Introduction
Levure de modèles proteinopathy ont été développés pour les troubles du repliement des protéines, y compris la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et la maladie (PD) 3/1 de Parkinson. L'expression des protéines TDP-43 et FUS, qui misfold chez les patients SLA, sont toxiques et mislocalize à former des agrégats cytoplasmiques dans la levure 1,2. De même, l'expression d'α-synucléine (α-syn), qui est impliquée dans la MP, est toxique et mislocalizes à former des agrégats cytoplasmiques de levure 3. Ces caractéristiques récapitulent phénotypes chez les patients atteints de ces troubles 4,5. Ainsi, les modèles de levure fournissent une plate-forme utile pour le criblage de protéines ou de petites molécules qui empêchent ou inverser ces phénotypes 2,6-13. Nous sommes intéressés par le développement de protéines qui sont capables de renverser l'agrégation et la toxicité due à TDP-43, FUS, et α-syn. Nous nous concentrons sur Hsp104, un AAA + protéines de la levure qui est uniquement capable de désagréger la fois des protéines fragrégats amorphes l'OM et l'amyloïde dans la levure, mais il n'a pas homologue humain 14,15. Hsp104 est finement réglé pour désagréger les prions de levure endogènes et ne dispose que d'une capacité limitée à ventiler substrats impliqués dans les maladies neurodégénératives humaines, qu'il rencontre jamais normalement 16,17. Ainsi, nous avons pour objectif de concevoir des versions améliorées de Hsp104 qui sont en mesure de ventiler efficacement ces substrats humains. Pour ce faire, nous construisons les grandes bibliothèques de variantes Hsp104 par PCR sujette à l'erreur; Ces bibliothèques peuvent être contrôlés au moyen des modèles de levure proteinopathy 17. Nous avons adopté une approche de domaine ciblé pour la construction et le criblage de banques, comme Hsp104 est très grand 17. Nous avons d'abord mis l'accent sur le domaine du milieu (MD) de Hsp104 17, même si les approches similaires peuvent être utilisés pour dépister d'autres domaines. Ces modèles permettent de cribler l'activité de disaggregase directement, par opposition à d'autres techniques telles que l'affichage de la surface, qui est le reposricted à utiliser pour la surveillance de la liaison 18.
Notre protocole est basé sur deux étapes de criblage (Figure 1). Tout d'abord, Hsp104 variantes qui suppriment la toxicité du substrat de la maladie chez la levure sont sélectionnées. Pour ce faire, le Hsp104 variantes et associée à la maladie substrat sont cotransformé dans Δ Hsp104 levure. Nous employons Δ Hsp104 levure à explorer Hsp104 espace de séquence en l'absence de type sauvage (WT) Hsp104 17. Fait important, la deletion de Hsp104 n'a pas d'incidence α-syn, FUS, ou TDP-43 toxicité dans la levure, et l'expression de Hsp104 WT prévoit un minimum de sauvetage 1,13,17. La levure est ensuite étalé sur des milieux induisant pour induire l'expression des deux protéines. Levure hébergeant Hsp104 variantes qui suppriment la toxicité de la croissance de la colonie confèrent substrat associé à une maladie. Ces variantes sont sélectionnées pour une analyse plus approfondie, tandis que le maintien de colonies variantes qui ne suppriment pas la toxicité dé. Cependant,les faux positifs sont un problème important dans cet écran. L'expression de TDP-43, FUS, et α-syn sont hautement toxiques, ce qui crée une forte pression de sélection pour l'apparition de suppresseurs génétiques spontanées de toxicité sans rapport avec la variante Hsp104 être exprimé. Ainsi, nous avons utilisé un écran secondaire qui est aussi relativement haut débit pour éliminer ces suppresseurs de toxicité non spécifiques 17. Dans cet écran secondaire, levures sélectionnées sont traités avec 5 Fluorootic acide (5-FOA) pour contrer sélection pour le plasmide Hsp104 19. Les souches sont ensuite évaluées pour substrat (TDP-43, FUS, ou α-syn) toxicité par analyse des taches de sorte que la toxicité du substrat est rétablie après la perte du plasmide Hsp104. Ainsi, la levure, dans lequel la toxicité est restaurée dans l'écran secondaire affiche initialement doute suppression de la toxicité due à la présence du variant Hsp104. Ces levures sont désignés comme «hits» et le plasmide Hsp104 devrait alors êtrerécupérée et séquences pour identifier les mutations dans le gène Hsp104 17 (figure 1). Les résultats doivent ensuite être confirmées par la construction de la mutation indépendamment en utilisant la mutagenèse dirigée et retester pour la suppression de toxicité alors. Les applications potentielles de ce protocole sont larges. En utilisant ces procédés, des banques de tout type de protéine peuvent être criblés pour des variantes qui suppriment la toxicité d'une protéine substrat qui est toxique à la levure.
