Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

मात्रात्मक इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख Centrosomes में प्रोटीन का स्तर में रूपांतर उपाय

Published: December 20, 2014 doi: 10.3791/52030
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Genetics, The Ohio State University

Abstract

Centrosomes जीनोमिक अखंडता को बनाए रखने या कोशिकाओं में संवेदी कार्यों की सुविधा के लिए प्राथमिक सिलिया को इकट्ठा करने के mitotic धुरी के डंडे के रूप में सेवा है कि छोटी लेकिन महत्वपूर्ण अंगों हैं। एक प्रोटीन का स्तर अन्य .cellular स्थानों पर से centrosomes पर अलग ढंग से विनियमित किया जा सकता है, और सेल चक्र के विभिन्न बिंदुओं पर कई प्रोटीन की centrosomal स्तर में भिन्नता तारककेंद्रक विधानसभा का उचित नियमन के लिए महत्वपूर्ण प्रतीत होता है। हम इस तरह के सेल चक्र के विभिन्न चरणों में के रूप में या विभिन्न अभिकर्मकों के साथ उपचार के बाद विभिन्न नमूनों से तय कोशिकाओं में centrosomes पर एक प्रोटीन के स्तर में रिश्तेदार परिवर्तन, उपाय है कि एक मात्रात्मक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी परख विकसित किया है। इस परख के सिद्धांत के एक छोटे से क्षेत्र में एक प्रोटीन के लिए इसी पृष्ठभूमि को सही फ्लोरोसेंट तीव्रता को मापने में निहित है, और चुने हुए प्रयोगात्मक सी के तहत भिन्न नहीं है कि एक और प्रोटीन के लिए एक ही खिलाफ है कि माप मानक के अनुसारondition। BrdU के नाड़ी और बेफिक्र सेल चक्र का अध्ययन करने के लिए पीछा रणनीति के साथ संयोजन में इस परख का उपयोग, हम मात्रात्मक विशेष रूप से centrosomes पर Proteasome की मध्यस्थता गिरावट से होने की संभावना VDAC3 की centrosomal पूल सेल चक्र के दौरान centrosomes पर नियंत्रित किया जाता है कि हमारे हाल के अवलोकन, पुष्टि की है।

Introduction

Centrosomes pericentriolar सामग्री (पीसीएम) से घिरा हुआ centrioles की एक जोड़ी से मिलकर बनता है। स्तनधारी कोशिकाओं में प्रमुख सूक्ष्मनलिका आयोजन केन्द्रों (MTOCs) होने के नाते, centrosomes विभाजित कोशिकाओं में mitotic spindles के दो ध्रुवों के रूप में सेवा, और इस तरह जीनोमिक अखंडता एक बनाए रखने में मदद। (G0 चरण के दौरान जैसे,) मौन कोशिकाओं में, सेंट्रोसोम, अर्थात् मां तारककेंद्रक के दो centrioles में से एक, प्राथमिक पपनी, कोशिका की सतह 2 से बाहर फैला हुआ एक संवेदी organelle इकट्ठा करने के लिए एक बेसल शरीर में तब्दील हो जाता है। एक बार कोशिकाओं सेल चक्र फिर से दर्ज, प्राथमिक सिलिया disassembled और प्रत्येक तारककेंद्रक धीरे-धीरे एक परिपक्व तारककेंद्रक 3 के लिए फार्म elongates कि इसके समीपस्थ अंत में एक procentriole की विधानसभा का निर्देशन कर रहे हैं। एस चरण की शुरुआत में, तारककेंद्रक 9 गुना समरूपता प्रदान करता है कि एक गाड़ी का पहिया जैसी संरचना प्रत्येक मौजूदा तारककेंद्रक की सतह पर बनाई है और प्रत्येक procentriole का आधार बन जाएगा। Sas6 टीतारककेंद्रक विधानसभा गाड़ी का पहिया 4-6 के हब के फार्म के लिए भर्ती किया गया है के लिए टोपी अपरिहार्य है। अन्य centriolar प्रोटीन तो बाहर का ढंग 7 करने के लिए एक उच्च विनियमित, समीपस्थ में गाड़ी का पहिया पर इकट्ठा कर रहे हैं। ठीक तारककेंद्रक दोहराव पूरा करने के बाद, कोशिकाओं G2 के चरण 8 के अंत तक दो कार्यात्मक centrosomes का निर्माण करने के लिए अतिरिक्त pericentriolar सामग्री इकट्ठा। कोर centriolar घटकों 9-11, kinases, phosphatases, संरक्षिकाओं, पाड़ घटक, झिल्ली जुड़े प्रोटीन और गिरावट मशीनरी सहित कई अन्य प्रोटीन के अलावा सेल चक्र 12-16 के अलग अलग समय पर centrioles, बेसल शरीर और पीसीएम के साथ जुड़े रहे हैं। यह अक्सर कई प्रोटीन की centrosomal स्तरों अस्थायी centrosomal लक्ष्य-निर्धारण तंत्र और / या centrosomes पर proteasomal गिरावट द्वारा विनियमित रहे हैं कि उल्लेख किया है। महत्वपूर्ण बात है, ऐसे Plk4, Mps1, Sas6, और CP110 एक के रूप में कई प्रोटीन की centrosomal स्तर में उतार-चढ़ावसेल चक्र के टी विभिन्न बिंदुओं तारककेंद्रक विधानसभा 5,17-22 को विनियमित करने के लिए महत्वपूर्ण प्रतीत होता है, और इस centrosomal गिरावट को रोकने Mps1 के मामले में अतिरिक्त centrioles 19 के गठन की ओर जाता है। दूसरी ओर, कई प्रोटीन की centrosomal अंशों साइटोसोलिक पूल की तुलना में कम अस्थिर कर रहे हैं। उदाहरण के लिए नीचे विनियमन Centrin 2 (Cetn2) की siRNA की मध्यस्थता अपने पूरे सेल का स्तर 23 में महान कमी के बावजूद centrioles में प्रोटीन के स्तर का केवल एक उदारवादी कमी करने के लिए नेतृत्व किया। बल्कि यह उनके सेंट्रोसोम-विशिष्ट कार्यों का आकलन करने के लिए जब पूरे सेल प्रोटीन के स्तर को मापने की तुलना में सेंट्रोसोम पर centrosomal प्रोटीन के स्तर में परिवर्तन को मापने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है।

इस अध्ययन में हम centrosomes पर एक प्रोटीन के रिश्तेदार स्तर यों तो अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस (IIF) का उपयोग कर एक परख विकसित किया है। यह परख विभिन्न नमूनों से कर रहे हैं कि कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए विशेष रूप से विकसित की हैऔर इस तरह एक ही समय में imaged नहीं किया जा सकता। इन नमूनों अलग समय बिंदुओं पर एकत्र अलग अभिकर्मकों (यानी, औषध नियंत्रण बनाम), के साथ इलाज किया गया है कि कोशिकाओं हो सकता है (यानी, पीछा बनाम नाड़ी), या सेल चक्र के विभिन्न चरणों में हैं। इस परख के सिद्धांत पृष्ठभूमि को सही फ्लोरोसेंट तीव्रता के एक छोटे से क्षेत्र में एक प्रोटीन के लिए इसी और जिसका स्तर चुना प्रयोगात्मक शर्तों के तहत भिन्न नहीं है एक और प्रोटीन के लिए एक ही खिलाफ है कि मूल्य को सामान्य करने को मापने में निहित है। सेंट्रोसोम जीव विज्ञान में कई अध्ययनों से हाल ही में उम्मीदवार प्रोटीन 24-27 की सेंट्रोसोम-विशेष समारोह का निर्धारण करने के लिए, दोनों रहते हैं या तय कोशिकाओं में विभिन्न मात्रात्मक माइक्रोस्कोपी तकनीक, का उपयोग किया है। उन assays के लिए इसी प्रकार, वर्तमान तकनीक को भी परीक्षण प्रोटीन की पृष्ठभूमि को सही प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापता है। हालांकि, इस परख में एक आंतरिक मानक का उपयोग सामान्य बनाने का समावेश होता संभावना अधिक की पेशकशसटीकता और दो अलग अलग coverslips पर कर रहे हैं कि दो विभिन्न नमूनों का विश्लेषण करने में विश्वास। इसके अलावा, centrosomes में प्रोटीन के स्तर की जांच करने के अलावा, मामूली समायोजन के साथ इस विधि प्रयोगात्मक शर्तों की एक विविध सेट करने के लिए या अन्य सेलुलर स्थलों पर लागू किया जा सकता है।

