Introduction
Levedura proteinopathy modelos têm sido desenvolvidos para distúrbios-misfolding proteína incluindo a esclerose lateral amiotrófica (ELA) e a doença de Parkinson (DP) 1-3. Expressão das proteínas TDP-43 e FUS, que misfold em pacientes de ELA, são tóxicos e mislocalize para formar agregados citoplasmáticos em levedura 1,2. Do mesmo modo, a expressão de α-sinucleína (α-syn), que está implicado na doença de Parkinson, é tóxico e mislocalizes para formar agregados citoplasmáticos em 3 de levedura. Esses recursos recapitular fenótipos em pacientes com esses transtornos 4,5. Assim, os modelos de levedura fornecer uma plataforma útil para o rastreio de proteínas ou moléculas pequenas que impedem ou invertem estes fenótipos 2,6-13. Estamos interessados no desenvolvimento de proteínas que são capazes de inverter a agregação e toxicidade devido a TDP-43, FUS, e α-syn. Nós nos concentramos em Hsp104, um AAA + proteína de levedura que é o único capaz de desagregar proteínas tanto fragregados amorfos om e amilóide em leveduras, ainda não tem homólogo humano 14,15. Hsp104 é afinado para desagregar prions levedura endógenos e tem apenas capacidade limitada para desagregar substratos implicados em doenças neurodegenerativas humanas, que nunca encontra ordinariamente 16,17. Assim, nosso objetivo é projetar versões aprimoradas de Hsp104 que são capazes de desagregar eficazmente estes substratos humanos. Para isso, construímos grandes bibliotecas de Hsp104 variantes utilizando PCR propenso a erros; essas bibliotecas podem ser rastreados usando os modelos de levedura proteinopathy 17. Adotamos uma abordagem orientada-domínio para construção e pesquisa de bibliotecas, como Hsp104 é muito grande 17. Nós centrou-se inicialmente no domínio médio (DM) de Hsp104 17, embora as abordagens semelhantes podem ser empregues para o rastreio de outros domínios. Esses modelos permitem o rastreio de actividade disaggregase directamente, ao contrário de técnicas alternativas, tais como exposição de superfície, que é restoricted usar para monitorar a ligação 18.
O protocolo baseia-se em dois passos de triagem (Figura 1). Em primeiro lugar, as variantes de Hsp104 que suprimem a toxicidade do substrato doença em levedura são seleccionados. Para fazê-lo, a Hsp104 variantes e associado à doença substrato são co-transformados em levedura Δ Hsp104. Nós empregamos Δ Hsp104 levedura para explorar Hsp104 seqüência espaço na ausência de tipo selvagem (WT) Hsp104 17. Importante, supressão de Hsp104 não afecta α-syn, FUS, ou TDP-43 toxicidade em levedura, e expressão de Hsp104 WT fornece salvamento mínima 1,13,17. A levedura é então plaqueadas em meios de indução para induzir a expressão de ambas as proteínas. Levedura abrigar variantes Hsp104 que suprimem a toxicidade do associado à doença de crescimento substrato conferem da colônia. Estas variantes são seleccionados para posterior análise, mantendo ao mesmo tempo as colónias variantes que não suprimem a toxicidade da matriz. No entanto,falsos positivos são um problema substancial na tela. Expressão de TDP-43, FUS, e α-syn são altamente tóxicos, o que cria uma forte pressão selectiva para o aparecimento de supressores genéticas espontâneas de toxicidade relacionada com a variante Hsp104 ser expresso. Assim, temos utilizado uma tela secundária que também é relativamente alto rendimento para eliminar esses supressores de toxicidade inespecíficos 17. Nesta tela secundária, leveduras selecionadas são tratados com 5-Fluorootic ácido (5-FOA) para combater a seleção para o plasmídeo Hsp104 19. As estirpes são então avaliadas para substrato (TDP-43, FUS, ou α-sin) toxicidade via ensaio de mancha para assegurar que a toxicidade do substrato é restaurada após a perda do plasmídeo Hsp104. Assim, de levedura, em que a toxicidade é restaurada neste ecrã secundário originalmente apresentado presumivelmente supressão de toxicidade devido à presença da variante da Hsp104. Estas leveduras são designados como 'hits' e do plasmídeo Hsp104 deve, então, serrecuperados e sequenciados para identificar as mutações no gene de Hsp104 17 (Figura 1). Qualquer resultado deve ser reconfirmada em seguida, através da construção da mutação, independentemente, utilizando mutagénese dirigida ao local e, em seguida, para a supressão de novo teste de toxicidade. As potenciais aplicações para este protocolo são amplas. Usando estes métodos, bibliotecas de qualquer tipo de proteína pode ser rastreada para as variantes que suprimem a toxicidade da proteína de qualquer substrato que é tóxico em levedura.