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Protocol
1. Bibliothèque génération
- Pour construire des banques de Hsp104 utilisant la PCR sujette à l'erreur spécifique au domaine, d'abord amplifier le domaine d'intérêt avec une erreur de l'ADN polymérase 20 sujets.
- On purifie le produit de PCR par extraction sur gel.
- Effectuez une étape d'extension de méga-utilisant un protocole de mutagenèse dirigée norme: combiner 50 ng modèle plasmide, 250 ng méga-200 uM de dNTP, et haute-fidélité ADN polymérase dans un tampon PCR, et diluer à 50 pi volume total avec PCR eau de qualité 20 . Exécuter un programme PCR standard.
REMARQUE: Des amorces spécifiques utilisées varieront en fonction de la région particulière du gène qui doit être amplifié.- Suite à la PCR, digérer l'ADN matrice parentale avec 1 ul Dpn I enzyme de restriction pendant 2 heures à 37 ° C.
- Transformer la bibliothèque par électroporation ou d'autres moyens de Ultracompetent E. coli et purifier par miniprep.
REMARQUE: génération Bibliothèquevarie considérablement sur la base des objectifs d'une expérience donnée. Hsp104 est une très grosse protéine, de sorte qu'il est impossible de rendre aléatoire la totalité du gène, qui est la raison pour laquelle nous utilisons erreur spécifique au domaine PCR sujette. En outre, la structure de Hsp104 reste mal comprise, ce qui rend la conception de bibliothèques destinées difficiles 21. Les bibliothèques peuvent être construites en utilisant des approches dirigées ou aléatoires dans une mutagenèse, avec la seule restriction étant que le modèle de squelette plasmidique doit contenir le gène URA3 pour permettre la 5-FOA sélection de compteur sur un support dextrose.
2. Transformation de la Bibliothèque Hsp104
- Intégrer le substrat en W303aΔ Hsp104 levure associée à la maladie en utilisant un acétate de lithium norme / PEG protocole de transformation 22. Sélectionnez des colonies isolées et leur écran de toxicité pour isoler une souche avec une toxicité élevée de la maladie substrat 23 associés.
REMARQUE: Utilisez une souche et isola intégréTe une seule colonie d'assurer l'égalité d'expression dans toutes les cellules. Cloner le substrat de la maladie dans un plasmide permettant l'intégration du gène marqueur en vertu d'une autre que l'uracile (nous utilisons histidine) et la bibliothèque Hsp104 dans le plasmide pAG416GAL (marqueur de l'uracile) 24. Pour permettre 5-FOA contre sélection, assurez-vous que la bibliothèque est exprimé à partir d'un plasmide avec le marqueur de l'uracile. D'autres souches de levure peuvent également être employés. Nous avons noté un phénotype de suppression de toxicité similaire en utilisant W303a et BY4741 souches de levures dans les deux milieux de Hsp104 WT et Δ (MEJ et JS, observations non publiées). - Transformer la bibliothèque Hsp104 dans cette souche en utilisant la même acétate de lithium / PEG protocole de transformation 22. À grande échelle la transformation de façon appropriée pour maintenir l'espace de séquence de la bibliothèque et à préserver la taille de la bibliothèque prédite.
- Plaque du mélange de transformation sur noninducing, plaques sélectives (par exemple, SD-His-Ura) en utilisant assez d'assiettes àassurer la croissance d'un grand nombre de colonies. Utilisation de grandes boîtes de Petri (150 mm) afin de minimiser le nombre de plaques nécessaires. Récupération transformants en utilisant des plaques permet l'efficacité de transformation pour être évalué.
- Transformez Hsp104 WT et vecteur contrôles négatifs en parallèle.
3. Dépistage de la répression des protéotoxicité
- Laver les colonies au large des plaques en utilisant raffinose complété médias d'abandon (par exemple sraff-His-Ura). Utiliser une pipette sérologique et applicateurs stériles en bois pour desserrer les colonies des plaques. Transférer les liquides de lavage dans un tube conique de 50 ml à fond et vortex pour séparer des amas de cellules. Diluer à une culture légèrement nuageux, DO 600 ~ 0,025.