यहाँ, हम अलग अलग सेल चक्र के चरणों से कोशिकाओं की तुलना करने के लिए एक BrdU के नाड़ी-पीछा रणनीति के साथ हमारे मात्रात्मक माइक्रोस्कोपी परख गठबंधन। इसके बजाय, विभिन्न सेल चक्र समय बिंदुओं का अध्ययन करने के asynchronously बढ़ कोशिकाओं मानक सेल चक्र गिरफ्तारी और रिहाई की तकनीक का उपयोग कर के एस चरण में कोशिकाओं लेबल BrdU के साथ incubated रहे हैं, और लेबल की कोशिकाओं में विभिन्न समय (आमतौर पर 4-6 घंटा) के लिए पीछा कर रहे हैं। लेबल की कोशिकाओं के सबसे तुरंत नाड़ी के बाद एस चरण में होगा। पीछा करने के बाद, लेबल कोशिकाओं रूपात्मक विशेषताओं NUC के लिए सम्मान के साथ centrosomes के जैसे- स्थिति द्वारा सत्यापित किया जा सकता है, जो देर हो चुकी है, G2 है, या पिंजरे का बँटवारा, में होगा तो यह है कि पीछा करने की लंबाई चुना जाता हैलेई, centrosomes के बीच की दूरी, आदि के गुणसूत्रों का संक्षेपण प्रकार, पीछा करने की लंबाई एस, G2 और एक विशेष सेल प्रकार के एम चरण की औसत अवधि पर निर्भर करता है। इस दृष्टिकोण आदि hydroxyurea, aphidicolin, nocodazole, के रूप में सेल चक्र अवरोधकों से बचा जाता है के बाद से, यह एक और अधिक physiologically प्रासंगिक सेल चक्र विश्लेषण की अनुमति देता है।

इस प्रकार, हम अकेले मात्रात्मक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी परख, या BrdU के नाड़ी-पीछा परख के साथ संयोजन में, सही ढंग से एक बेफिक्र सेल चक्र के दौरान एक उम्मीदवार प्रोटीन की centrosomal स्तर में रिश्तेदार परिवर्तन को मापने के लिए एक सरल अभी तक शक्तिशाली तकनीक है कि यहाँ प्रदर्शित करता है। हम इन assays का उपयोग, VDAC3, हमने हाल ही में 16,28 माइटोकॉन्ड्रिया के अलावा centrosomes में पहचान की है कि एक प्रोटीन की centrosomal स्तर मापा जाता है। यहां प्राप्त परिणामों VDAC3 की centrosomal पूल गिरावट द्वारा नियंत्रित किया जाता है कि हमारे पिछले प्रेक्षण सत्यापित, और यह भी एक कोशिका चक्र dependen में बदलता हैटी ढंग 16, इसके अलावा इस पद्धति के प्रयोग को मान्य किया।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. सेल संस्कृति

  1. रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (hTERT) अमर रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं मानव टेलोमिरेज का उपयोग करें (hTERT-RPE1; RPE1 यहाँ के रूप में करने के लिए कहा गया है)।
    नोट: RPE1 कोशिकाओं सामान्यतः तारककेंद्रक विधानसभा और ciliogenesis अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं कि निकट द्विगुणित, गैर तब्दील मानव कोशिकाओं रहे हैं। इन कोशिकाओं को एक विनियमित सेल चक्र के साथ समन्वित एक सामान्य तारककेंद्रक दोहराव चक्र का पालन करें।
  2. पारित होने के एक पर RPE1 कोशिकाओं के एक के पास मिला हुआ 100 मिमी सेल संस्कृति डिश: से 10 मिलीग्राम से युक्त एक ताजा 100 मिमी डिश में मूल संस्कृति के 5 कमजोर पड़ने डीएमई / एफ-12 (1: 1) मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक (एफ बी एस), 100 यू / एमएल पेनिसिलिन जी और 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पूरा मध्यम डीएमई / एफ-12 के माध्यम के रूप में जाना जाता है)। 5% सीओ 2 की उपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को विकसित।
    1. एक पानी के स्नान या इनक्यूबेटर में 60 डिग्री सेल्सियस पर, मिलाते हुए बिना एक कवर गिलास बीकर, ओ / एन में 1 एन एचसीएल के 50 मिलीलीटर में 12 मिमी दौर कांच coverslips सेते हैं।
    2. वायु सेनाएसिड समाधान discarding आतंकवाद, सामयिक झटकों के साथ 15 मिनट के लिए incubating द्वारा coverslips पानी आसुत 100 मिलीलीटर में तीन बार धोएं। 70% इथेनॉल और 95% इथेनॉल में इसी प्रकार धोने दोहराएँ।
    3. व्यक्तिगत रूप से 60 मिनट के लिए पराबैंगनी विकिरण के साथ नसबंदी के बाद जैव सुरक्षा कैबिनेट में एक प्रयोगशाला सोख्ता कागज, पर उन्हें बाहर फैल द्वारा coverslips सूखी।
  3. एक 35 मिमी सेल संस्कृति डिश में 2-4 सूखी coverslips के रखें। सेल संस्कृति पीबीएस में 25 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल के एक एकाग्रता के लिए इंजीनियर बहुलक (1 मिलीग्राम / एमएल के शेयर एकाग्रता) जैसे फ़ाइब्रोनेक्टिन का समाधान या फ़ाइब्रोनेक्टिन पतला।
    1. प्रत्येक coverslip पर पतला समाधान की 80-100 μl प्लेस और कोट करने के लिए 60 मिनट coverslip के शीर्ष पक्ष के लिए सेते हैं। पूरा मध्यम जोड़ने से पहले पीबीएस का उपयोग करते हुए तीन बार coverslips धो लें।

2. बढ़ कोशिकाओं और Proteasome inhibitors के साथ इलाज प्रकोष्ठों

  1. पैसेज 2 एक्स 10 5 asynchronously बढ़नेप्रत्येक 35 मिमी पकवान में आईएनजी RPE1 कोशिकाओं coverslips युक्त और 2 मिलीलीटर पूरा मध्यम में कोशिकाओं को विकसित। संस्कृति के माध्यम से नए सिरे से पूर्व गर्म पूरा मध्यम के साथ हर 24 घंटा बदलें।
    1. परीक्षण प्रोटीन की centrosomal स्तर पर Proteasome निषेध के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए (यहाँ VDAC3 या γ ट्यूबिलिन), 44 घंटा के लिए दो 35 मिमी बर्तन में कोशिकाओं को विकसित। पूरा मध्यम के साथ संस्कृति के माध्यम से बदलें और क्रमशः 5 माइक्रोन या 0.05% की एक अंतिम एकाग्रता में नियंत्रण विलायक के रूप में MG115 या DMSO के या तो जोड़ें। एक ही समय में, 4 घंटे के लिए कोशिकाओं 40 माइक्रोन का एक अंतिम एकाग्रता में कोशिकाओं को BrdU जोड़ने और सेते हैं।
    2. 24 अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक coverslip स्थानांतरण। अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 500 μl ठंडा मेथनॉल जोड़ें और 10 मिनट coverslips पर कोशिकाओं को ठीक करने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं। इसके तत्काल बाद coverslips के 500 μl धो बफर के साथ तीन बार धोने (0.5 मिमी 2 MgCl और 0.05% युक्त 1x पीबीएस ट्राइटन-x 100)।
  2. अवशिष्ट फसल35 मिमी पकवान और अपकेंद्रित्र 5 मिनट के लिए 1,000 XG पर कोशिकाओं से कोशिकाओं। पश्चिमी सोख्ता (6.) द्वारा कुल प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए सेल गोली का प्रयोग करें।

3. BrdU के नाड़ी और चेस परख अलग सेल साइकिल चरण में प्रोटीन का स्तर विश्लेषण करने के लिए

  1. 44 घंटे के लिए coverslips युक्त दो 35 मिमी बर्तन में कोशिकाओं को विकसित, सेल चक्र के विभिन्न चरणों में centrosomes पर एक प्रोटीन (यहाँ VDAC3, Sas6 या Cep135) के स्तर की भिन्नता का विश्लेषण करने के लिए। 40 माइक्रोन BrdU युक्त पूरा मध्यम के साथ संस्कृति के माध्यम से बदलें और सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 4 घंटे के लिए कोशिकाओं सेते हैं।
  2. एक पकवान से, कदम 2.1.2 में वर्णित के रूप में ठंडा मेथनॉल का उपयोग कोशिकाओं को ठीक करने के लिए एक 24 अच्छी तरह से थाली करने के लिए coverslips के हस्तांतरण।
  3. 4 घंटा BrdU के नाड़ी के बाद, BrdU युक्त मध्यम हटाने पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धोने और पूरा मध्यम के साथ एक बार, विभिन्न समय (आमतौर पर एक और 4 घंटे के लिए BrdU के अभाव में कोशिकाओं ताजा मध्यम जोड़ने, और फिर बढ़नेकदम 2.1.2 में वर्णित के रूप में कोशिकाओं को तय करने से पहले RPE1 कोशिकाओं) के लिए।
    नोट: RPE1 कोशिकाओं के लिए, BrdU के पॉजिटिव कोशिकाओं के बहुमत एक चार घंटा पीछा करने के बाद देर हो चुकी है या G2 के चरण में हैं। यह प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए स्वतंत्र रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए।

