tampone di lavaggio.
    2. Bloccare le cellule nuovamente utilizzando 200 microlitri di tampone bloccante per 30 minuti a RT.
    3. Incubare le cellule con anticorpo anti-topo (BrdU diluito in tampone di bloccaggio) per 45 min a 37 ° C in una camera umidificata. Restituisce i coprioggetti torna al piatto 24 pozzetti, lavarli e poi incubare con blu-colorante fluorescente coniugato anti-rat anticorpo secondario (diluito in 150 ml di soluzione bloccaggio in piatto 24 pozzetti per 1 ora a temperatura ambiente.
  3. Lavare i coprioggetti tre volte. Spot una goccia (circa 3-6 ml) di una soluzione di montaggio contenente antifade reattivo su un vetrino da microscopio in vetro. Invertire un coprioggetto, con la cellula-lato rivolto verso il basso, sulla soluzione di montaggio. Pulire il liquido in eccesso premendo delicatamente il vetrino contro il vetrino utilizzando tessuti di pulizia molli. Applicare lo smalto trasparente lungo il bordo del vetrino per sigillarlo sul vetrino da microscopio.

5. immunofluorescenza Immagine Acquisition e analisi

  1. Utilizzare un obiettivo ad immersione 100X Plan Apo (con un'apertura numerica 1.4) per acquisire le immagini di cellule RPE1 BrdU-positive a temperatura ambiente.
    1. Mettere un vetrino sul microscopio (vedi attrezzature) collegato con una macchina fotografica in grado di digital imaging. Per ciascun fluoroforo, determinare il tempo di esposizione appropriata (tipicamente tra 300-1,000 msec) esaminando manualmente tutti i campioni di un esperimento. Prima di acquisire immagini di una cella, determinare manualmente all'inizio appropriato e piano focale inferiore lungo l'asse Z (tipicamente 0,2 micron passo). Acquisire le immagini di diversi campioni che si trovano su vetrini separati con tempo di esposizione identico per i diversi fluorofori lungo l'asse Z utilizzando un pacchetto software di imaging digitale di microscopia.
  2. Eseguire deconvoluzione (in questi casi utilizzando n algoritmo prossimo) di tutte le pile di immagine acquisiti lungo l'asse Z.
    1. Ottenere la proiezione intensità totale di ogni pila di immagini insiemeZ.
  3. Nelle cellule dove centrosomi sono vicini (distanza tra due centrosomi è inferiore a 2 micron), disegnare una piccola piazza (tipicamente 20-30 pixel per lato) intorno ad entrambi i centrosomi e segnare l'area selezionata.
    1. Disegnare un quadrato più grande (in genere 24-35 pixel per lato) che circondano la prima piazza e segnare l'area selezionata del piazzale.
    2. Ottenere la zona (A) e l'intensità di fluorescenza totale (F) di ciascun fluoroforo in ciascuna casella (S denota piccola scatola e L indica grande scatola).
    3. Analizzare il fondo corretta intensità di fluorescenza di ciascun fluoroforo utilizzando la formula descritta da Howell et al. 29: F = F S - [(F L - F S) x A S / (A L - A S)].
    4. Ottenere l'intensità di fluorescenza normalizzata della proteina di interesse (qui VDAC3 o SAS6) calcolando il rapporto tra l'intensità di fluorescenza di fondo corretto dei suoi fluorophore a quella del fluoroforo utilizzato per lo standard prescelto interno (qui γ-tubulina, SAS6 o Cep135).
  4. Nel caso di analisi cellule dove centrosomes sono ben separati (distanza tra due centrosomi è maggiore di 2 micron), analizzare ogni centrosome separatamente disegnando due gruppi separati di scatole. Disegnare una piccola piazza (tipicamente 15-25 pixel per lato) intorno ad ogni centrosomi e segnare l'area selezionata. Disegnare un quadrato più grande (20-30 pixel per lato) che circondano la prima piazza e segnare l'area selezionata.
    1. Ottenere la zona (A) e l'intensità di fluorescenza totale (F) di ciascun fluoroforo in ogni casella, e calcolare correzione del fondo fluorescenza intensità di ciascun fluoroforo, separatamente per ciascuna centrosome, come descritto al punto 5.3.3.
    2. Combinare correzione del fondo fluorescenza intensità di ciascuna proteina dai due centrosomi per ottenere il livello centrosomica totale di proteine ​​che in quella cella.
    3. Ottenere ilintensità normalizzata per la proteina di interesse calcolando il rapporto tra l'intensità totale centrosomica all'intensità centrosomica totale dello standard interno.