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Protocol
1. Biblioteca Generation
- Para construir bibliotecas de Hsp104 usando PCR propensa a erros de domínio específico, primeiro amplificar o domínio de interesse com um erro DNA polimerase propensas 20.
- Purifica-se o produto de PCR por extracção de gel.
- Realizar uma etapa de extensão megainiciador utilizando um protocolo padrão de mutagénese dirigida ao local: combinar 50 ng de plasmídeo, modelo, 250 megainiciador ng, 200 uM de dNTPs, e de alta fidelidade da polimerase de ADN em tampão de PCR, e diluir até 50 mL de volume total, com água de grau de PCR 20 . Execute um programa de PCR padrão.
NOTA: Os primers específicos utilizados irá variar com base na região particular do gene que está a ser amplificado.- Após a PCR, digerir ADN molde parental com 1 ul da enzima de restrição Dpnl durante 2 horas a 37 ° C.
- Transformar a biblioteca por eletroporação ou outros meios em ultracompetent E. coli e purificá-lo por miniprep.
NOTA: geração Bibliotecavaria substancialmente com base nos objetivos de um determinado experimento. Hsp104 é uma proteína muito grande, por isso é impraticável para embaralhar todo o gene, que é por isso que nós utilizamos erro específico do domínio propenso PCR. Além disso, a estrutura de Hsp104 permanece pouco compreendido, tornando o desenho de bibliotecas dirigidas 21 desafiantes. As bibliotecas podem ser construídas utilizando abordagens dirigidas ou aleatórias para mutagénese, com a única restrição que o plasmídeo de esqueleto modelo deve conter o gene URA3 para permitir 5-FOA contra-selecção em meios de dextrose.
2. Transformação da Biblioteca Hsp104
- Integrar o substrato associado à doença em W303aΔ Hsp104 levedura usando um acetato de lítio padrão / PEG protocolo de transformação 22. Selecione colónias individuais e analisá-los em termos de toxicidade para isolar uma cepa com alta toxicidade da doença associada substrato 23.
NOTA: Use uma tensão integrado e isolate uma única colônia de garantir a igualdade de expressão em todas as células. Clonar o substrato de doença num plasmídeo que permite a integração do gene em qualquer outro marcador de uracilo (usamos histidina) e a biblioteca de Hsp104 no plasmídeo pAG416GAL (marcador uracilo) 24. Para permitir o 5-FOA counterselection, assegurar que a biblioteca é expressa a partir de um plasmídeo com a marca de uracilo. Outras estirpes de levedura também podem ser empregues. Temos notado um fenótipo supressão toxicidade semelhante usando W303a e BY4741 cepas de leveduras em ambos WT e Δ Hsp104 fundos (MEJ e JS, observações não publicadas). - Transformar a biblioteca em Hsp104 esta estirpe usando o mesmo acetato de lítio / PEG protocolo de transformação 22. Dimensionar-se a transformação de forma adequada para manter o espaço de sequência da biblioteca e para preservar o tamanho da biblioteca previsto.
- Placa da mistura de transformação para noninducing, placas seletivas (por exemplo SD-His-Ura) usando placas suficientes paraassegurar o crescimento de um grande número de colónias. Use grandes placas de Petri (150 mm) para minimizar o número de placas necessárias. Recuperando transformantes utilizando placas permite eficiência de transformação para ser avaliado.
- Transforme Hsp104 WT e controles negativos vetor em paralelo.
3. Triagem para Supressão de Proteotoxicity
- Lave as colônias fora as placas usando rafinose complementada media de abandono (por exemplo SRaff-His-URA). Usar uma pipeta serológica estéril e aplicadores de madeira para soltar as colónias das placas. Transferir as lavagens líquidos para um tubo cónico de 50 ml e cuidadosamente vórtice para separar quaisquer aglomerações de células. Diluir a uma cultura um pouco nublado, OD 600 ~ 0,025.