4. Immunostaining

  1. 30 मिनट के लिए (1x पीबीएस में 2% BSA और 0.1% TritonX-100) बफर अवरुद्ध 200 μl में coverslips पर तय की कोशिकाओं को सेते हैं।
    1. प्राथमिक एंटीबॉडी का मिश्रण के साथ कोशिकाओं को सेते एक humidified कक्ष में 4 डिग्री सेल्सियस पर बफर हे / एन अवरुद्ध में पतला (आमतौर पर एक खरगोश में उठाया और एक अन्य माउस में उठाया)।
    2. एक humidified कक्ष बनाने के लिए, एक खाली 1000 μl विंदुक टिप बॉक्स के नीचे आधा में एक गीला कागज तौलिया डाल दिया। रैक सतह पर parafilm का एक पट्टी रखे और incubated होने के लिए प्रत्येक coverslip के लिए Parafilm पर एंटीबॉडी समाधान की एक छोटी बूंद (15-20 μl) हाजिर। एंटीबॉडी समाधान की एक छोटी बूंद पर एक coverslip उलटें (कोशिकाओं डूब रहे हैं कि इतनी) और करीबटिप बॉक्स के ढक्कन।
    3. फिर coverslips के पलटना और 24 अच्छी तरह से पकवान के लिए उन्हें वापस लौटने के लिए। Coverslips धोने और फिर आरटी पर 1 घंटे के लिए (हरी फ्लोरोसेंट डाई संयुग्मित विरोधी खरगोश और लाल फ्लोरोसेंट डाई संयुग्मित विरोधी माउस अवरुद्ध बफर में पतला यहाँ) 150 μl माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण में उन्हें सेते हैं। Coverslips के तीन बार धोएं।
      नोट: फ्लोरोफोरे संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी प्रकाश के प्रति संवेदनशील हैं। चरणों के दौरान प्रकाश से नमूनों की रक्षा 4.1.3-5.1.2।
  2. कदम 2.1.2 में वर्णित के रूप में, 10 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस से कम 500 μl ठंडा मेथनॉल के साथ फिर से सना हुआ RPE1 कोशिकाओं फिक्सिंग से विरोधी BrdU धुंधला के लिए तैयार करें। तीन बार coverslips धो लें।
    नोट: यह निर्धारण निम्नलिखित कदम में एसिड hydrolysis प्रक्रिया के दौरान ब्याज की प्रोटीन (एस) के प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी लेबलिंग सुरक्षित करता है।
    1. आरटी पर 30 मिनट के लिए 2 एन एचसीएल के 200 μl में कोशिकाओं को सेते हैं। 1 एम Tris-CL के 300 μl, पीएच 8 एक साथ बेअसरकोशिकाओं को धो बफर का उपयोग तीन बार धोने चाहते हैं।
    2. फिर आरटी पर 30 मिनट के लिए बफर अवरुद्ध 200 μl का उपयोग कोशिकाओं ब्लॉक।
    3. एक humidified कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए (बफर अवरुद्ध में पतला) चूहा विरोधी BrdU एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को सेते हैं। , 24 अच्छी तरह से पकवान वापस करने के लिए coverslips के लौटें उन्हें धोने और फिर आरटी पर 1 घंटे के लिए 24 अच्छी तरह से थाली में बफर अवरुद्ध 150 μl में पतला नीली फ्लोरोसेंट डाई संयुग्मित विरोधी चूहा माध्यमिक एंटीबॉडी (साथ सेते हैं।
  3. Coverslips के तीन बार धोएं। एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड पर antifade अभिकर्मक युक्त बढ़ते समाधान की एक छोटी बूंद (लगभग 3-6 μl) हाजिर। सेल की ओर बढ़ते समाधान पर, नीचे का सामना करना पड़ के साथ, एक coverslip उलटें। धीरे नरम सफाई ऊतक का उपयोग स्लाइड के खिलाफ coverslip दबाकर अतिरिक्त तरल साफ कर लें। खुर्दबीन स्लाइड पर इसे सील करने coverslip की बढ़त के साथ पारदर्शी नेल पॉलिश लागू करें।

5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवि acquisition और विश्लेषण

  1. परिवेश के तापमान पर BrdU के पॉजिटिव RPE1 कोशिकाओं की छवियों को प्राप्त करने के लिए (1.4 संख्यात्मक एपर्चर के साथ) एक 100X योजना ए पी ओ तेल विसर्जन उद्देश्य का प्रयोग करें।
    1. डिजिटल इमेजिंग के लिए सक्षम एक कैमरा के साथ संलग्न माइक्रोस्कोप (उपकरण देखें) पर एक स्लाइड रखो। प्रत्येक फ्लोरोफोरे के लिए, मैन्युअल रूप से एक प्रयोग के सभी नमूनों का परीक्षण करके (आमतौर पर 300-1,000 मिसे के बीच) उचित जोखिम समय निर्धारित करते हैं। एक सेल की छवियों को प्राप्त करने से पहले, मैन्युअल रूप से जेड अक्ष (आमतौर पर 0.2 माइक्रोन कदम आकार) के साथ उचित ऊपर और नीचे फोकल हवाई जहाज़ का निर्धारण। एक डिजिटल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग जेड अक्ष के साथ अलग fluorophores के लिए समान जोखिम समय का उपयोग कर अलग coverslips पर कर रहे हैं कि विभिन्न नमूनों की छवियों मोल।
  2. जेड अक्ष के साथ अधिग्रहीत सभी छवि के ढेर (कोई पड़ोसी एल्गोरिथ्म का उपयोग कर इन मामलों में) deconvolution के प्रदर्शन करना।
    1. साथ प्रत्येक छवि ढेर की कुल तीव्रता प्रक्षेपण प्राप्तजेड अक्ष।
  3. Centrosomes (दो centrosomes के बीच की दूरी कम से कम 2 माइक्रोन है) बंद कर रहे हैं, जहां कोशिकाओं में, दोनों centrosomes के चारों ओर एक छोटा सा वर्ग (पक्ष के अनुसार आम तौर पर 20-30 पिक्सल) आकर्षित और चयनित क्षेत्र के निशान।
    1. पहले वर्ग के आसपास के एक बड़े वर्ग (पक्ष के अनुसार आम तौर पर 24-35 पिक्सल) ड्रा और बड़े वर्ग के चयनित क्षेत्र के निशान।
    2. क्षेत्र (ए) और प्रत्येक बॉक्स में प्रत्येक फ्लोरोफोरे की कुल प्रतिदीप्ति तीव्रता (एफ) प्राप्त (एस छोटे से बॉक्स अर्थ और एल बड़ी बॉक्स अर्थ)।
    3. । हॉवेल एट अल 29 द्वारा वर्णित सूत्र का उपयोग कर प्रत्येक फ्लोरोफोरे की पृष्ठभूमि को सही प्रतिदीप्ति तीव्रता का विश्लेषण करें: एफ = एफ एस - [(एफ एल - एफ एस) ए एस / (ए एल - ए एस) x]।
    4. अपने फ्लोरिडा की पृष्ठभूमि को सही प्रतिदीप्ति तीव्रता के अनुपात की गणना के द्वारा ब्याज (यहाँ VDAC3 या Sas6) के प्रोटीन की सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता प्राप्त(यहाँ γ ट्यूबिलिन, Sas6 या Cep135) चुना आंतरिक मानक के लिए इस्तेमाल किया फ्लोरोफोरे की है कि uorophore।
  4. Centrosomes अच्छी तरह से अलग हो रहे हैं, जहां कोशिकाओं का विश्लेषण करने के मामले में, बक्से के दो अलग-अलग सेट ड्राइंग द्वारा अलग से प्रत्येक सेंट्रोसोम विश्लेषण (दो centrosomes के बीच की दूरी अधिक से अधिक 2 माइक्रोन से अधिक है)। प्रत्येक सेंट्रोसोम के चारों ओर एक छोटा सा वर्ग (पक्ष के अनुसार आम तौर पर 15-25 पिक्सल) ड्रा और चयनित क्षेत्र के निशान। पहले वर्ग के आसपास के एक बड़े वर्ग (पक्ष के अनुसार 20-30 पिक्सल) ड्रा और चयनित क्षेत्र के निशान।
    1. क्षेत्र (ए) और प्रत्येक बॉक्स में प्रत्येक फ्लोरोफोरे की कुल प्रतिदीप्ति तीव्रता (एफ) प्राप्त है, और कदम 5.3.3 में वर्णित के रूप में, प्रत्येक सेंट्रोसोम के लिए अलग से, प्रत्येक फ्लोरोफोरे की पृष्ठभूमि को सही प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना।
    2. उस कक्ष में उस प्रोटीन की कुल centrosomal स्तर प्राप्त करने के लिए दो centrosomes से प्रत्येक प्रोटीन की पृष्ठभूमि को सही प्रतिदीप्ति तीव्रता का मिश्रण।
    3. प्राप्त करनाआंतरिक मानक की कुल centrosomal तीव्रता करने के लिए अपने कुल centrosomal तीव्रता के अनुपात की गणना के द्वारा ब्याज की प्रोटीन के लिए सामान्यीकृत तीव्रता।
  5. प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए कम से कम 15-25 कोशिकाओं का विश्लेषण और एक स्प्रेडशीट में ग्राफ साजिश है।