  5. Analizzare almeno 15-25 cellule per ogni condizione sperimentale e tracciare il grafico in un foglio di calcolo.

6. Analizzando il Proteine ​​totali Utilizzando Western Blotting

  1. Risospendere le cellule in radioimmunoprecipitazione dosaggio (RIPA) tampone contenente 50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 1% desossicolato di sodio, 0,1% sodio dodecil solfato (SDS) e incubare per 10 min in ghiaccio per lisare le cellule.
    1. Centrifugare la miscela a 10.000 xg per 10 min, separare il lisato dalla frazione pellet e misurare la concentrazione di proteine ​​totali di ciascun lisato utilizzando un acido bicinconinico (BCA) Kit test.
  2. Mescolare 40 ug di lisato con 4x SDS-PAGE tampone di caricamento (50 mM Tris-Cl, pH 6,8, 2% SDS, 10% glicerolo, ditiotreitolo 100 mM, 0,1% Bromophenol blu).
    1. Lessare i campioni per 10 minuti ed eseguire i campioni su un 12,5% di denaturazione SDS-PAGE ad una tensione costante di 200 V.
  3. Trasferire le proteine ​​separate su SDS-PAGE su una membrana di nitrocellulosa utilizzando la tecnica western blotting (ad una tensione costante di 90 V per 1 ora a freddo).
    1. Bloccare la membrana con 3% latte scremato in PBS 1x e quindi incubare la membrana con soluzioni di anticorpi primari diluiti (in questo caso coniglio anti-VDAC3, coniglio anti-γ-tubulina e topo anti-α-tubulina) per 1 ora a RT.
    2. Dopo aver lavato la membrana tre volte (ogni 5 min di incubazione sotto agitando) usando tampone PBS-T (PBS 1x e 0,2% Tween-20), incubare la membrana in una miscela di infrarosso vicino (IR) colorante fluorescente coniugato anti-coniglio e colorante fluorescente IR coniugati anti-topo anticorpi secondari (diluito in PBS-T) per 1 ora.
    3. Lavare la membrana per tre volte e quindi acquisire la membrana per analizzare le fasce con un f infrarossisistema di imaging luorescence adatto per il rilevamento immunoblot.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I nostri studi recenti identificati romanzo localizzazione centrosomica e la funzione di VDAC3, uno dei porine mitocondriali 16,28. Immunostaining di diverse cellule di mammiferi, tra cui le cellule RPE1 utilizzando un anticorpo VDAC3 specifico ha mostrato prominente colorazione centrosomica e relativamente debole colorazione mitocondriale. Abbiamo anche dimostrato che VDAC3 centrosomica è preferenzialmente associata al centriolo madre, e la piscina centrosomica sia endogeno e ectopicamente espresso VDAC3 è r...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microscopia quantitativa in biologia cellulare è comunemente associato con live-cell test di imaging come la Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), Recupero della fluorescenza dopo photobleaching (FRAP), ecc, tuttavia, ci sono esempi di crescita di biologi cellulari di sviluppo diversi saggi microscopia quantitativi per fisso cellule negli ultimi anni 27,34-36. È importante sottolineare che, progressi nella comprensione della biologia centrosoma spesso richiede la comprensione della funzione ...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del National Institutes of Health (GM77311) e da una sovvenzione iniziale da The Ohio Cancer Research Associates (a H.A.F.). SM è stato parzialmente supportato da una borsa di studio Up on the Roof del Programma di Genetica del Cancro Umano dell'Ohio State University Comprehensive Cancer Center.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
FibronectinaSigmaF8141Stock di 1 mg/ml in acqua
DMSOSigmaD2650
MG115SigmaSCP0005Stock di 10 mM in DMSO
BrdUSigmaB5002Stock di 10 mM in DMSO
Anti-γ-tubulina (monoclonale di topo, clone GTU 88)SigmaT 65571:200 in tampone bloccante IIF 
Anti-VDAC3 (policlonale di coniglio) Aviva Systems BiologyARP35180-P0501:50 in tampone di blocco IIF, 1:1.000 in tampone di blocco WB
Anti-Sas6 (monoclonale di topo) Santa cruz biotechnologysc-81431 1:100 in tampone bloccante IIF
Anti-Cep135 (policlonale di coniglio)Abcamab-750051:500 in tampone bloccante IIF
Anti-BrdU (monoclonale di ratto) Abcamab63261:250 in tampone di blocco IIF
Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L)Life technologiesA210931:200 in IIF buffer di blocco