NOTA: Aqui rafinose serve para aliviar as células de repressão mediada por glicose de indução, priming assim que as células de indução mediada por galactose. - Incubar a cultura diluído durante a noite em meio de abandono rafinose com agitação a 30 ºC. Crescer a Hsp104 WT e controle de vetores em paralelo.
- Na manhã seguinte, chapear uma gama de concentrações de galactose Onto individual (por exemplo SGAL-His-Ura) placas (1 ul a 2 ml da cultura concentradas em 400 ul de volume total). Chapeamento de uma ampla gama de concentrações vai garantir que uma placa vai ter colónias isoladas. A concentração real necessário depende da toxicidade do substrato doença de interesse.
- Normalizar o vector e culturas Hsp104 WT para o OD 600 da biblioteca e placa volumes iguais para comparar o crescimento da biblioteca em relação aos controlos.
- Para avaliar a seleção rigor, placa da biblioteca em glicose (reprimir) mídia. Incubar as placas durante 2-3 dias a 30 ° C, até que colónias aparecem (Figura 2). Avaliar as colônias resultantes e comparar com os controles.
NOTA: Muitas vezes pequenos e grandes colônias são obtidos, mas nenhuma correlação entre o tamanho da colônia e agirivity é observado. Tela estes potenciais sucessos usando uma técnica de contra-selecção 5-FOA (Passo 4) para minimizar os falsos positivos transitados para sequenciação.
4. 5-FOA Counterselection e Spotting para eliminar falsos positivos
- Streak fora colónias isoladas em duplicata em suporte de casal e solteiro abandono (por exemplo SD-His-Ura e-Seus SD placas) e crescer durante a noite a 30 ºC. Repita a operação com controle de vetores e Hsp104 WT. Plaqueamento em SD-His antes da 5-FOA aumenta a eficiência do passo 5-FOA, aumentando a probabilidade de que as células terão perdido o plasmídeo Hsp104 quando são semeadas em 5-FOA.
- Para evitar que as placas de secar, enrole a placas em parafilm Seus-SD-Ura e armazenar a 4 ºC durante a realização da tela de 5 FOA. Estas placas venham a ser utilizados para a sequenciação.
- Streak as colônias do SD-Suas placas de colónias isoladas em placas 5-FOA (YPD media + 1g / L 5-FOA) e incubar durante 1-2 dias a 30 &# 186; C até as colónias individuais aparecem. Aqui, 5-FOA é convertido num produto tóxico (5-fluorodesoxiuridina) em células que contêm o gene URA3. Assim, destacando as células portadoras do plasmídeo Hsp104 morrerá.
- Streak as colónias individuais das placas 5-FOA em duplicar em SD-Ura e-Seus SD placas. Teste 3 colónias para cada batida para aumentar a probabilidade de que pelo menos uma colónia de cada um batido terá perdido o plasmídeo de Hsp104. Incubar durante 1-2 dias a 30 ° C. As colónias que perderam o plasmídeo Hsp104 vai crescer em SD-His placas mas não placas de SD-Ura.
- Crescer as tensões que perderam os plasmídeos Hsp104 para detectar ensaios. Crescer as tensões à saturação em rafinose mídia abandono (por exemplo SRaff-His) em 96 Deepwell 2 placas ml durante a noite a 30 ºC com agitação. Certifique-se de incluir as estirpes de controlo 5-FOA tratados.
- Prepare placas para detectar ensaio. Usando uma pipeta de canais múltiplos, alíquota de 200 ul rafinose meios de abandono (por exemplo SRaff-His) porpoço de uma placa de 96 poços, reservando colunas 1 e 7 para as culturas puras. Alíquota de 250 mL de cada uma das 16 culturas saturadas em colunas 1 e 7 da placa.
- Serialmente dilua as culturas de 5 vezes em cada coluna da placa, misturar cuidadosamente com uma pipeta de canais múltiplos. Retirar 50 mL da cultura diluída a partir de colunas 6 e 12 para garantir o volume final de cada poço é 200 ul. Isto é essencial para garantir uma identificação.
- Usando uma ferramenta replicador de 96 parafuso (Frogger), identificar as culturas em duplicado para-Seus SD e SGAL-Seus pratos. Incubar as placas a 30 ºC durante 2-3 dias.