NOTE: Voici sert raffinose pour soulager les cellules de la répression du glucose médiée par l'induction, l'amorçage ainsi les cellules pour l'induction de galactose médiation. - Cultiver la culture dilué nuit dans un milieu d'abandon raffinose sous agitation à 30 ºC. Cultivez la Hsp104 WT et contrôles de vecteurs en parallèle.
- Le lendemain matin, la plaque une gamme de concentrations SUR DES galactose individu (par exemple SGal-His-Ura) plaques (1 pi à 2 ml concentrés culture dans 400 pi de volume total). Placage une large gamme de concentrations veillera à ce que la plaque aura des colonies isolées. La concentration effective requise dépend de la toxicité du substrat d'intérêt de la maladie.
- Normaliser le vecteur et cultures Hsp104 poids à la DO 600 de la bibliothèque et de la plaque volumes égaux de comparer la croissance de la bibliothèque par rapport aux témoins.
- Pour évaluer sélection rigueur, l'assiette de la bibliothèque sur le glucose (la répression) médias. Incuber les plaques pendant 2-3 jours à 30 ° C, jusqu'à ce que les colonies apparaissent (Figure 2). Évaluer les colonies résultantes et comparer les contrôles.
REMARQUE: Souvent, les petites et grandes colonies sont obtenus, mais aucune corrélation entre la taille de la colonie et acteivité est observée. Ecran ces tubes potentiels en utilisant une technique de sélection de compteur 5-FOA (étape 4) afin de minimiser les faux positifs reportés au séquençage.
4. 5-FOA contre sélection et Spotting à éliminer les faux positifs
- Streak des colonies isolées en double sur support double et simple abandon (par exemple, SD-His-Ura et SD-Ses plaques) et développer une nuit à 30 ° C. Répéter l'opération avec les vecteurs et Hsp104 WT contrôles. Placage sur SD-His avant 5-FOA augmente l'efficacité de l'étape 5-FOA en augmentant la probabilité que les cellules auront perdu le plasmide Hsp104 quand elles sont étalées sur 5-FOA.
- Pour éviter les plaques de sécher, envelopper le SD-ses-Ura plaques de parafilm et conserver à 4 ° C tout en effectuant l'écran 5-FOA. Ces plaques seront éventuellement utilisés pour le séquençage.
- Streak les colonies de la SD-Ses plaques à des colonies isolées sur des plaques 5-FOA (YPD médias + 1g / L 5-FOA) et incuber pendant 1-2 jours à 30 ans &# 186; C jusqu'à ce que des colonies isolées apparaissent. Ici, le 5-FOA est converti en un produit toxique (5-fluorodésoxyuridine) dans les cellules qui contiennent le gène URA3. Ainsi, toutes les cellules encore abritant le plasmide Hsp104 mourront.
- Streak les colonies simples de plaques 5-FOA en double sur une carte SD et SD-Ura-His plaques. Test 3 colonies pour chaque touche pour augmenter la probabilité que au moins une colonie pour chaque coup aura perdu le plasmide Hsp104. Incuber pendant 1-2 jours à 30 ° C. Les colonies qui ont perdu le plasmide Hsp104 va croître sur SD-Ses plaques mais pas les plaques SD-Ura.
- Cultiver les souches qui ont perdu les plasmides Hsp104 pour repérer les essais. Cultiver les souches de la saturation en raffinose médias d'abandon (par exemple sraff-Sa) dans 96 ml DeepWell 2 plaques pendant une nuit à 30 ° C avec agitation. Assurez-vous d'inclure les souches de contrôle 5-FOA traités.
- Préparer les boîtes pour repérer essai. En utilisant une pipette multicanaux, aliquote de 200 pi raffinose médias d'abandon (par exemple sraff-Sa) paret d'une plaque de 96 puits, en réservant les colonnes 1 et 7 pour les cultures soignées. Aliquoter 250 ul de chacune des 16 cultures saturées dans les colonnes 1 et 7 de la plaque.
- Diluer en série les cultures cinq fois dans chaque colonne de la plaque, en mélangeant soigneusement avec une pipette multicanaux. Retirer 50 pi de la culture diluée de colonnes 6 et 12 pour assurer le volume final de chaque puits est de 200 ul. Cela est essentiel pour assurer une spotting.
- L'utilisation d'un outil de réplicateur 96 boulon (Frogger), repérer les cultures en double sur SD-His et SGal-Ses plaques. Incuber les plaques à 30 ° C pendant 2-3 jours.
