Abstract
大多数的所有已知的疾病都伴有心血管系统的疾病。研究入期间心血管病理活化的相互作用途径的复杂性，然而，受限于缺乏鲁棒和生理相关的方法。以模型的病理血管事件我们已经开发了一种在体外测定法用于研究内皮细胞和全血之间的相互作用。该测定法包括原代人内皮细胞，其被放置在与人全血接触的。该方法利用天然血液，没有或很少抗凝剂，使存在于血管内的分子和细胞成分之间微妙的相互作用的研究。
我们通过培养具有或不具有人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的不同血液体积比较活化凝血研究该测定的功能。而一个更大的血量贡献增加抗凝血酶的形成（TAT）复合物，血管内皮细胞的存在导致凝血的活化减少。此外，我们采用白细胞附着的图像分析，以内皮细胞刺激肿瘤坏死因子α（TNFα），并发现CD16 +细胞的存在是显著更高的TNFα刺激的细胞相比，经血液接触的未刺激的细胞。最后，该分析可用于研究血管病症，其中血管内皮细胞和血液舱之间的相互作用被扰动。
Introduction
方法分析在心血管疾病的血液血管的相互作用通常涉及的动物实验研究。在实验研究的动物模型中创建的结果可能，但是，有很少或没有含意为人类疾病。1,2-因此，有必要对在体外模型中良好和可靠的调查血液舱和血管内皮细胞之间的细胞相互作用一类人制度。因此，我们已经建立了一个血内皮细胞腔模型。这是基于用于研究生物材料和人全血之间的相互作用以前描述的模型。3相反，其他的体外设置在那里通常是有限的纯化组分，对数，即，血小板，白细胞或内皮细胞是可用的，在本模型中包含的所有各组分存在于血管中。
血内皮细胞C中的设置ELL室模型是为了让使用新鲜抽取的人血液中很少或根本没有添加抗凝剂。血液在较长的时间内存储收购所谓的存储病灶，其中红细胞的破裂可能与血液和血管内皮细胞之间的微妙交互干扰。4
为了避免处理的全血离体中凝块的形成需要或高剂量的抗凝血剂，或在与血液接触的所有材料必须是不激活的。作为非活化表面是罕见在实验室环境中，材料可以替代地设有固定化肝素的保护层。固定化肝素的保护层（以下简称为Corline肝素表面（CHS）），其可以被应用到大多数材料创造一个表面，其中血液接触可以发生而不引起凝血级联的活化。5。因此，通过提供所述腔室与CHS，血液中内皮CELL室模型允许使用非常低浓度的抗凝血剂的血液中。避免加入高浓度的抗凝血剂的血液内皮室模型的使得能够研究在血管内，否则可能会被屏蔽敏感的相互作用。6
血液内皮细胞室模型包括通过将塑料圆柱体形成的两个腔室（高度：8毫米;半径：9毫米），一个塑料显微镜载玻片。朝上的气缸的边缘都配有该配有用于密封腔室对细胞培养片橡胶O形环的槽。所述腔室仅部分填充有血液的左腔室中的空气保持血液中运动时，腔室中的垂直位置（ 图1）随后被转动。
为了评估该模型的功能，我们进行了与任一个完全的CHS涂布实验室或人脐静脉内皮细胞（HUVEC）。两个单独的血液量进行测定和凝血酶抗凝血酶（TAT）复合物（凝结的间接标记物）的形成，测定用酶联免疫吸附试验（ELISA）。然后我们评价了血液体积和肿瘤坏死因子α（TNFα），通过图像分析刺激对白细胞募集的内皮细胞的影响。
图1.设置血液内皮细胞腔模型。 （A）顶视图血室PMMA制成的示意图。（B）原代人内皮细胞上的1孔玻片培养。人的新鲜全血加入到两个室在显微镜载玻片上。用于处理血液室，所有的材料都被有保护HS涂层。除去策的壁后LL培养载玻片，细胞被置于面向血液和系统被夹紧关闭。（℃）的血液内皮细胞的腔室，然后在旋转下在37℃温育。之后，血液中的隔室中的反应可通过ELISA进行分析，并在内皮细胞中可通过显微镜进行分析。
Protocol
注：血是从健康人通过审批，在乌普萨拉伦理审查委员会（许可证号二百六十四分之二千○八）开放式系统静脉穿刺抽。
1.种子细胞
- 培养原代人脐静脉内皮在T75烧瓶细胞（HUVEC），在CO 2的37℃，5％涂布在PBS pH 7.4的1％明胶。
- 除去从T75烧瓶中含有内皮细胞（或其它类型的原代人内皮细胞）培养液，用2.1毫摩尔EDTA洗细胞在pH 7.4的PBS。在37℃下3分钟 - 加入1ml 0.25％胰蛋白酶-EDTA，并孵育2分离细胞。
- 通过漂洗用9ml 10％FBS的烧瓶中在pH 7.4的PBS收集细胞，将细胞悬浮液转移到15毫升管。降速细胞在735×g离心5分钟。