6. पश्चिमी सोख्ता का प्रयोग कुल प्रोटीन का विश्लेषण

  1. 50 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 8, 150 मिमी NaCl, 1% Nonidet पी-40, 1% सोडियम deoxycholate, 0.1% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) युक्त (RIPA) बफर radioimmunoprecipitation परख में कोशिकाओं Resuspend और बर्फ पर 10 मिनट के लिए सेते कोशिकाओं lyse करने के लिए।
    1. , 10 मिनट के लिए 10,000 XG पर मिश्रण अपकेंद्रित्र गोली अंश से lysate अलग और एक bicinchoninic एसिड (बीसीए) परख किट का उपयोग कर प्रत्येक lysate के कुल प्रोटीन एकाग्रता को मापने।
  2. 4x एसडीएस पृष्ठ लोड हो रहा है बफर (50 मिमी Tris-CL, पीएच 6.8, 2% एसडीएस, 10% ग्लिसरॉल, 100 मिमी dithiothreitol, 0.1% ब्रोम के साथ lysate के 40 माइक्रोग्राम प्रति मिक्स) नीले ophenol।
    1. 10 मिनट के लिए नमूने उबाल लें और 200 वी के एक निरंतर वोल्टेज में एसडीएस पृष्ठ denaturing एक 12.5% ​​पर नमूने को चलाने
  3. (ठंड में 1 घंटे के लिए 90 वी की एक निरंतर वोल्टेज में) पश्चिमी सोख्ता तकनीक का उपयोग कर एक nitrocellulose झिल्ली पर एसडीएस पृष्ठ पर अलग प्रोटीन स्थानांतरण।
    1. 1x पीबीएस में 3% गैर वसा दूध के साथ झिल्ली ब्लॉक, और फिर एक के लिए (इस मामले खरगोश विरोधी VDAC3, खरगोश विरोधी γ ट्यूबिलिन और माउस विरोधी α ट्यूबिलिन में) पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के समाधान के साथ झिल्ली सेते आरटी पर घंटा।
    2. झिल्ली पीबीएस टी बफर का उपयोग तीन बार (झटकों के तहत प्रत्येक 5 मिनट ऊष्मायन) धोने के बाद (1x पीबीएस और 0.2% बीच 20), लगभग अवरक्त (आईआर) फ्लोरोसेंट डाई संयुग्मित विरोधी खरगोश का एक मिश्रण में झिल्ली सेते हैं और 1 घंटे के लिए (पीबीएस टी में पतला) आईआर फ्लोरोसेंट डाई संयुग्मित विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी।
    3. झिल्ली तीन बार धोएं और फिर एक अवरक्त एफ का उपयोग कर बैंड का विश्लेषण करने की झिल्ली को स्कैनimmunoblot का पता लगाने के लिए उपयुक्त luorescence इमेजिंग प्रणाली।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

हमारे हाल के अध्ययनों से VDAC3, माइटोकॉन्ड्रियल porins 16,28 में से एक के उपन्यास centrosomal स्थानीयकरण और समारोह की पहचान की। एक VDAC3 विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर RPE1 कोशिकाओं सहित कई स्तनधारी कोशिकाओं के immunostaining प्रमुख centrosomal धुंधला और अपेक्षाकृत कमजोर माइटोकॉन्ड्रियल धुंधला दिखाया। हम यह भी centrosomal VDAC3 अधिमान्यतया मां तारककेंद्रक, और अंतर्जात दोनों की centrosomal पूल के साथ जुड़े और ectopically VDAC3 गिरावट 16 से नियंत्रित किया जाता है व्यक्त की है कि पता चला है। मात्रात्मक IIF परख को मान्य करने के क्रम में हम एस चरण में हैं कि कोशिकाओं में सेंट्रोसोम जुड़े VDAC3 पूल में परिवर्तन की जांच की।

इधर, asynchronously बढ़ रही RPE1 कोशिकाओं Proteasome अवरोध करनेवाला MG115 या 4 घंटे के लिए नियंत्रण विलायक DMSO के साथ या तो इलाज किया गया। एस चरण और सेंट्रोसोम विधानसभा के दौर से गुजर में हैं कि कोशिकाओं के लिए हमारे विश्लेषण को प्रतिबंधित करने के लिए, हम केवल BrdU डु निगमित कि कोशिकाओं की जांच कीएक ही 4 घंटा अंगूठी और (एक दूसरे के 2 माइक्रोन के भीतर स्थान दिया गया है) के दो निकट दूरी centrosomes था। हम MG115 का संक्षिप्त उपचार BrdU समावेश उपचार नियंत्रण की तुलना में (लगभग 58%) को प्रभावित नहीं किया है कि समाप्त करने के लिए दोनों नियंत्रण और MG115 उपचार (चित्रा 1 ए) से BrdU के लिए दाग कोशिकाओं और नाभिक के कई यादृच्छिक क्षेत्रों की जांच की (लगभग 56%) RPE1 कोशिकाओं में। हम (एक दूसरे के 2 माइक्रोन के भीतर दूरी पर दो γ ट्यूबिलिन foci के उपस्थिति द्वारा न्याय के रूप में) एस चरण में थे कि केवल कोशिकाओं की तुलना थे के रूप में, हम सामान्य बनाने के लिए एक संभावित आंतरिक मानक के रूप में γ ट्यूबिलिन माना जाता है। BrdU के पॉजिटिव कोशिकाओं में centrosomal γ ट्यूबिलिन स्तरों Proteasome निषेध पर भिन्न हो इस प्रकार, यदि हम पहले की जांच की। आश्चर्य नहीं कि वहाँ एक सेल से दूसरे γ ट्यूबिलिन प्रतिदीप्ति तीव्रता में काफी सेल करने वाली सेल बदलाव किया गया था, और हम इस बदलाव का सबसे अच्छा एक पूरे के रूप में उपलब्ध डेटा सेट है कि वर्तमान बॉक्स और गलमुच्छा चित्र में प्रस्तुत किया गया था कि पाया। मेँएन बॉक्स और गलमुच्छा चित्र, बक्से निचले और ऊपरी चतुर्थक का प्रतिनिधित्व करते हैं, बॉक्स में मार्कर प्रत्येक श्रृंखला के औसत को इंगित करता है, और मूंछ (हालांकि नहीं हमेशा) अक्सर outliers हैं कि न्यूनतम और अधिकतम मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं। चित्रा -1 में देखा, centrosomal γ ट्यूबिलिन स्तर इस प्रकार इस प्रयोग के लिए एक आंतरिक मानक के रूप में γ ट्यूबिलिन मान्य MG115 या DMSO के साथ या तो इलाज किया BrdU के पॉजिटिव कोशिकाओं के बीच काफी अलग नहीं था। ट्यूबिलिन γ के विपरीत, centrosomal VDAC3 को इसी पृष्ठभूमि को सही प्रतिदीप्ति तीव्रता नियंत्रण कोशिकाओं (चित्रा 1C) की तुलना में MG115 इलाज कोशिकाओं में उच्च 2.5 गुना मोटे तौर पर किया गया था। हम γ ट्यूबिलिन की उस के खिलाफ कुल VDAC3 प्रतिदीप्ति सामान्यीकृत करते हैं, गुना वृद्धि मोटे तौर पर दो गुना (चित्रा 1E) के लिए थोड़ा गिरा दिया। गुना परिवर्तन सामान्य बनाने के बिना अधिक से अधिक था, हम हम bett महसूस जो सामान्यीकृत डेटा की सटीकता में अधिक विश्वास हैकारण नमूना प्रसंस्करण के लिए MG115 उपचार, साथ ही भिन्नता के किसी भी सामान्य प्रभाव के लिए एर नियंत्रित करता है। गैर centrosomal साइटों (चित्रा 1 बी) या VDAC3 (चित्रा 1F) की कुल सेलुलर स्तर पर VDAC3 धुंधला Proteasome निषेध से प्रभावित नहीं था। इस प्रकार, हम मात्रात्मक VDAC3 की centrosomal पूल Proteasome की मध्यस्थता गिरावट द्वारा नियंत्रित किया जाता है कि हमारे पिछले प्रेक्षण सत्यापित करें।