- Selecione para sequenciar cepas que apresentam toxicidade nas SGAL-Suas placas semelhantes aos dos controles. Descarte cepas como falsos positivos que não são tão tóxico como os controles. 5-FOA é também muitas vezes tóxico por si próprio, então descartar cepas que apresentam um defeito de crescimento em-seu SD ou placas que exibem substancialmente maior toxicidade do que o substrato doença sozinho (
5. O seqüenciamento do Hsp104 Variantes por Colony PCR
- Raspe ~ 10 ul de levedura a partir das placas de SD-His-Ura em NaOH 3 ul 20 mM em tubos de PCR de tira e lisar as células por congelação-descongelação. Colocar os tubos em um congelador tira -80 ºC durante 10 min ou em azoto líquido, depois incubar a 99 ° C num termociclador durante 10 min. Dilui-se as estirpes para 100 ul com água de grau de PCR.
- Prepare reações de PCR: 5 jul modelo PCR, 0,5 ul 100? M de cada iniciador, 0,5 mL de 10 mM dNTPs, 0,25 mL DNA polimerase em tampão PCR, e fazer até 25 mL volume total com PCR água grau. Design Os iniciadores para amplificar a região mais ao acaso, aproximadamente 100 pb em cada extremidade. Minimizar o tamanho da região amplificada para aumentar a probabilidade de uma amplificação bem sucedida. Execute um programa de PCR padrão.
- Analisar amostras por electroforese em gel de agarose para confirmar a amplificação de um produto de PCR do siz adequadoe. Repita PCR se nenhum produto está presente.
NOTA: A falha PCR é geralmente devido ao excesso de levedura a ser utilizado na etapa 5.1. - Preparar amostras para seqüenciamento de DNA. Remover os iniciadores de PCR quer através de purificação de PCR ou utilizando um reagente de limpeza do produto de PCR, tais como a Exonuclease I e fosfatase alcalina de camarão enzima (ExoSAP-TI) para degradar o ADN de cadeia simples. Este reagente enzimático degrada primers não incorporados e dNTPs, permitindo maior rendimento.
- Sequenciar os produtos de PCR. Certifique-se de analisar cuidadosamente cromatogramas de sequenciamento de mutações. As mutações podem ser observadas como uma mistura de dois nucleótidos em um dado local (Figura 4), como de levedura muitas vezes abrigam os plasmídeos múltiplos.
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Representative Results
Construímos uma biblioteca de variantes de Hsp104 randomizados no domínio médio e rastreados-lo para a supressão de TDP-43 toxicidade. A biblioteca foi transformada e plaqueada em placas de glicose e galactose (Figura 2) para avaliar a severidade da tela. Colónias individuais foram seleccionadas e as estirpes foram contra-seleccionadas utilizando 5-FOA para eliminar o plasmídeo Hsp104. Estas estirpes foram então avaliadas para confirmar que a toxicidade foi devido a TDP-43 sozinho, sem as variantes Hsp104. Identificação de ensaios de um subconjunto das variantes seleccionadas no ecrã inicial mostrou que das quatro colónias seleccionadas, 2 exibido supressão TDP-43-Hsp104 toxicidade mediada, 1 era um falso positivo, e 1 exibida toxicidade aumentada após o tratamento 5-FOA (figura 3). Os dois acessos verdadeiras foram então sequenciados por colónia de PCR para identificar as mutações no domínio da média (Figura 4). Uma vez identificadas estas mutações, a mutação foi construída Hsp104 novamente no plasmídeo parental Hsp104 por mutagénese dirigida ao local para confirmar a supressão de toxicidade. Variantes selecionados usando esses métodos foram posteriormente confirmados para suprimir a agregação em leveduras, claras agregados pré-formados em ensaios bioquímicos e suprimir neurodegeneração dopaminérgica em um C. elegans modelo de PD 17.