- 除去上清液，小心重悬细胞沉淀在血管内皮细胞生长培养基微血管（EC GMMV）和细胞计数在Bürker室。种子21000çELLS /厘米2 1孔细胞培养玻片孵育在37℃下。培养2天 - 在HUVEC后，将进行1汇合。监控在光学显微镜下的细胞形态和汇合每日。
2.制备全血
- 制备按照生产商的说明所有人工表面，就可以在接触血液与固定化肝素（HS）的双层。从防尘CHS涂覆材料可以在室温下保存6个月而不丧失功能。
- 使用开放系统静脉穿刺在开始血液内皮室实验前抽血从健康供体不久（<30分钟）。夫妇皮下注射针头（18G的×50毫米），以CHS涂覆的硅管（内径：2mm）的前仔细收集血液中的CHS涂覆50ml管中。补充血液与肝素达到0.75单位/ ml的终浓度。通过英伟混血轻轻rting管2 - 3次。
3.血液内皮商会型号
- 制造血腔（ 图1A;顶视图）中的丙烯酸聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）组成的两个汽缸（高度：8mm和半径9毫米）被粘到一个聚甲基丙烯酸甲酯滑动件（25×75毫米）中。适合朝上用橡胶O形环，所述滚筒的边缘以密封血室对载玻片与培养的内皮细胞（ 图1B）。旋转连接到具有内皮细胞的培养载玻片此后在垂直位置（ 图1C）的血液腔室。
- 使用CHS涂枪头转移1.5毫升血涂成室，注意不要激活血液中的每个社区卫生服务。
- 转让1毫升血入含有30微升0.34 MK 3 EDTA离心管使用达到10毫米K 3 EDTA终浓度测定初始血浆蛋白浓度酶联免疫吸附测定（ELISA）。小心地混合血液和保持管在冰上。
- 除去根据制造商的说明将细胞培养玻片的塑料壁，并仔细在pH 7.4的PBS洗涤细胞。确保随后从载玻片除去尽可能多的液体成为可能。不要让细胞干出来的。
- 广场上的血室顶部的幻灯片，面临的血细胞。通过将夹具周围的血液内皮细胞的腔室固定在滑动。使用塑料滑动以获得更多支持放置夹具时，为了避免细胞培养载玻片破裂。
- 固定血内皮细胞室到一个旋转轮（40厘米直径）发生在37℃的水浴中。旋转的轮子每个室，在0.5×g离心30分钟。
- 培养结束后，拆除血液内皮细胞室。洗PBS pH值7.4的细胞培养玻片和固定细胞冰冷的1％多聚甲醛（PFA）F或10分钟。转印取血1ml，从每个室含有30微升0.34 MK 3 EDTA的微量离心管中，以达到10mM的K 3 EDTA终浓度和混合管轻轻。置于冰上管。
- 离心管在4560 XG在4℃下10分钟。转让血浆，以新的离心管中，并存储在-70°C，直到进一步的分析。
血液内皮细胞相互作用4.分析
- 用小鼠抗人CD16，再进行二次山羊抗小鼠的Alexa 488和鬼笔环肽 - TexasRed进行免疫荧光染色。进行1小时，在室温下每染色步骤，并在每一步之间的pH 7.4的PBS冲洗载玻片。染液用DAPI对细胞核，在室温下10分钟。分析结合到内皮细胞通过荧光显微镜结合使用适当的图像分析软件，图像分析诸如CellProfiler血液成分。
- 孔定量FY在血液舱与凝血酶 - 抗凝血酶（TAT），酶联免疫吸附反应按照生产商的血浆样品的说明书。
- 用适当的统计工具， 如：，非配对t检验，对数据进行分析。
Representative Results
CHS涂料的必要性
为了测量特定于那些由内皮细胞引起的反应中的全血，用于血内皮细胞的腔室的所有材料必须被配备在使用前一个CHS涂层。 图2A（左侧）示出了未涂覆的腔室在30分钟后有一条清晰可见的凝块目前血液接触。处理，另一方面与CHS腔室（ 图2A，右）保护血液从不受控制的活化，从而确保其结果是由于内皮细胞-血液相互作用。
在会议厅内血容量的影响
凝固的激活更可能在瘀血作为激活的凝血因子之间相互作用的可能性增大。在血液内皮细胞室模型中，血液被保持在运动中，由于气泡的腔室内部的循环。邻的rDer以确定改变血液量的效果，因此也气泡大小，CHS涂覆室连接到已用1.5ml或1.75毫升全血30分钟，测试一个CHS涂载玻片上。的血液的体积，而不由气泡的任何移动是的2.5倍时1.75毫升的血液加入到腔室时相比，将1.5ml血液时（ 图2B）。所测量的TAT-值建议增加的TAT-形成具有增加血液体积（ 图2D）。当HUVEC细胞（ 图2C）一起孵育或者1.5或1.75毫升全血，无区别指出，两组之间，这表明内皮细胞可调节凝血的活化（ 图2D）。