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) AntibodyLife technologiesA212021:1.000 in IIF buffer di blocco
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) AntibodyLife technologiesA212031:1.000 in IIF tampone bloccante
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) AntibodyLife technologiesA212061:1.000 in tampone di blocco IIF
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) AntibodyLife technologiesA212071:1.000 in tampone di blocco IIF
Anti-γ-tubulina (coniglio policlonale)SigmaT51921:1.000 in tampone
di blocco WBAnti-α-tubulina (monoclonale di topo, DM1A)SigmaT90261:20.000 in tampone di blocco del WB
Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Life technologiesA100431:10.000 in tampone di blocco del WB
IgG di topo (H& L) Anticorpo IRDye800CW Anticorpi coniugatiRockland610-731-0021:10.000 in tampone di blocco WB
Reagente antidissolvenza SlowFade GoldLife technologiesS36936Supporti di montaggio
Vetrini coprioggetti rotondi 12CIR.-1Fisherbrand12-545-80
Microscopio Olympus IX-81Olympus
Retiga ExiFAST 1394 Telecamera IRQImaging 32-0082B-238
Obiettivo a immersione in olio 100X Plan ApoOlympus1.4
Pacchetto software SlidebookInnovazioni
Sistema di imaging IR OdysseyLi-cor Biosciences
Saggio dell'acido bicinchoninico (BCA)Thermo Scientific23227
U-MNU2 CuboUV strettoFiltro OlympusU-M622
U-MNU2 Cubo blu strettoFiltro OlympusU-M643
U-MNU2 Cubo verde strettoFiltro OlympusU-M663
Apertura numerica di imaging intelligente

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
  2. Kobayashi, T., Dynlacht, B. D. Regulating the transition from centriole to basal body. J. Cell Biol. 193, 435-444 (2011).
  3. Azimzadeh, J., Marshall, W. F. Building the centriole. Curr. Biol. 20, 816-825 (2010).
  4. Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole. Curr. Biol. 17, 2169-2174 (2007).
  5. Strnad, P., et al. Regulated HsSAS-6 levels ensure formation of a single procentriole per centriole during the centrosome duplication cycle. Dev. Cell. 13, 203-213 (2007).
  6. Hilbert, M., et al. Caenorhabditis elegans centriolar protein SAS-6 forms a spiral that is consistent with imparting a ninefold symmetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 11373-11378 (2013).
  7. Pike, A. N., Fisk, H. A. Centriole assembly and the role of Mps1: defensible or dispensable. Cell Div. 6, 9(2011).
  8. Haren, L., Stearns, T., Luders, J. Plk1-dependent recruitment of gamma-tubulin complexes to mitotic centrosomes involves multiple PCM components. PLoS One. 4, e5976(2009).
  9. Andersen, J. S., et al. Proteomic characterization of the human centrosome by protein correlation profiling. Nature. 426, 570-574 (2003).
  10. Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R. 3rd, Marshall, W. F. Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes. Curr. Biol. 15, 1090-1098 (2005).
  11. Kumar, A., Rajendran, V., Sethumadhavan, R., Purohit, R. CEP proteins: the knights of centrosome dynasty. Protoplasma. 250, 965-983 (2013).
  12. Kanai, M., et al. Physical and functional interaction between mortalin and Mps1 kinase. Genes Cells. 12, 797-810 (2007).
  13. Jakobsen, L., et al. Novel asymmetrically localizing components of human centrosomes identified by complementary proteomics methods. Embo. J. 30, 1520-1535 (2011).
  14. Sang, L., et al. Mapping the NPHP-JBTS-MKS protein network reveals ciliopathy disease genes and pathways. Cell. 145, 513-528 (2011).
  15. Dowdle, W. E., et al. Disruption of a ciliary B9 protein complex causes Meckel syndrome. Am. J. Hum. Genet. 89, 94-110 (2011).
  16. Majumder, S., Slabodnick, M., Pike, A., Marquardt, J., Fisk, H. A. VDAC3 regulates centriole assembly by targeting Mps1 to centrosomes. Cell Cycle. 11, 3666-3678 (2012).
  17. Guderian, G., Westendorf, J., Uldschmid, A., Nigg, E. A. Plk4 trans-autophosphorylation regulates centriole number by controlling betaTrCP-mediated degradation. J. Cell Sci. 123, 2163-2169 (2010).
  18. Holland, A. J., et al. The autoregulated instability of Polo-like kinase 4 limits centrosome duplication to once per cell cycle. Genes Dev. 26, 2684-2689 (2012).
  19. Kasbek, C., et al. Preventing the degradation of mps1 at centrosomes is sufficient to cause centrosome reduplication in human cells. Mol. Biol. Cell. 18, 4457-4469 (2007).