Figura 1:. Fluxograma para isolar variantes Hsp104 potencializadas bibliotecas Hsp104 (marcador URA3, GAL1 promotores) são transformados em levedura contendo os substratos da doença (marcador HIS3, GAL1 promotor) e selecionados para supressores de toxicidade por plaqueamento em meio de indutores. Sucessos em potencial são então pesquisadas novamente usando um passo counterselection 5-FOA para eliminar supressores de toxicidade inespecíficos. As variantes seleccionadas nesta segunda etapa são, em seguida, sequenciado por PCR de colónias. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52089/52089fig1large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. A triagem para supressores de toxicidade Yeast cotransformados com pAG303GAL-TDP-43 ea biblioteca pAG416GAL-Hsp104 foram semeados em glicose (reprimir) ou galactose (indutores) de mídia. TDP-43 é altamente tóxico, de modo muito poucas variantes Hsp104 são capazes de suprimir esta toxicidade, e desta tela é muito rigorosa. Colónias individuais são selecionados como hits de placa galactose para a tela secundária 5-FOA. Grandes e pequenas colônias são normalmente obtidas, mas não observamos quaisquer tendências que ditam como tamanho da colônia se correlaciona com a atividade.
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Figura 3:. 5-FOA ecrã secundário de levedura tratada com 5-FOA para seleccionar para contrariar o plasmídeo Hsp104 foram avaliadas pelo ensaio de mancha. As cepas foram cultivadas em SRaff-Seus meios de comunicação, diluídas em série de 5 vezes, e viu em duplicata para-Seus SD e SGAL-Seus pratos. Hsp104 A503V é um verdadeiro hit que já verificados e mostrar aqui como um controle junto com só 17 vector. Linhas 3 e 4 são hits da biblioteca que retêm TDP-43 toxicidade após perda do supressor Hsp104. A linha 5 mostra uma falsa positiva, onde TDP-43 não é tóxico, de modo que um supressor de toxicidade não específica está presente. A linha 6 mostra uma estirpe que é mais tóxico do que o TDP-43 tipicamente é, possivelmente devido à toxicidade de 5-FOA. Esta estirpe ainda poderia ser seqüenciado, mas não pode ser um acerto válido.
Figura 4. Analyzing resultados de sequenciamento. leveduras selecionadas, muitas vezes contém vários plasmídeos. Portanto, após a sequenciação dos produtos de PCR de colónias, deve ser tomado cuidado para assegurar que quaisquer mutações não são ignorados nos cromatogramas. Neste cromatograma, duas mutações potenciais (indicado por *) pode ser esquecida. Em primeiro lugar, existe uma mistura de A e T, e no segundo, uma mistura de T e C.
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Discussion
Aqui apresentamos nossa abordagem para isolar variantes Hsp104 potencializadas que suprimem a toxicidade de substratos associados à doença, utilizando modelos de levedura proteinopathy. Utilizando esta abordagem, bibliotecas grandes de variantes pode ser rastreada em elevado rendimento, com a única limitação é o número de variantes que passam o ecrã secundário 5-FOA. Ao realizar estes passos em formato de 96 poços, que rotineiramente tela até 200 batidas de cada vez no passo 5-FOA ao longo de 1-2 semanas. O número de acertos obtidos durante a etapa inicial de triagem irá variar largamente dependendo de toxicidade substrato ea constituição de cada biblioteca particular. Ao sequenciar hits, é essencial analisar cuidadosamente todos os cromatogramas sequenciamento desde misturas de plasmídeos estão tipicamente presentes em cada célula.
Às vezes temos notado uma grande porcentagem de Hsp104 WT ser isolado como 'hits'. Isto é provavelmente devido à presença de genética espontâneasupressores ou atividade muito fraca. Para contornar este problema, verificou-se que o rastreio, a temperaturas elevadas (por exemplo, 34 ° C) podem diminuir a percentagem de "sucessos" que são Hsp104 WT. É também essencial para re-clone qualquer hits em seqüência para avaliar de forma independente a atividade de quaisquer novas variantes e para garantir plasmídeo pureza. Uma vez que os hits são identificados novos, eles podem ser avaliadas para a supressão da agregação em levedura e caracterizados bioquimicamente.
Temos usado esses métodos para isolar potencializado Hsp104 variantes contra TDP-43, FUS, e α-sinucleína e verificada a sua actividade utilizando proteína pura bioquímica ensaios 17. Em última instância, estes métodos podem ser utilizados para rastrear bibliotecas de proteínas contra qualquer substrato de interesse que é tóxico em levedura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit | Agilent | 200552 | |
| 150 mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
| 5-Fluorootic Acid | Research Products International | f10501-5.0 | |
| 96-DeepWell 2 ml Plates | Eppendorf | 0030 502.302 | |
| 96 bold replicator tool | V&P Scientific | vp-404 | |
| ExoSAP-IT | Affymetrix | 78200 |
References
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