TNFα对血细胞募集的影响及凝血激活
为了研究TNFα对白细胞募集的影响，HUVEC在治疗ED与20毫微克/毫升TNFα4小时前血液接触。血液接触-同为1.5 ml或1.75毫升血-再继续进行30分钟，之后将培养载玻片染色的CD16（ 图2F），成像和CD16 +细胞的数量进行定量。 CD16 +细胞的募集与TNFα的治疗（ 图2E），从100到256的CD16 +细胞/ mm 2的（P <0.0001），用1.5ml血液显著增加，从172到378（P <0.0001），与1.75毫升血液。 TAT复合物的形成，测定血液中的相应的血浆样品一起孵育或者TNFα处理或未经处理的细胞（ 图2G）中。 TNFα刺激的细胞中诱导的TAT复合物的近似加倍相比，未经处理的细胞。
无花果茜2：血内皮细胞室模型的功能。 （A）钱伯斯带或不带CHS培养与全血。未经CHS，30分钟后形成了凝块。凝血酶-抗凝血酶（TAT）复合物，凝血功能的一个间接指标，血培养，而不CHS测量> 6000微克/毫升。（B）的血液量没有跟上的旋转气泡移动将随不同的血量。通过加入1.5毫升的血液，该体积将0.3毫升，而这将增加至0.74毫升，加入1.75毫升（C）的 HUVEC细胞成像与汇合单层的前相差显微镜显示了典型的内皮细胞形态学血液接触。（D）TAT值完全CHS涂层室表现出细微的差别时，添加不同的血量。加入1.5ml的血液导致35±11微克/毫升（7例）相比，1.75毫升，这就造成了8577; 70微克/毫升TAT（N = 8）。这种差异不再存在时的HUVEC孵育以相同的血液量; 66±55微克/毫升为1.5毫升（5例）和66±29微克/毫升为1.75毫升（7例）后的CD16 +细胞的数目。（E）的定量存在于任一未刺激或肿瘤坏死因子α刺激的血管内皮细胞血液接触。 CD16 +细胞的数量显著增加与TNFα刺激的细胞培养或者用1.5ml（基肥：100±40个/ mm;肿瘤坏死因子α：256±121细胞/毫米）或1.75毫升（基肥：172±67个/ mm; TNFα：全血378±185个/ mm）（F）的未刺激和TNFα刺激的HUVEC染色鬼笔环肽（红色代表图像），CD16（绿色）和DAPI（蓝色）。比例尺=250μm的（G）中的TAT复合物的形成，大致是由TNFα的一倍刺激的细胞相比，未处理的细胞培养用血液（1.5毫升：2。1±0.1倍以上的TAT，n = 3时; 1.75毫升：1.7±1.0倍以上的TAT，n = 4时）。所有值表示为平均值±标准差; P值的计算采用非配对t检验， 请点击这里查看该图的放大版本。
Discussion
血液和血管壁之间的多重相互作用，通常是由于血管内皮细胞的非粘性和抗血栓形成的性质保持在静止状态。7在涉及炎症的病理条件下，内皮细胞与一个结果增加了粘附受体表达8激活和能力下降，抑制止血9激活的级联系统中的血液又将放大内皮细胞的血栓造成进一步的血栓形成和白细胞招聘10至获得的内皮细胞和全血之间的这种微妙的互动更好地了解，我们有开发的体外方法的新型其中培养的内皮细胞被放置在与全血接触。就我们所知，我们的设置是第一个显示孵育的人全血，没有或很少抗凝剂为更长的时间周期的内皮细胞。
核苷酸“>该系统的灵敏度是由开放系统静脉穿刺术使能结合固定化的肝素对放置在与血液接触的所有表面的保护层。静脉穿刺过程中的开放式系统的过程中血液采购的使用减少了级联系统的激活而允许使用的抗凝血剂的自确定量。市售的真空血液试管可能，但是，可根据不同的研究的目的终点所用。抗凝剂添加到大多数市售的封闭系统管中的最终浓度可以抑制敏感和以其他方式难以学习，相互作用在设定6的保护肝素表面进一步消除了活化的血液通过由比内皮细胞以外的其他表面上的表面接触。5实际上，全血补充有少量肝素的培养室内没有CHS的保护导致血块形成。此外，有一个增加2倍于招聘血细胞对TNFα活化的HUVEC结合有加倍形成的TAT独立的血液量。这验证了该模型系统的稳定性，同时还示出了使用活化的内皮细胞与全血组合的可能性。未来上，血内皮细胞腔室可用于通过多种表达于各种条件和活化的阶段下的细胞标志物的研究对活化的内皮细胞的血细胞募集。此外，该模型可以用于在用药剂组合，以评价对炎症的影响。
