Articolo metodologico
Qui, viene sviluppato un nuovo test di fluorescenza quantitativa per misurare i cambiamenti nel livello di una proteina specificamente nei centrosomi normalizzando l'intensità di fluorescenza di quella proteina a quella di uno standard interno appropriato.
Centrosomi sono piccoli ma importanti organelli che servono come i poli di mitotico mandrino per mantenere l'integrità genomica o assemblare cilia primario per agevolare le funzioni sensoriali nelle cellule. Il livello di una proteina può essere regolata in modo diverso a centrosomes rispetto ad altre posizioni .cellular, e la variazione nel livello centrosomica di diverse proteine in punti diversi del ciclo cellulare sembra essere cruciale per la corretta regolazione del complessivo centriolo. Abbiamo sviluppato un microscopio a fluorescenza dosaggio quantitativo che misura variazioni relative del livello di una proteina a centrosomes in cellule fisse di diversi campioni, come in diverse fasi del ciclo cellulare o dopo trattamento con vari reagenti. Il principio di questo test consiste nel misurare l'intensità di fluorescenza di fondo corretta corrispondente ad una proteina in una piccola regione, e normalizzare che misura contro lo stesso per un'altra proteina che non varia con il c sperimentale presceltoondition. Utilizzando questo test, in combinazione con l'impulso BrdU e la strategia caccia di studiare cicli cellulari imperturbati, abbiamo quantitativamente convalidato la nostra recente osservazione che il pool di centrosomica VDAC3 è regolata a centrosomi durante il ciclo cellulare, probabilmente dalla degradazione proteasoma-mediata specificamente a centrosomi.
Centrosomi costituiti da una coppia di centrioli circondate da materiale pericentriolar (PCM). Essendo i principali centri di organizzazione dei microtubuli (MTOC) in cellule di mammifero, centrosomi servono come i due poli di fusi mitotici nelle cellule in divisione, e quindi aiutano a mantenere l'integrità genomica 1. Nelle cellule quiescenti (ad esempio, durante la fase G0), uno dei due centrioli del centrosoma, cioè centriolo madre, si trasforma in un corpo basale per assemblare il cilium primaria, un organello sensoriale sporge dalla superficie cellulare 2. Una volta che le cellule ri-entrare nel ciclo cellulare, cilia primaria....
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Cultura 1. Cella
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I nostri studi recenti identificati romanzo localizzazione centrosomica e la funzione di VDAC3, uno dei porine mitocondriali 16,28. Immunostaining di diverse cellule di mammiferi, tra cui le cellule RPE1 utilizzando un anticorpo VDAC3 specifico ha mostrato prominente colorazione centrosomica e relativamente debole colorazione mitocondriale. Abbiamo anche dimostrato che VDAC3 centrosomica è preferenzialmente associata al centriolo madre, e la piscina centrosomica sia endogeno e ectopicamente espresso VDAC3 è r.......
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Microscopia quantitativa in biologia cellulare è comunemente associato con live-cell test di imaging come la Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), Recupero della fluorescenza dopo photobleaching (FRAP), ecc, tuttavia, ci sono esempi di crescita di biologi cellulari di sviluppo diversi saggi microscopia quantitativi per fisso cellule negli ultimi anni 27,34-36. È importante sottolineare che, progressi nella comprensione della biologia centrosoma spesso richiede la comprensione della funzione .......
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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del National Institutes of Health (GM77311) e da una sovvenzione iniziale da The Ohio Cancer Research Associates (a H.A.F.). SM è stato parzialmente supportato da una borsa di studio Up on the Roof del Programma di Genetica del Cancro Umano dell'Ohio State University Comprehensive Cancer Center.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Fibronectina | Sigma | F8141 | Stock di 1 mg/ml in acqua |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| MG115 | Sigma | SCP0005 | Stock di 10 mM in DMSO |
| BrdU | Sigma | B5002 | Stock di 10 mM in DMSO |
| Anti-γ-tubulina (monoclonale di topo, clone GTU 88) | Sigma | T 6557 | 1:200 in tampone bloccante IIF |
| Anti-VDAC3 (policlonale di coniglio) | Aviva Systems Biology | ARP35180-P050 | 1:50 in tampone di blocco IIF, 1:1.000 in tampone di blocco WB |
| Anti-Sas6 (monoclonale di topo) | Santa cruz biotechnology | sc-81431 1 | :100 in tampone bloccante IIF |
| Anti-Cep135 (policlonale di coniglio) | Abcam | ab-75005 | 1:500 in tampone bloccante IIF |
| Anti-BrdU (monoclonale di ratto) | Abcam | ab6326 | 1:250 in tampone di blocco IIF |
| Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life technologies | A21093 | 1:200 in IIF buffer di blocco |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21202 | 1:1.000 in IIF buffer di blocco |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21203 | 1:1.000 in IIF tampone bloccante |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21206 | 1:1.000 in tampone di blocco IIF |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21207 | 1:1.000 in tampone di blocco IIF |
| Anti-γ-tubulina (coniglio policlonale) | Sigma | T5192 | 1:1.000 in tampone |
| di blocco WBAnti-α-tubulina (monoclonale di topo, DM1A) | Sigma | T9026 | 1:20.000 in tampone di blocco del WB |
| Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A10043 | 1:10.000 in tampone di blocco del WB |
| IgG di topo (H& L) Anticorpo IRDye800CW Anticorpi coniugati | Rockland | 610-731-002 | 1:10.000 in tampone di blocco WB |
| Reagente antidissolvenza SlowFade Gold | Life technologies | S36936 | Supporti di montaggio |
| Vetrini coprioggetti rotondi 12CIR.-1 | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| Microscopio Olympus IX-81 | Olympus | ||
| Retiga ExiFAST 1394 Telecamera IR | QImaging | 32-0082B-238 | |
| Obiettivo a immersione in olio 100X Plan Apo | Olympus | 1.4 | |
| Pacchetto software Slidebook | Innovazioni | ||
| Sistema di imaging IR Odyssey | Li-cor Biosciences | ||
| Saggio dell'acido bicinchoninico (BCA) | Thermo Scientific | 23227 | |
| U-MNU2 Cubo | UV strettoFiltro Olympus | U-M622 | |
| U-MNU2 Cubo blu stretto | Filtro Olympus | U-M643 | |
| U-MNU2 Cubo verde stretto | Filtro Olympus | U-M663 |
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