सेल चक्र के दौरान centrosomal VDAC3 में परिवर्तन को मापने के लिए आदेश में हम लेबल की कोशिकाओं के एक 4 घंटा पीछा के बाद 4 घंटा BrdU के नाड़ी के साथ कोशिकाओं में चिह्नित किया है। चूंकि केवल एस चरण कोशिकाओं नाड़ी दौरान BrdU को शामिल करेंगे, देर एस चरण या जल्दी G2 के चरण या तो कम हो जाएगा 4 घंटा पीछा करने के बाद BrdU के पॉजिटिव RPE1 कोशिकाओं के बहुमत ((दो centrosomes के बीच औसत दूरी ± 0.16 माइक्रोन 1.35 है) दो centrosomes के बीच औसत दूरी देर G2 के चरण में एक नाबालिग आबादी के साथ) 1.55 ± 0.22 माइक्रोन है जहां सेंट्रोकुछ जोड़ी काफी 30 (दो centrosomes> 2 माइक्रोन के बीच औसत दूरी) अलग किया है। γ ट्यूबिलिन, एक प्रमुख पीसीएम घटक बहुत G2 के चरण 31,32 में जगह लेता है, और इस वृद्धि इसे अन्य centrosomal प्रोटीन की कोशिका चक्र विविधताओं का आकलन करने के लिए एक गरीब आंतरिक मानक बना देता है कि सेंट्रोसोम परिपक्वता के दौरान centrosomes पर जम जा रहा है। दूसरी ओर, Sas6 cartwheels 4,5,7 की विधानसभा को प्रोत्साहित करने के लिए जल्दी एस चरण के दौरान procentrioles के लिए भर्ती किया गया है, और यह (चित्रा 2 अपमानित किया जा करने के लिए शुरू होता है जब कोशिकाओं पिंजरे का बँटवारा दर्ज जब तक नवगठित centrioles के आधार पर बनी हुई है और संदर्भ 5)। कोशिकाओं G2 के चरण से 5 एस चरण से प्रगति के रूप में हालांकि, हेला या U2OS कोशिकाओं में, Sas6 की centriolar स्तर धीरे-धीरे बढ़ जाती है। इसलिए, हम पहले Cep135, centrioles के समीपस्थ सिरों भर के लिए localizes कि एक और कोर centriolar प्रोटीन की है कि सम्मान के साथ centrosomal Sas6 स्तर मापासेल चक्र 33। Centrosomes निकट दूरी पर कर रहे हैं जब हम (चित्रा 3 ए-डी नाड़ी या चेस, से BrdU के पॉजिटिव RPE1 कोशिकाओं में Cep135 या Sas6 की पृष्ठभूमि को सही कुल प्रतिदीप्ति तीव्रता में कोई महत्वपूर्ण अंतर का पालन नहीं किया, दोनों के बीच 'करीब' कोशिकाओं जहां औसत दूरी centrosomes कम से कम 2 माइक्रोन) है। तदनुसार, सामान्यीकृत Sas6 स्तर इन कोशिकाओं (चित्रा 3E) में इसी तरह बने रहे। हालांकि, हम Sas6 के समग्र प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्यों में एक मामूली वृद्धि हुई है और (; 'दूर' कोशिकाओं दो centrosomes> 2 माइक्रोन के बीच की दूरी) centrosomes अच्छी तरह से अलग हो रहे हैं, जहां कोशिकाओं में Cep135 के लिए उसी के एक मामूली वृद्धि मनाया। तदनुसार, दो अच्छी तरह से अलग centrosomes के साथ कोशिकाओं में सामान्यीकृत कुल centrosomal Sas6 स्तर से थोड़ा था, लेकिन निकट दूरी centrosomes के साथ कोशिकाओं में है कि अधिक से सांख्यिकीय काफी अधिक है। इस वजह से Sas6 स्तर बुद्धि के निहित विनियमन की संभावना हैएच कोशिका चक्र प्रगति 5। हालांकि, यह मामूली वृद्धि (जो या कम सांख्यिकीय महत्व का) निकट दूरी centrosomes के साथ कोशिकाओं में एक ही समय में दो centrosomes का विश्लेषण करने की तुलना में अलग से विश्लेषण किया गया है कि दो centrosomes की प्रतिदीप्ति तीव्रता जोड़ने की वजह से कर रहे हैं कि यह भी संभव है। VDAC3 की प्रतिदीप्ति तीव्रता अकेले Sas6 की है कि सामान्यीकृत था जब बहरहाल, दो निकट दूरी centrosomes पर VDAC3 स्तर जल्दी एस चरण की तुलना में देर से एस / जल्दी G2 के चरण में हैं कि कोशिकाओं में लगभग 1.5 गुना बढ़ा दिया गया था कोशिकाओं (चित्रा -4 ए-सी, एफ, 'बंद' कोशिकाओं)। इन कोशिकाओं को देर G2 के चरण के लिए प्रगति करते हैं, तो दो centrosomes पर सामान्यीकृत VDAC3 स्तर देर एस चरण (चित्रा 4C, एफ) में उस की तुलना में 2.4 गुना से कम हो गया था।

Sas6 स्तरों देर एस चरण से G2 के लिए थोड़ा बढ़ा है, क्योंकि एक आंतरिक मानक के रूप में Sas6 का उपयोग करते हुए दिसम्बर की एक छोटी सी overestimation की ओर जाता हैदेर G2 के चरण कोशिकाओं में VDAC3 स्तर में rease (centrosomes अधिक से अधिक 2 माइक्रोन से अलग होती है)। हमारे डेटा Cep135 एक बेहतर विकल्प सेल चक्र विविधताओं का आकलन करने के लिए एक आंतरिक मानक के रूप में सुझाव है कि एक ओर जहां हमारे पास उपलब्ध VDAC3 और Cep135 एंटीबॉडी दोनों खरगोश से कर रहे हैं, क्योंकि हम VDAC3 के लिए इसका इस्तेमाल नहीं कर सकते। हालांकि, Cep135-सामान्यीकृत Sas6 के औसत मूल्य से Sas6-सामान्यीकृत VDAC3 (एफ VDAC3 / एफ Sas6) के लिए औसत मूल्य गुणा हमें Cep135-सामान्यीकृत VDAC3 [(एफ VDAC3 / एफ Sas6) एक्स के लिए एक अनुमानित मूल्य (एफ Sas6 / देता है एफ Cep135) = एफ VDAC3 / एफ Cep135]। हम इस विश्लेषण, देर हो चुकी है / जल्दी G2 और देर G2 के बीच VDAC3 के स्तर में परिवर्तन का प्रदर्शन किया जब दो गुना करने के लिए थोड़ा चला जाता है। गाढ़ा क्रोमोसोम और कमजोर Sas6 धुंधला द्वारा न्याय के रूप में पिंजरे का बँटवारा के किसी भी चरण में हैं कि BrdU के पॉजिटिव कोशिकाओं के कारण Sas6 के स्तर में काफी कमी करने के लिए, हमारे विश्लेषण से बाहर रखा गया है। हालांकि, हम उल्लेख किया है कि centrosomal VDAC3 स्तर पुनःपिंजरे का बँटवारा दौरान कम mained (डेटा) नहीं दिखाया। Cep135 स्तरों पिंजरे का बँटवारा दौरान ड्रॉप नहीं है क्योंकि (नहीं दिखाया डेटा), हम सिद्धांत में सूत्रीविभाजन में Cep135-सामान्यीकृत VDAC3 के स्तर का अनुमान लगाने के लिए फिर से सामान्य बनाने की प्रक्रिया दोहरा सकता है। लेकिन, वास्तव में पिंजरे का बँटवारा में centrosomal Sas6 स्तरों पहली जगह में Sas6-सामान्यीकृत VDAC3 के स्तर का सही निर्धारण के लिए अनुमति देने के लिए भी चर रहे थे। भले ही, कुल मिलाकर, हमारे डेटा VDAC3 की centrosomal पूल सेल चक्र के दौरान centrosomes पर विनियमित सत्यापित है कि।

चित्रा 1
चित्रा 1. asynchronously बढ़ रही RPE1 कोशिकाओं 4 घंटे के लिए BrdU और MG115 (एमजी) या DMSO के (डीएम) के साथ incubated रहे थे। (ए) दिखाए विरोधी BrdU एंटीबॉडी (लाल) और Hoechst (साथ दाग यादृच्छिक इलाज किया DMSO के या MG115 के क्षेत्रों कोशिकाओं रहे हैं डीएनए, नीला)। यहाँ और अन्य सभी छवियों में बार 5 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं।(इ) DMSO के या MG115 कोशिकाओं VDAC3, γ ट्यूबिलिन और BrdU के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे इलाज किया। BrdU के पॉजिटिव कोशिकाओं समान इमेजिंग शर्तों के तहत imaged थे (जोखिम नीले फ्लोरोफोरे / BrdU के लिए 400 मिसे times-, हरी फ्लोरोफोरे / VDAC3 के लिए 500 मिसे, लाल फ्लोरोफोरे / γ ट्यूबिलिन के लिए 300 मिसे), और पृष्ठभूमि VDAC3 की प्रतिदीप्ति तीव्रता और सही γ ट्यूबिलिन निर्धारित किया गया है। VDAC3 दिखा प्रतिनिधि छवियों (VD3, हरा), γ ट्यूबिलिन (γ-टब, लाल) और BrdU (नीला) (बी) में दिखाया जाता है। वर्गों द्वारा संकेत के रूप में यहाँ और अन्य सभी छवियों में, insets के डिजिटल centrosomes बढ़ाया दिखा। पृष्ठभूमि को सही प्रतिदीप्ति तीव्रता (एफ, मनमाना इकाइयों में) पच्चीस कोशिकाओं से VDAC3 और γ ट्यूबिलिन के लिए इसी क्रमशः बॉक्स और गलमुच्छा (सी) में चित्र और (डी) में प्लॉट किए जाते हैं। यहाँ और अन्य सभी मामलों में, बक्से, मा निचले और ऊपरी चतुर्थक का प्रतिनिधित्व(-) बॉक्स में rker प्रत्येक श्रृंखला के औसत को इंगित करता है, और मूंछ न्यूनतम और अधिकतम मूल्यों का प्रतिनिधित्व। उन पच्चीस कोशिकाओं से VDAC3 की सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्यों (ई) में प्लॉट किए जाते हैं। (सीई) के लिए, पी मूल्य अयुगल टी परीक्षण से प्राप्त होता है। *** पी इंगित करता है <10 -5, और एन एस पी इंगित करता है> 0.05। (एफ) α ट्यूबिलिन (α-टब) नियंत्रण लोड हो रहा है जहां VDAC3 (VDAC3a और VDAC3b 16 दोनों) और γ ट्यूबिलिन (γ-टब) के पूरे सेल के स्तर दिखा Immunoblots। इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें आंकड़ा।