- Choisir pour le séquençage des souches qui présentent une toxicité sur les SGal-His plaques semblables à celle des témoins. Jeter les souches comme faux positifs qui ne sont pas aussi toxiques que les contrôles. 5-FOA est toxique aussi souvent sur lui-même, de sorte jeter les souches qui présentent un défaut de croissance sur plaques de SD-His ou qui présentent une toxicité nettement supérieure à celle du substrat de la maladie (seuls
5. Le séquençage du Hsp104 variantes par PCR sur colonie
- Racler ~ 10 ul de levure à partir des plaques de SD-His-Ura à 3 ul de NaOH 20 mM dans des tubes de PCR en forme de bande et lyser les cellules par congélation-décongélation. Placez les bandes de tubes dans un congélateur -80 ° C pendant 10 minutes ou dans l'azote liquide, puis incuber à 99 ° C dans un thermocycleur pendant 10 min. Diluer les souches à 100 pi avec de l'eau de qualité PCR.
- Préparer les réactions de PCR: 5 pi modèle PCR, 0,5 pi 100 uM de chaque amorce, 0,5 pi 10 mM dNTP, 0,25 ul ADN polymérase dans un tampon PCR, et faire jusqu'à 25 pi volume total de l'eau de qualité PCR. Conception des amorces pour amplifier la région randomisée plus environ 100 pb à chaque extrémité. Réduire la taille de la région amplifiée pour augmenter la probabilité de réussite de l'amplification. Exécuter un programme PCR standard.
- Analyser les échantillons par électrophorèse sur gel d'agarose pour confirmer l'amplification d'un produit de PCR de la siz appropriée. Répétez PCR si aucun produit est présent.
REMARQUE: une panne PCR est généralement dû à trop de levure utilisée dans l'étape 5.1. - Préparation des échantillons pour le séquençage de l'ADN. Retirer des amorces de PCR, soit par purification par PCR ou en utilisant un réactif de nettoyage du produit de PCR telle que l'exonucléase I et l'enzyme phosphatase alcaline de crevette (ExoSAP-IT) pour dégrader l'ADN simple brin. Ce réactif enzymatique dégrade les amorces et les dNTP non constituées en société, permettant un débit plus élevé.
- La séquence des produits de PCR. Assurez-vous de bien analyser chromatogrammes de séquençage des mutations. Des mutations peuvent être observés comme un mélange de deux nucleotides à un site donné (Figure 4), en tant que levure abriter souvent plusieurs plasmides.
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Representative Results
Nous avons construit une banque de variants Hsp104 randomisés dans le domaine intermédiaire et criblés pour la suppression de TDP-43 toxicité. La bibliothèque a été transformée et plaqué sur du glucose et du galactose plaques (figure 2) pour évaluer la rigueur de l'écran. Des colonies isolées ont été sélectionnés et les souches ont été sélectionnées à l'aide contre 5-FOA pour éliminer le plasmide Hsp104. Ces souches ont ensuite été évalués pour confirmer que la toxicité est due à TDP-43 seul, sans les variantes Hsp104. Tests de repérage d'un sous-ensemble des variantes sélectionnées dans l'écran initial ont montré que des 4 colonies sélectionnées, 2 affichés suppression TDP-43 toxicité Hsp104 médiation, 1 était un faux positif, et une augmentation de la toxicité affiche après le traitement 5-FOA (Figure 3). Les deux résultats vrais ont été ensuite séquences par PCR sur colonie afin d'identifier les mutations dans le domaine intermédiaire (figure 4). Une fois que ces mutations ont été identifiées, la mutation a été construite Hsp104 nouveau dans le plasmide parental Hsp104 par mutagenèse dirigée pour confirmer la suppression de la toxicité. Variantes sélectionnés en utilisant ces méthodes ont été confirmées pour supprimer l'agrégation dans la levure, claires agrégats préformés dans des dosages biochimiques, et supprimer la neurodégénérescence dopaminergique dans un C. elegans modèle de PD 17.