  20. Kasbek, C., Yang, C. H., Fisk, H. A. Antizyme restrains centrosome amplification by regulating the accumulation of Mps1 at centrosomes. Mol. Biol. Cell. 21, 3878-3889 (2010).
  21. Puklowski, A., et al. The SCF-FBXW5 E3-ubiquitin ligase is regulated by PLK4 and targets HsSAS-6 to control centrosome duplication. Nat. Cell Biol. 13, 1004-1009 (2011).
  22. Spektor, A., Tsang, W. Y., Khoo, D., Dynlacht, B. D. Cep97 and CP110 suppress a cilia assembly program. Cell. 130, 678-690 (2007).
  23. Salisbury, J., Suino, K., Busby, R., Springett, M. Centrin-2 is required for centriole duplication in Mammalian cells. Curr. Biol. 12, 1287(2002).
  24. Lukasiewicz, K. B., et al. Control of centrin stability by Aurora A. PLoS One. 6, e21291(2011).
  25. Zhao, J., Ren, Y., Jiang, Q., Feng, J. Parkin is recruited to the centrosome in response to inhibition of proteasomes. J. Cell Sci. 116, 4011-4019 (2003).
  26. Korzeniewski, N., et al. Cullin 1 functions as a centrosomal suppressor of centriole multiplication by regulating polo-like kinase 4 protein levels. Cancer Res. 69, 6668-6675 (2009).
  27. Rohatgi, R., Milenkovic, L., Corcoran, R. B., Scott, M. P. Hedgehog signal transduction by Smoothened: pharmacologic evidence for a 2-step activation process. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3196-3201 (2009).
  28. Majumder, S., Fisk, H. A. VDAC3 and Mps1 negatively regulate ciliogenesis. Cell Cycle. 12, 849-858 (2013).
  29. Howell, B. J., Hoffman, D. B., Fang, G., Murray, A. W., Salmon, E. D. Visualization of Mad2 dynamics at kinetochores, along spindle fibers, and at spindle poles in living cells. J. Cell Biol. 150, 1233-1250 (2000).
  30. Meraldi, P., Nigg, E. A. Centrosome cohesion is regulated by a balance of kinase and phosphatase activities. J. Cell Sci. 114, 3749-3757 (2001).
  31. Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry. Mol. Biol. Cell. 15, 3642-3657 (2004).
  32. Lee, K., Rhee, K. PLK1 phosphorylation of pericentrin initiates centrosome maturation at the onset of mitosis. J. Cell Biol. 195, 1093-1101 (2011).
  33. Lin, Y. C., et al. Human microcephaly protein CEP135 binds to hSAS-6 and CPAP, and is required for centriole assembly. Embo. J. 32, 1141-1154 (2013).
  34. Lichtenstein, N., Geiger, B., Kam, Z. Quantitative analysis of cytoskeletal organization by digital fluorescent microscopy. Cytometry A. 54, 8-18 (2003).
  35. Keller, L. C., et al. Molecular architecture of the centriole proteome: the conserved WD40 domain protein POC1 is required for centriole duplication and length control. Mol. Biol. Cell. 20, 1150-1166 (2009).
  36. Venoux, M., et al. Poc1A and Poc1B act together in human cells to ensure centriole integrity. J. Cell Sci. 126, 163-175 (2013).
  37. Stevens, N. R., Roque, H., Raff, J. W. DSas-6 and Ana2 coassemble into tubules to promote centriole duplication and engagement. Dev. Cell. 19, 913-919 (2010).
  38. Machiels, B. M., et al. Detailed analysis of cell cycle kinetics upon proteasome inhibition. Cytometry. 28, 243-252 (1997).
  39. Yang, C. H., Kasbek, C., Majumder, S., Yusof, A. M., Fisk, H. A. Mps1 phosphorylation sites regulate the function of centrin 2 in centriole assembly. Mol. Biol. Cell. 21, 4361-4372 (2010).
  40. Tsou, M. F., et al. Polo kinase and separase regulate the mitotic licensing of centriole duplication in human cells. Dev. Cell. 17, 344-354 (2009).
  41. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
  42. Buck, S. B., et al. Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies. Biotechniques. 44, 927-929 (2008).
  43. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J. Cell Biol. 185, 1135-1148 (2009).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Livelli di proteine centrosomicheSaggio di microscopia a fluorescenzaInibizione del proteasomaBrdU pulse chaseGamma tubulinaCellule RPE1Intensit corretta per il backgroundNormalizzazione proteicaAnalisi del ciclo cellulare

Articoli correlati