चित्रा 2
4 घंटा br साथ लेबल रहे थे कि चित्रा 2. asynchronously बढ़ रही RPE1 कोशिकाओं(γ-टब, लाल) ड्यू नाड़ी और BrdU के अभाव में एक और 4 घंटे के लिए पीछा किया Sas6 (हरा) और γ ट्यूबिलिन के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे। छवियों प्रतिनिधि दो करीबी के साथ ((ए) एस चरण के दौरान Sas6 धुंधला दिखाने Sas6 foci), (ख) मेटाफ़ेज़ (ध्रुवों पर दो कमजोर Sas6 foci) और (सी) telophase (Sas6 foci के डंडे से खो रहे हैं)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3
400 मिसे times- Cep135 और Sas6 के लिए दाग चित्रा 3. asynchronously बढ़ रही RPE1 कोशिकाओं BrdU के अभाव में एक और 4 घंटे के लिए एक 4 घंटा BrdU के नाड़ी के साथ लेबल और पीछा कर रहे थे। BrdU के पॉजिटिव कोशिकाओं समान इमेजिंग शर्तों के तहत imaged थे (जोखिमनीले फ्लोरोफोरे / BrdU के लिए; हरी फ्लोरोफोरे / Cep135 के लिए 400 मिसे; लाल फ्लोरोफोरे / Sas6), और Sas6 और Cep135 की पृष्ठभूमि को सही प्रतिदीप्ति तीव्रता के लिए 500 मिसे निर्धारित किया गया है। दो centrosomes के बीच की दूरी भी सभी कोशिकाओं में मापा गया था। दो centrosomes के बीच की दूरी कम से कम 2 माइक्रोन है, जहां एक सेल 'बंद' और मूल्य है, जहां अधिक से अधिक 2 माइक्रोन 'दूर' के रूप में वर्गीकृत किया गया था के रूप में माना जाता था। (अटल बिहारी) Cep135 (C135, हरा) दिखा छवियों प्रतिनिधि, Sas6 (लाल) और BrdU (नीला) दिखाए जाते हैं। (बी) में, सी 1 और सी 2 प्रतिनिधि 'दूर' सेल के दो centrosomes हैं। (सीडी) पृष्ठभूमि को सही प्रतिदीप्ति तीव्रता (एफ, मनमाना इकाइयों में) प्रत्येक श्रेणी के पंद्रह कोशिकाओं से Sas6 (सी) और Cep135 (डी) के लिए इसी बॉक्स और गलमुच्छा चित्र में प्लॉट किए जाते हैं। (ई), fro Sas6 की सामान्यीकृत तीव्रताओंएम उन कोशिकाओं बॉक्स और गलमुच्छा चित्र में प्लॉट किए जाते हैं। (सीई) के लिए, पी मूल्य अयुगल टी परीक्षण से प्राप्त होता है। * 0.001 <पी <0.05 इंगित करता है, और एन एस पी> 0.05 इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
हरी फ्लोरोफोरे / Sas6 के लिए 500 मिसे, नीले फ्लोरोफोरे / BrdU के लिए 400 मिसे times- VDAC3 और Sas6 के लिए दाग चित्रा से ऊपर BrdU के नाड़ी-पीछा परख से 4. BrdU के पॉजिटिव कोशिकाओं (चित्रा 3) समान इमेजिंग शर्तों के तहत imaged थे (जोखिम; 1,000 लाल फ्लोरोफोरे / VDAC3 के लिए मिसे), और Sas6 और VDAC3 की पृष्ठभूमि को सही प्रतिदीप्ति तीव्रता दो centrosomes के बीच की दूरी सभी कोशिकाओं में मापा गया था, और कोशिकाओं 'सी के रूप में वर्गीकृत किया गया। निर्धारित किया गया है'(दो centrosomes <और 2 माइक्रोन के बीच की दूरी)' दूर 'चित्रा 3 के रूप में, (2 माइक्रोन दो centrosomes के बीच की दूरी>)। (एसी) के प्रतिनिधि छवियों' BrdU के नाड़ी (ए) में करीब 'सेल में खोना BrdU चेस (बी), और VDAC3 के लिए दाग BrdU पीछा (सी) में 'दूर' सेल (VD3, हरा), Sas6 (लाल) और BrdU (नीला) दिखाए जाते हैं। (ग) में, सी 1 और सी 2 दो centrosomes हैं। [De] पृष्ठभूमि को सही प्रतिदीप्ति तीव्रता (एफ, मनमाना इकाइयों में) प्रत्येक श्रेणी के पंद्रह कोशिकाओं से VDAC3 (डी) और Sas6 (ई) के लिए इसी बॉक्स और गलमुच्छा चित्र में प्लॉट किए जाते हैं। उन कोशिकाओं से VDAC3 की (एफ) सामान्यीकृत तीव्रता बॉक्स और गलमुच्छा चित्र में प्लॉट किए जाते हैं। (लोमो) के लिए, पी मूल्य अयुगल टी परीक्षण से प्राप्त होता है। *** **, पी <10 -5 इंगित करता है10 -5 <पी <0.001 इंगित करता है, और एन एस पी> 0.05 इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

कोशिका जीव विज्ञान में मात्रात्मक माइक्रोस्कोपी आमतौर पर निश्चित लिए अलग मात्रात्मक माइक्रोस्कोपी assays के विकासशील सेल जीव विज्ञानियों की बढ़ती उदाहरण हैं, हालांकि आदि, photobleaching (FRAP) के बाद इस तरह के प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट), प्रतिदीप्ति वसूली के रूप में रहते सेल इमेजिंग assays के साथ जुड़ा हुआ है हाल के वर्षों 27,34-36 में कोशिकाओं। महत्वपूर्ण बात है, सेंट्रोसोम जीव विज्ञान को समझने में प्रगति अक्सर जिसका centrosomal पूल अन्य पूल की तुलना में अलग तरह से विनियमित किया जा सकता प्रोटीन की सेंट्रोसोम-विशेष समारोह की समझ की आवश्यकता है। इस प्रकार, हम विशेष रूप से दो अलग ढंग से इलाज के नमूने में एक प्रोटीन के रिश्तेदार centrosomal स्तर का विश्लेषण करने के लिए एक मात्रात्मक IIF परख विकसित किया है। यह कोशिकाओं तय की और अलग coverslips पर कार्रवाई की जाती है कि आवश्यकता है, इसलिए हम कारण दो experime से निपटने की आवश्यकता के लिए संभव कलाकृतियों के लिए बेहतर नियंत्रण के लिए सामान्य बनाने के उद्देश्य के लिए एक आंतरिक मानक शुरू कीntal सेल को अलग-अलग आबादी, और परख की सटीकता की वृद्धि। एक परीक्षण प्रोटीन के रिश्तेदार प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के लिए इस तरह के एक आंतरिक मानक का इस्तेमाल किया है कि कुछ पिछले अध्ययनों 37 ही कर रहे हैं।

एक आंतरिक मानक चुनने हमारे परख की सटीकता के लिए महत्वपूर्ण है, यह यकीनन सबसे चुनौतीपूर्ण पहलू है। आदर्श रूप में, एस चरण के दौरान तारककेंद्रक जोड़ी डुप्लिकेट, और दोहराया centrioles तो दो परिपक्व centrosomes mitotic धुरी के खंभे बन सकते हैं ताकि G2 के दौरान γ ट्यूबिलिन सहित अतिरिक्त पीसीएम घटकों संचित। इसलिए, हम γ ट्यूबिलिन की centrosomal स्तर एस चरण में सख्ती कर रहे हैं कि कोशिकाओं में काफी परिवर्तन नहीं होता है कि मान। यह एस चरण कोशिकाओं को एक संक्षिप्त BrdU लेबलिंग द्वारा चिह्नित कर रहे हैं, जहां RPE1 कोशिकाओं में मामला प्रतीत हो रहा है। हालांकि, एक आंतरिक मानक की वैधता प्रत्येक कोशिका के प्रकार और प्रयोगात्मक हालत के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, जबकि पृष्ठभूमि corrected VDAC3 प्रतिदीप्ति, भी अनुपूरक centrosomal γ ट्यूबिलिन में एक छोटी लेकिन महत्वपूर्ण सांख्यिकीय (0.001 <पी मूल्य <0.05) वृद्धि (वहाँ था (एस चरण को गिरफ्तार कर लिया) U2OS कोशिकाओं का इलाज किया aphidicolin में अवरोध Proteasome के जवाब में अधिक से अधिक दो गुना वृद्धि हुई चित्रा)। इस प्रकार, γ ट्यूबिलिन भी कोशिका चक्र में गिरफ्तार कर लिया है कि कोशिकाओं के लिए, हमेशा एक उचित आंतरिक नियंत्रण नहीं है।

अन्य सभी IIF माइक्रोस्कोपी परख के लिए इसी प्रकार, इस परख की कमियों के एक परीक्षण प्रोटीन और आंतरिक मानक के खिलाफ एंटीबॉडी अलग मेजबान प्रजातियों में उठाया जाना चाहिए। हमारे डेटा Cep135 Sas6 की तुलना में एक बेहतर आंतरिक मानक का सुझाव है कि एक ओर जहां, हम दोनों खरगोश में उठाया गया ये प्रोटीन के खिलाफ उपलब्ध एंटीबॉडी के रूप में Cep135 के खिलाफ VDAC3 स्तर मानक के अनुसार नहीं हो सका। इस प्रकार, हम देर एस चरण और G2 के बीच VDAC3 के स्तर में कमी का एक overestimation जिसके कारण Sas6, के खिलाफ बजाय सामान्यीकृत। जहां बौद्धिक स्थिति मेंrnal मानक एक है कि बदलाव के लिए खाते में एक और सामान्य कारक लागू कर सकते हैं, विनय बदलता रहता है। उदाहरण के लिए, Sas6 में बदलाव के लिए सही करने के लिए, हम Cep135-सामान्यीकृत Sas6 तीव्रता से Sas6-सामान्यीकृत VDAC3 तीव्रता गुणा।