Figure 1:. Organigramme pour isoler variantes Hsp104 potentialisés bibliothèques Hsp104 (URA3 marqueurs, promoteur GAL1) sont transformés dans la levure contenant les substrats de la maladie (HIS3 marqueurs, promoteur GAL1) et criblés pour suppresseurs de toxicité par étalement sur les médias induisent. Résultats potentiels sont ensuite criblées à nouveau en utilisant une étape de contre-sélection 5-FOA à éliminer les suppresseurs de toxicité non spécifique. Des variantes sélectionnées dans cette deuxième étape sont ensuite séquences par PCR sur colonie. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52089/52089fig1large.jpg" target = "_ blank"> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Le dépistage de suppresseurs de toxicité levure cotransformée avec pAG303GAL-TDP-43 et la bibliothèque pAG416GAL-Hsp104 ont été étalées sur glucose (réprimant) ou du galactose (induisant) médias. TDP-43 est très toxique, donc très peu de variantes Hsp104 sont capables de supprimer cette toxicité, et cet écran est très rigoureux. Des colonies isolées sont sélectionnées comme frappe de la plaque de galactose pour l'écran secondaire 5-FOA. Les deux grandes et petites colonies sont généralement obtenus, mais on n'a pas observé les tendances qui dictent la taille des colonies est en corrélation avec l'activité.
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Figure 3:. 5-FOA écran secondaire levure traitée avec du 5-FOA pour contrer sélection pour le plasmide Hsp104 ont été évalués en repérant essai. Les souches ont été cultivées dans sraff-ses médias, dilué en série de 5 fois, et repérés en double exemplaire sur SD-His et SGal-Ses plaques. Hsp104 A503V est un vrai succès que nous avons déjà vérifié et montrer ici en tant que témoin avec le vecteur seul 17. Les lignes 3 et 4 sont des coups bibliothèques qui conservent TDP-43 toxicité perte du suppresseur Hsp104 suivant. Ligne 5 montre un faux positif, où TDP-43 est plus toxique, donc une toxicité non spécifique suppresseur est présent. Ligne 6 montre une souche qui est plus toxique que TDP-43 est typiquement, probablement en raison de la toxicité du 5-FOA. Cette souche pourrait encore être séquencé, mais ne peut pas être un succès valide.
Figure 4. Analyzing résultats de séquençage. levure sélectionnée contient souvent plusieurs plasmides. Par conséquent, après le séquençage des produits de PCR de la colonie, il faut veiller à assurer que toutes les mutations ne sont pas négligés dans les chromatogrammes. Dans ce chromatogramme, deux mutations potentielles (noté *) pourraient être négligés. Dans le premier cas, il existe un mélange de A et T et dans le second, d'un mélange de T et C.
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Discussion
Ici, nous présentons notre approche pour isoler variantes Hsp104 potentialisés qui suppriment la toxicité des substrats associés à la maladie en utilisant des modèles de levure proteinopathy. En utilisant cette approche, les grandes banques de variants peuvent être criblés en haut débit, avec la seule limitation étant le nombre de variantes qui passent l'écran secondaire 5-FOA. En effectuant ces mesures au format 96 puits, nous contrôlons régulièrement jusqu'à 200 coups à la fois dans l'étape 5-FOA au cours de 1-2 semaines. Le nombre de visites obtenues lors de l'étape de criblage initial varie largement en fonction de la toxicité substrat et la composition de chaque bibliothèque particulière. Lorsque le séquençage succès, il est essentiel d'analyser avec soin tous les chromatogrammes de séquençage depuis mélanges de plasmides sont généralement présents dans chaque cellule.
Nous avons parfois noté un grand pourcentage de Hsp104 WT être isolé comme «hits». Cela est probablement dû à la présence de génétique spontanéesuppresseurs ou très faible activité. Pour contourner ce problème, nous avons constaté que le dépistage à des températures élevées (par exemple 34 ° C) peut diminuer le pourcentage de «hits» qui sont Hsp104 WT. Il est également essentiel de re-clone des hits séquencés afin d'évaluer de façon indépendante l'activité de toutes les nouvelles variantes et de veiller à la pureté de plasmide. Une fois que de nouveaux résultats sont identifiés, ils peuvent être évalués pour la suppression de l'agrégation dans la levure et caractérisés biochimiquement.
Nous avons utilisé ces méthodes pour isoler potentialisée Hsp104 variantes contre TDP-43, FUS, et α-synucléine et vérifié leur activité en utilisant des analyses de biochimie de protéines pures 17. En fin de compte, ces méthodes pourraient être utilisées pour cribler des banques de protéines contre tout substrat d'intérêt qui est toxique à la levure.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit | Agilent | 200552 | |
| 150 mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
| 5-Fluorootic Acid | Research Products International | f10501-5.0 | |
| 96-DeepWell 2 ml Plates | Eppendorf | 0030 502.302 | |
| 96 bold replicator tool | V&P Scientific | vp-404 | |
| ExoSAP-IT | Affymetrix | 78200 |
References
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