总之，我们显示结合人血和血管细胞的腔室模型来创建在体外系统中的完整的人来执行血管疾病有关的调查并大有裨益。
Acknowledgments
这项研究是由瑞典研究理事会（90293501，A0290401，A0290402），欧盟第七框架计划资助下的赠款协议支持N°602699（的DirEKt），该NovoNordisk基金会，Gurli和爱德华Brunnberg基金会，干疗法，Vleugel基金会和阿克维贝格基金会。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC) | PromoCell | C-12200 | Any other type of primary human endothelial cell may be used. |
| Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV) | PromoCell | C-22120 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G-2500 | Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells. |
| TAT ELISA | Enzyme Research Lab. | TAT-EIA-C | |
| Mouse anti-human CD16 | DAKO | F7011 | Dilution 1:100 |
| Goat anti-mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11001 | Dilution 1:500 |
| Phalloidin-Texas Red | Molecular Probes | A22287 | Dilution 1:200 |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | Dilution 10 μg/ml |
| EDTA | Sigma | E-6758 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco Life Tecnologies | 25200-056 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Life Technologies | 10437 | |
| 1 well cell culture slides | BD Falcon | 354101 | |
| Blood Chambers | NA | NA | Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS |
| Clamps | Office Depot | 2052204 | |
| Corline Heparin Surface (CHS) | Corline Systems AB | 945-00 | |
| Hypodermic needle | Terumo | NN-1850R | Size: 18 G x 5 mm |
| Unfractionated Heparin (UFH) | Leo Pharma | 585679 | |
| K3EDTA | Alfa Aesar | 1709958 | Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H2O |
| PFA | Sigma-Aldrich | P-6148 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | 80i | |
| Light microscope | Nikon | TS100 | |
| Image analysis software | Broad Institute | CellProfiler | Available for free at www.cellprofiler.org |
References
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