एक उपयुक्त आंतरिक मानक चुनना मुश्किल है जहां मामलों में, फ्लोरोसेंट डाई लेपित microspheres (0.02-0.04 माइक्रोन व्यास) एक वैकल्पिक रणनीति प्रदान कर सकता है। ब्याज की सेल के रूप में एक ही क्षेत्र में मौजूद एक प्रतिदीप्ति microsphere के संकेत ब्याज की प्रोटीन के लिए इसी प्रतिदीप्ति संकेत सामान्य करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। परीक्षण और नियंत्रण कोशिकाओं को एक साथ imaged रहे हैं, तो दूसरी ओर, एक सामान्य बनाने के लिए इस तरह के एक आंतरिक मानक जरूरत नहीं हो सकती। हम पहले 19 को रोकने या 20 degr को बढ़ावा देने के जो या तो एक 19 या Antizyme 20, overexpressing या तो cyclin कोशिकाओं में Mps1 की centrosomal स्तर की तुलना करने के लिए इस परख के एक संस्करण का इस्तेमाल किया हैएक ही समय में imaged आसन्न untransfected कोशिकाओं में है कि करने के लिए क्रमशः centrosomes, पर Mps1 की adation।

Proteasome निषेध पर centrosomal VDAC3 के प्रभाव की जांच के क्रम में, हम एस चरण में हैं कि कोशिकाओं की पहचान और तुलना करने के लिए BrdU लेबलिंग का इस्तेमाल किया। MG115 उपचार कोशिका चक्र प्रगति को बाधित कर सकता है, इस निषेध एक काफी उच्च एकाग्रता इस अध्ययन में इस्तेमाल की अपेक्षा है कि 38 की आवश्यकता है। MG115 सेल चक्र चौकियों और संक्रमण ब्लॉक कर सकते हैं, लेकिन सेल चक्र प्रगति अवरुद्ध नहीं करता यहां इस्तेमाल सांद्रता में। हम MG115 DMSO के लिए की तुलना में BrdU सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत में परिवर्तन नहीं किया था कि दिखाकर यहां किया था लेकिन, जैसा कि, प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए सत्यापित किया जाना चाहिए। हालांकि, aphidicolin या hydroxyurea (एच यू) का उपयोग कर या 'बंद हिला' और रिहाई या डबल thymidine ब्लॉक और रिहाई के बराबर आबादी पैदा करने के लिए वैकल्पिक तरीकों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है mitotic का उपयोग कोशिकाओं तुल्यकालन एस चरण में कोशिकाओं को गिरफ्तारएस चरण में कोशिकाओं का माहौल।

सेल चक्र समय बिंदुओं का अध्ययन करने के BrdU के नाड़ी-पीछा रणनीति एक बेफिक्र सेल चक्र की आवश्यकता है कि कई कार्यात्मक assays में बहुत उपयोगी हो जाएगा। यह विभिन्न कोशिका चक्र अवरोधकों का उपयोग करते हुए सेल चक्र गिरफ्तारी तकनीकों को बदलने के लिए सक्षम हो सकता है कि एक जैविक रूप से अधिक महत्वपूर्ण परख है। इन अवरोधकों का उपयोग अक्सर सेल चक्र phenotypes में न्यायपालिका परिवर्तन के परिणामस्वरूप कोशिकाओं में शारीरिक तनाव के विभिन्न प्रकार के कारण हो सकता है। पल्स-पीछा दृष्टिकोण का उपयोग केवल पिछले अध्ययनों में 23 से सुझाव के रूप में एक पूरा ब्लॉक पैदा करने के लिए विरोध के रूप में तारककेंद्रक विधानसभा में 39 में देरी Cetn2 के उस कमी को प्रदर्शित करने के लिए हमें सक्षम होना चाहिए। BrdU के पॉजिटिव कोशिकाओं का पता लगाने के नमूनों की एसिड hydrolysis की आवश्यकता है। हम और कई अन्य शोधकर्ताओं ने पाया कि एक तकनीक का उपयोग कर रहे एडवेंचर्स के लिए धुंधला तीव्रता के तुच्छ हानि के साथ, परीक्षण प्रोटीन, पूर्व एसिड hydrolysis के लिए प्राथमिक और माध्यमिक धुंधला के बाद कोशिकाओं को फिर से ठीक करता हैसेंट्रोसोम प्रोटीन 40 T। हालांकि, एक संभावित विकल्प के डीएनए में 41 नकल करने में कुशलतापूर्वक शामिल किया BrdU के लिए इसी तरह 5-ethynyl-2'- deoxyuridine (edu) है, जो किसी अन्य thymidine अनुरूप, उपयोग करने के लिए हो सकता है। Edu रसायन शास्त्र क्लिक करें 'का उपयोग करने के दृश्य "एसिड hydrolysis 42 की आवश्यकता होती है, और कुछ एंटीबॉडी के लिए मई इसलिए अधिक उपयुक्त नहीं है।

इसके अलावा, इस परख आसानी से centrosomes में एक विशेष प्रोटीन के बाद translational संशोधनों में परिवर्तन को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, फास्फारिलीकरण के centrosomal स्तर फास्फारिलीकरण साइट-विशिष्ट एंटीबॉडी मौजूद है, बशर्ते कि प्रोटीन खुद की कुल स्तर के खिलाफ सामान्यीकृत किया जा सकता है। यह परख तुरंत प्रयोगात्मक शर्तों या सेल चक्र चरणों के बीच फास्फारिलीकरण के रिश्तेदार के स्तर का आकलन करने के लिए लागू किया जा सकता है, लेकिन संभावित फास्फारिलीकरण की कुल स्तरों का आकलन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है अगर महत्वपूर्ण पैरामीटर एंटीबॉडी affin कीities जाना जाता है या निर्धारित किया जा सकता है। ब्याज के क्षेत्र बहुत बड़ा नहीं होना चाहिए, हालांकि यह परख भी, कोशिकाओं में किसी अन्य स्थल पर प्रोटीन के अध्ययन के लिए लागू किया जाना चाहिए। परख कई सेलुलर स्थलों पर स्थानीय है कि एक प्रोटीन का स्थान-विशेष मॉडुलन को मापने के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो जाएगा।

इस तरह के माप 43 की सटीकता को अधिकतम करने के विचार में लिया जाना चाहिए कि आदि अंतर photobleaching, डिजिटल इमेजिंग के प्रभाव, fluorophores के प्रतिदीप्ति तीव्रता के linearity, पृष्ठभूमि शोर के रूप में तकनीकी मानकों की एक मुट्ठी भर रहे हैं। उदाहरण के लिए, एक photobleaching के योगदान का आकलन करने के लिए प्रत्येक माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ जुड़े fluorochrome के स्विच कर सकते हैं। कई अन्य मानकों में अच्छी तरह से एक समान इमेजिंग शर्तों (जोखिम समय, लाभ, कदम आकार, जेड के ढेर, आदि की संख्या) और प्रत्येक इमेजिंग समय में एक ही इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करता है अगर नियंत्रित किया जा सकता है। हम इस्तेमाल किया यद्यपिछवि deconvolution के प्रदर्शन करने के लिए हमारे परख भर नहीं, पड़ोसी एल्गोरिथ्म, इस परख चलने का विवश जैसे अन्य deconvolution एल्गोरिथ्म के साथ जोड़ा जा सकता है। हम भी सबसे सामान्य रूप से उपलब्ध छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रतिदीप्ति तीव्रता और दूरी के विश्लेषण के लिए उपकरण है, क्योंकि यह विभिन्न इमेजिंग सॉफ्टवेयर संकुल के किसी भी संख्या के लिए इस परख अनुकूलन के लिए आसान होना चाहिए कि ध्यान दें।

इस परख के लिए किसी भी प्रकार की कोशिका को लागू किया जाना चाहिए, और यहाँ कोशिकाओं की हमारी पसंद विशुद्ध सेंट्रोसोम जीव विज्ञान अनुसंधान के क्षेत्र में उनकी प्रासंगिकता, और centrosomal VDAC3 समारोह 16,28 के हमारे पिछले परीक्षाओं में उनके उपयोग पर आधारित है। हालांकि, नाड़ी-पीछा करने के लिए आंतरिक मानकों और उचित समय की वैधता प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए एस चरण, G2 है, या पिंजरे का बँटवारा में कोशिकाओं की पहचान करने के लिए। कुल मिलाकर, BrdU के नाड़ी-पीछा परख के साथ संयोजन में हमारे नव विकसित मात्रात्मक प्रतिदीप्ति तकनीक जटिल कई हल करने के लिए एक बहुत ही उपयोगी तरीका हो जाएगासेंट्रोसोम जीव विज्ञान में और कोशिका जीव विज्ञान के कई व्यापक पहलुओं में तंत्र।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibronectin Sigma F8141 Stock of 1 mg/ml in water
DMSO Sigma D2650
MG115 Sigma SCP0005 Stock of 10 mM in DMSO
BrdU Sigma B5002 Stock of 10 mM in DMSO
Anti-γ-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88) Sigma T 6557 1:200 in IIF blocking buffer 
Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal)  Aviva Systems Biology ARP35180-P050 1:50 in IIF blocking buffer, 1:1,000 in WB blocking buffer
Anti-Sas6 (mouse monoclonal)  Santa cruz biotechnology sc-81431 1:100 in IIF blocking buffer
Anti-Cep135 (rabbit polyclonal) Abcam ab-75005 1:500 in IIF blocking buffer
Anti-BrdU (rat monoclonal)  Abcam ab6326 1:250 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Life technologies A21093 1:200 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technologies A21202 1:1,000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technologies A21203 1:1,000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Life technologies A21206 1:1,000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Life technologies A21207 1:1,000 in IIF blocking buffer
Anti-γ-tubulin (rabbit polyclonal) Sigma T5192 1:1,000 in WB blocking buffer
Anti-α-tubulin (mouse monoclonal, DM1A) Sigma T9026 1:20,000 in WB blocking buffer
Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Life technologies A10043 1:10,000 in WB blocking buffer
Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW Conjugated Rockland antibodies 610-731-002 1:10,000 in WB blocking buffer
SlowFade Gold Antifade Reagent  Life technologies S36936 Mounting media
Round coverslips 12CIR.-1 Fisherbrand 12-545-80
Olympus IX-81 microscope Olympus
Retiga ExiFAST 1394 IR camera QImaging  32-0082B-238
100X Plan Apo oil immersion objective Olympus 1.4 numerical aperture
Slidebook software package Intelligent Imaging Innovations
Odyssey IR Imaging System Li-cor Biosciences
Bicinchoninic acid (BCA) assay Thermo Scientific 23227
U-MNU2 Narrow UV cube Olympus U-M622 Filter
U-MNU2 Narrow Blue cube Olympus U-M643 Filter
U-MNU2 Narrow Green cube Olympus U-M663 Filter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
  2. Kobayashi, T., Dynlacht, B. D. Regulating the transition from centriole to basal body. J. Cell Biol. 193, 435-444 (2011).
  3. Azimzadeh, J., Marshall, W. F. Building the centriole. Curr. Biol. 20, 816-825 (2010).
  4. Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole. Curr. Biol. 17, 2169-2174 (2007).
  5. Strnad, P., et al. Regulated HsSAS-6 levels ensure formation of a single procentriole per centriole during the centrosome duplication cycle. Dev. Cell. 13, 203-213 (2007).
  6. Hilbert, M., et al. Caenorhabditis elegans centriolar protein SAS-6 forms a spiral that is consistent with imparting a ninefold symmetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 11373-11378 (2013).
  7. Pike, A. N., Fisk, H. A. Centriole assembly and the role of Mps1: defensible or dispensable. Cell Div. 6, 9 (2011).
  8. Haren, L., Stearns, T., Luders, J. Plk1-dependent recruitment of gamma-tubulin complexes to mitotic centrosomes involves multiple PCM components. PLoS One. 4, e5976 (2009).
  9. Andersen, J. S., et al. Proteomic characterization of the human centrosome by protein correlation profiling. Nature. 426, 570-574 (2003).
  10. Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R. 3rd, Marshall, W. F. Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes. Curr. Biol. 15, 1090-1098 (2005).
  11. Kumar, A., Rajendran, V., Sethumadhavan, R., Purohit, R. CEP proteins: the knights of centrosome dynasty. Protoplasma. 250, 965-983 (2013).
  12. Kanai, M., et al. Physical and functional interaction between mortalin and Mps1 kinase. Genes Cells. 12, 797-810 (2007).
  13. Jakobsen, L., et al. Novel asymmetrically localizing components of human centrosomes identified by complementary proteomics methods. Embo. J. 30, 1520-1535 (2011).
  14. Sang, L., et al. Mapping the NPHP-JBTS-MKS protein network reveals ciliopathy disease genes and pathways. Cell. 145, 513-528 (2011).
  15. Dowdle, W. E., et al. Disruption of a ciliary B9 protein complex causes Meckel syndrome. Am. J. Hum. Genet. 89, 94-110 (2011).
  16. Majumder, S., Slabodnick, M., Pike, A., Marquardt, J., Fisk, H. A. VDAC3 regulates centriole assembly by targeting Mps1 to centrosomes. Cell Cycle. 11, 3666-3678 (2012).
  17. Guderian, G., Westendorf, J., Uldschmid, A., Nigg, E. A. Plk4 trans-autophosphorylation regulates centriole number by controlling betaTrCP-mediated degradation. J. Cell Sci. 123, 2163-2169 (2010).
  18. Holland, A. J., et al. The autoregulated instability of Polo-like kinase 4 limits centrosome duplication to once per cell cycle. Genes Dev. 26, 2684-2689 (2012).
  19. Kasbek, C., et al. Preventing the degradation of mps1 at centrosomes is sufficient to cause centrosome reduplication in human cells. Mol. Biol. Cell. 18, 4457-4469 (2007).
  20. Kasbek, C., Yang, C. H., Fisk, H. A. Antizyme restrains centrosome amplification by regulating the accumulation of Mps1 at centrosomes. Mol. Biol. Cell. 21, 3878-3889 (2010).
  21. Puklowski, A., et al. The SCF-FBXW5 E3-ubiquitin ligase is regulated by PLK4 and targets HsSAS-6 to control centrosome duplication. Nat. Cell Biol. 13, 1004-1009 (2011).
  22. Spektor, A., Tsang, W. Y., Khoo, D., Dynlacht, B. D. Cep97 and CP110 suppress a cilia assembly program. Cell. 130, 678-690 (2007).
  23. Salisbury, J., Suino, K., Busby, R., Springett, M. Centrin-2 is required for centriole duplication in Mammalian cells. Curr. Biol. 12, 1287 (2002).
  24. Lukasiewicz, K. B., et al. Control of centrin stability by Aurora A. PLoS One. 6, e21291 (2011).
  25. Zhao, J., Ren, Y., Jiang, Q., Feng, J. Parkin is recruited to the centrosome in response to inhibition of proteasomes. J. Cell Sci. 116, 4011-4019 (2003).
  26. Korzeniewski, N., et al. Cullin 1 functions as a centrosomal suppressor of centriole multiplication by regulating polo-like kinase 4 protein levels. Cancer Res. 69, 6668-6675 (2009).
  27. Rohatgi, R., Milenkovic, L., Corcoran, R. B., Scott, M. P. Hedgehog signal transduction by Smoothened: pharmacologic evidence for a 2-step activation process. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3196-3201 (2009).
  28. Majumder, S., Fisk, H. A. VDAC3 and Mps1 negatively regulate ciliogenesis. Cell Cycle. 12, 849-858 (2013).
  29. Howell, B. J., Hoffman, D. B., Fang, G., Murray, A. W., Salmon, E. D. Visualization of Mad2 dynamics at kinetochores, along spindle fibers, and at spindle poles in living cells. J. Cell Biol. 150, 1233-1250 (2000).
  30. Meraldi, P., Nigg, E. A. Centrosome cohesion is regulated by a balance of kinase and phosphatase activities. J. Cell Sci. 114, 3749-3757 (2001).
  31. Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry. Mol. Biol. Cell. 15, 3642-3657 (2004).
  32. Lee, K., Rhee, K. PLK1 phosphorylation of pericentrin initiates centrosome maturation at the onset of mitosis. J. Cell Biol. 195, 1093-1101 (2011).
  33. Lin, Y. C., et al. Human microcephaly protein CEP135 binds to hSAS-6 and CPAP, and is required for centriole assembly. Embo. J. 32, 1141-1154 (2013).
  34. Lichtenstein, N., Geiger, B., Kam, Z. Quantitative analysis of cytoskeletal organization by digital fluorescent microscopy. Cytometry A. 54, 8-18 (2003).
  35. Keller, L. C., et al. Molecular architecture of the centriole proteome: the conserved WD40 domain protein POC1 is required for centriole duplication and length control. Mol. Biol. Cell. 20, 1150-1166 (2009).
  36. Venoux, M., et al. Poc1A and Poc1B act together in human cells to ensure centriole integrity. J. Cell Sci. 126, 163-175 (2013).
  37. Stevens, N. R., Roque, H., Raff, J. W. DSas-6 and Ana2 coassemble into tubules to promote centriole duplication and engagement. Dev. Cell. 19, 913-919 (2010).
  38. Machiels, B. M., et al. Detailed analysis of cell cycle kinetics upon proteasome inhibition. Cytometry. 28, 243-252 (1997).
  39. Yang, C. H., Kasbek, C., Majumder, S., Yusof, A. M., Fisk, H. A. Mps1 phosphorylation sites regulate the function of centrin 2 in centriole assembly. Mol. Biol. Cell. 21, 4361-4372 (2010).
  40. Tsou, M. F., et al. Polo kinase and separase regulate the mitotic licensing of centriole duplication in human cells. Dev. Cell. 17, 344-354 (2009).
  41. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
  42. Buck, S. B., et al. Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies. Biotechniques. 44, 927-929 (2008).
  43. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J. Cell Biol. 185, 1135-1148 (2009).

Tags

सेलुलर जीवविज्ञान अंक 94 सेंट्रोसोम विधानसभा कोशिका चक्र centrosomal गिरावट मात्रात्मक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी सामान्य VDAC3 BrdU के नाड़ी-पीछा
मात्रात्मक इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख Centrosomes में प्रोटीन का स्तर में रूपांतर उपाय
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Majumder, S., Fisk, H. A.… More

Majumder, S., Fisk, H. A. Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes. J. Vis. Exp. (94), e52030, doi:10.3791/52030 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter