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Bioengineering

在球体哺乳动物细胞大规模扩张营养调控连续通

Published: September 25, 2016 doi: 10.3791/52224
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 3, 2, 2, 2, 4, 2
1Radiology, University of Minnesota, 2Medicine, University of Minnesota, 3School of Public Health, University of Minnesota, 4Surgery, University of Arizona

Introduction

为了产生大量可行的和功能性人细胞移植，的培养条件调节是必要的。营养物质的消耗，与代谢废物堆积沿主要贡献者，以减少电池产品的质量1衰老和代谢改变- 3。此过程说明使用搅拌生物反应器具有调整速率灌注料系统相结合，以调节整个培养期间在生理范围4中的葡萄糖球体培养的哺乳动物细胞的方法。这些研究的目的，在生理范围被定义为100 200毫克/分升之间。相同的方法可用于调节其它营养物质和代谢废物如乳酸盐。

在小体积的静态培养物（1 - 30毫升）在实验室环境通常用于维持和分化为experime细胞系ntal目的。细胞传代与根据需要定期完全培养基变化进行的。最“常规”培养基具有高的葡萄糖浓度（在这些研究中使用的DMEM 450毫克/分升），以允许无养分限制的风险较不频繁的介质的变化。然而，这种分批输送方法仍然需要频繁操纵，在细胞环境中引入了可变性，并增加污染5的风险- 9。搅拌的生物反应器（SSB）提供更好的混合，降低处理3,10 - 20，但像静态的文化，需要有助于营养物质和废物产品级别潜在的破坏性波动手动媒介的变化。单边带培养物的灌注馈送减少这些问题通过连续输注和去除介质，但是在营养水平由于细胞生长大的变化仍是一个问题。使用调整后的喂养岭德从基于估计的细胞所需养分使用的计算可以提供优化细胞生存力所需的稳定的细胞环境和功能21 - 24。

有大量文献描述的哺乳动物细胞的可扩展SSB文化专为多能干细胞的培养和拓展方法25 - 32，与其他专注于胰岛（测试版）单元17,33,34，或生产生物制品24， 35 - 38。许多这些研究的细胞类型，可以在球体培养物中生长，并为所使用的细胞类型特异性的程序应之前实施的连续进料系统进行优化。在这个演示中，采用灌注饲养方法，扩大成长为在搅拌反应器39的球状体β细胞系- 43。本文所描述的方法提供了一种简单的实现饲养的基础上脱机葡萄糖测量来实现有针对性的培养条件下利率调整。用这种方法调节进料速率，以保持生理葡萄糖水平被示出为增加细胞产量。哺乳动物细胞是依赖于一个关键营养素，葡萄糖，用于能源生产，所以使用该细胞系的代表许多培养的哺乳动物细胞44的模型。此外，这条线例示的β细胞，这是慢性高含量葡萄糖45的敏感的进一步复杂性。在这项研究中，β-TC6允许细胞以形成培养球体近似体内胰岛的平均尺寸。灌注生物反应器系统17 - 19,21,46调整为葡萄糖消耗的进料速率，导致在保持生理条件和较高的细胞产量无生存力的改变。

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Protocol

1.细胞系和维护

  1. 得到βTC6细胞（或其他期望的粘附的哺乳动物细胞系）。在用于研究制备，培养，传代，并根据供应商的说明冷冻保存的细胞。

2.组装连续进料系统

注：连续给料系统设计在下面的方法是根据文献中描述的17类似的系统- 19,21,47 - 49。这里使用的系统的组件的详细情况的先前出版物3所述。

  1. 收集所需馈送系统，该系统由五个主要部件的组件：一个介质贮存器，蠕动泵，搅拌生物反应器，废物储存器，和定制设计管道/采样集。
    1. 使用1升的玻璃瓶中，用2升玻璃瓶废物储存器，并且stirre建立介质容器使用的250毫升容积的玻璃反应器（现成版本）D的生物反应器。
    2. 使用数字蠕动泵或类似的泵用8通道泵头来控制媒体交流。
    3. 从制造硬塑料高压灭菌的容器和修改的生物反应器盖与不锈钢管直通端口通过无菌过滤器，以提供通风，并允许水库和生物反应器之间的介质输送。此外，与购买不同厂商的流通口盖专业化。
      注：该生物反应器盖可能包含可选的仪器和监控探头（如氧气检测仪）额外直通端口。
    4. 附上从多孔玻璃曝气管具有40微米至60微米的平均孔径范围制造的流出管（OT），和40％的孔密度，以修改后的单边带盖子。或者，选择基于文化的特殊要求另一流出管。
      注：选择OT孔径仅去除培养基和细胞碎片，留下在培养细胞聚集体（如更多细节在第6和出版物3描述）。
  2. 组装从聚偏二氟乙烯（PVDF）管连接器和耐用蠕动泵管高压灭菌灌注管套。该部分的长度是依赖于不同的部件之间的距离。
    注意：选择各种管线时，确保长期的实验，耐用性和可靠性，应特别小心。
  3. 装配油管从三个部分设置：馈送线，废线，和一采样线。
    1. 组装使用两个管道直径（L / S 14和L / S 13）的进料管线。使用L / S 14用于主油管，将跨越从生物反应器至介质储存器的距离，并且在使用适当的PVDF适配器泵部的管道长度的中间插入L的短长度/ S 13。
    2. 使用标准的PVDF软管带刺TUBI纳克适配器加入的L / S 14油管两片在较短泵部（L / S 13）管的两侧。
      注意：可替换地，管的整个长度可以是直径较小的L / S 13油管，并且当泵截面完整性是有问题的整个管道长度可以被替换。
  4. 组装使用直径较大（L / S 16）管垃圾处理第二管道部分，并在中间的泵送段插入L / S 14管材短节。这是因为馈送线组件使用的PVDF软管倒钩的接头，或者可替换地使用所需的泵管大小的连续长度，并根据需要替换以相同的方式完成的。
    注意：如果同一泵和泵头部被用于馈电电路和废电路，所述废物去除管道线的泵部分必须比馈送线的泵部更大的直径。这确保了去除泵速度比进给速度更快，并且将避免效IAL在培养物体积大的变化，并减少溢出的风险。
  5. 组装管道组的最后一个组成部分：一个样本收集组件。
    1. 此过程描述组装取样口系统定制;可替代地，无菌取样口可以从各种供应商处购买。
    2. 从三个短（〜6厘米）L / S 14油管具有T型PVDF连接器连接在一起的长度，并在两个管道长度的两个小软管夹构造集。
    3. 附加气体放空无菌气体过滤器，以被夹持长度之一，而另一个是用于连接到一个无菌取样注射器（灭菌气体过滤器可能需要在生物安全柜中添加以下灭菌许多无菌过滤器是不高压灭菌）。
    4. 第三端连接到安装在该生物反应器的盖的不锈钢样品连接器。
    5. 高压灭菌取样组件而连接到前开始在生物反应器实验（参见下面的步骤3）。
    6. 使用此装配需要，而不会干扰连续进料过程，从生物反应器中收集样品不育。

3.高压灭菌器所有材料

  1. 准备高压灭菌的所有生物反应器组件。
  2. 收集灭菌单个组件。介质和废物储（从步骤2.1.1组装），250毫升旋转瓶中（从2.1.1组装），必要的修正盖（距离2.1.3组装），流出管（在2.1.4中描述），三管套（在组装根据需要持续喂养）第2.2 through2.5），流出管（。
    1. 组装旋转烧瓶中的所有组件，并确保流出管的旋转烧瓶内牢固地附着（在2.1.4节中所述），并附加了自定义组装采样口（2.5节），或其他取样口的盖子的顶部。
    2. 包裹自动整个旋转烧瓶装配釜包装材料，和高压表明磁带。要确保包装不透气。注：铝箔或类似的材料可被用于覆盖在生物反应器盖的每个接入端口的各个端部，以保持连接器的无菌展开时和当非连接到培养箱内管套/结束。
    3. 组装平台和废物储层的改性盖子，然后附加到各自的玻璃瓶中。包括他们用铝箔和高压灭菌指示胶带。
    4. 单独包装的管套（2.2节 - 2.5）与釜包和磁带，以协助总装。铝箔或类似的材料可用于包装每个管道组以保持连接器的不育的个体端部展开时/结束。
    5. 高压灭菌使用标准的干釜周期都包裹项目（ 例如 ，“万有引力”〜设定与在121℃下15磅30分钟以上）。
      注意：不要将无菌高压灭菌前，过滤器，除非它们被证实是安全的高压锅。

4.球状体形成

注：这种技术是类似于在文献17中描述- 19,21,50 - 52，用于其它哺乳动物细胞培养物。以下灭菌所有程序应在层流罩来完成，并使用无菌手套，以维持细胞培养无菌条件。

  1. 在所有条件下，培养和扩大β-TC6细胞标准粘附培养物（由供应商所描述），直到足够的细胞数量时，获得种子生物反应器的期望数目。
    1. 组装与流出管的连续进料的生物反应器， 如图1和第2所述，和取样口连接到采样盖子。注：流出管和取样口组件应该被添加到bioreact或连续馈送之前球体的形成，并应直到连续馈送启动拉升出培养基。
    2. 通过高压灭菌器修改SSB组件（第3节中所述）。
    3. 附加通风口灭菌（0.22微米或更小的无菌过滤器）在旋转瓶的盖子，和中和废物容器中的适当位置。
      注意：这是重要的，以防止蒸气锁，并允许培养箱（5％CO 2）的环境和生物反应器之间的气体交换。气体交换是必要使用碳酸氢盐缓冲介质时保持正确的pH值。
  2. 通过使用0.25％（重量/体积）胰蛋白酶0.53毫摩尔EDTA溶液温和胰蛋白酶消化收集细胞，在通过机械搅拌进行2辅助室温- 3分钟，并以约1.3×10 6细胞/ ml的密度接种到生物反应器在200毫升培养基中。
    1. 移动指定烧瓶出保育箱的和成生物安全柜。
      注：所有细胞培养和操作应在使用适当的无菌技术一个生物安全柜来完成。
    2. 通过抽吸从瓶中取出培养基。
    3. 吹打5毫升磷酸盐缓冲盐水的（不含Ca ++或Mg ++），进烧瓶中，并在表面上横跨细胞漂洗洗涤细胞，然后吸出PBS中。
    4. 添加3ml胰蛋白酶-EDTA溶液，以将收集的每种烧瓶（通常为约10倍175厘米2 T-烧瓶）。
    5. 允许收集的细胞在室温下进行2孵育 - 在生物安全柜3分钟。
    6. 轻轻搅动用手从烧瓶表面松开的细胞，并通过加入6毫升培养培养基（血清）的向烧瓶收集细胞，并将细胞转移到50毫升管中。当一个50ml管中充满，用另一种50ml管中，直到所有需要的细胞已收集（大约将需要每5的T-175烧瓶1个50毫升管集）。
    7. 轻轻离心（约50×比重）所收集的细胞悬浮液以沉淀细胞。
    8. 吸出剩余的培养基而使粒料完好无损。
    9. 通过重新悬浮颗粒培养基（含血清）中使用移液管，并且所有丸粒转移到同一管收集在一个单一的管中的细胞。
    10. 算使用标准血细胞计数用锥虫蓝染色，如在文献53中描述的细胞密度。
    11. 加总细胞的期望数量的无菌单边带每个条件（1.3×10 6个细胞/ ml是这个示范针对性的起始细胞密度）。
    12. 添加培养基（与所需的葡萄糖浓度，在这种情况下，我们使用在生理范围内介质葡萄糖水平）使用移液管，以达到所需的总培养物体积（使用200毫升培养体积为这些研究），以SSB。
      注意：对于这些连续补SSB研究了铜 ltures用培养基（100毫克/分升）的变形的“低血糖”版本接种。这使培养物在所期望的目标葡萄糖浓度开始，而不是与一个“高葡萄糖”介质开始并等待葡萄糖消耗带来的血糖水平下降到生理范围开始喂养。在这些研究中饲养的所有其他介质中使用的标准的“高葡萄糖”介质（500毫克/分升）。
    13. 与细胞移动到SSB细胞培养孵化器内的轰动板。
  3. 培养中的细胞的生物反应器，而不在37℃下3天喂养，5％的CO 2，相对湿度100％和70 rpm的搅拌速率以允许球体形成。
    注意：应在为期三天的球体形成期没有观察到显著的增殖。
  4. 球体形成后，用分所需的培养条件下的生物反应器中的球体。
乐“> 5。连续投喂文化和调整进给速度

  1. 高压釜或气体灭菌的所有组件，并且在使用无菌技术的生物安全柜组装（步骤2 - 4）。
  2. 球体形成后，从孵化器中取出的SSB和组装用于连续进料系统的部件在生物安全柜中。
    1. 第一填充所需培养基的新鲜培养基贮存，然后连接到馈送线的一侧。同时确保新鲜培养基水库正常使用无菌过滤器排出。
    2. 进料管线上的生物反应器的进料流入口的一侧连接以无菌的方式。无菌过滤器应在进料管线和反应器入口端口进入所述生物反应器前过滤介质之间进行安装。
    3. 连接废液管到生物反应器的流出管和介质废物储存，并确保废物贮存器正确地与一个与不孕放空Ë过滤器。
  3. 移动部件从生物安全柜（这可能需要两个人来进行所有的容器和管道），并把所有的组件出长期培养。
    1. 把SSB到搅拌板使用球体的形成（37℃，5％CO 2，100％湿度和70的转速）相同的培养参数培养箱的内部。注意：这可能是必要的暂时断开从生物反应器的管段，如果线路需要通孔在培养箱的侧面通过在门上的垫片运行，而不是进行。这可以在无菌的方式通过包装管套的端部用铝箔前高压灭菌（步骤3），并等待到进料和废料管段的生物反应器一侧连接至所述生物反应器是培养箱内进行。该管线可以到位，并且铝箔可以培养箱内取出，并迅速附着到生物反应器。
    2. 用完通过培养箱进入口的管子套其余端（没有连接到生物反应器盖的那些）（传递），或者通过在孵化门衬垫的凹口。
    3. 培养箱（在附近的生物安全柜，如果可能的话）之外，快速连接的进料管线到新鲜培养基水库，且废线向培养基中废物储存器，并确保该废物储存器被正确用无菌过滤器排出。注：要做到这一点在无菌的方式，从管道和容器连接器为快速删除铝箔和连接到各容器尽可能（特别是如果这方面需要的生物安全柜以外的地方完成）。
    4. 把附近的小冰箱里的新鲜中型水库（充满希望的饲料中）。检查，以确保进料和废线能够退出培养箱和没有防止在每个门从关闭进入电冰箱。它也是进给升临界INES没有被挤压通过任何冰箱或孵化器的门关闭​​。
      注意：用于这些研究的培养基是由供应商为这种细胞类型所建议的标准的高葡萄糖（500毫克/分升）的培养基。任何高葡萄糖培养基可以根据细胞的类型是培养的具体需要一起使用。补料培养基的葡萄糖浓度应该相当高（2倍或更多）比作为馈送系统依靠增加高葡萄糖培养基进料速率，以保持足够的葡萄糖水平在培养物，同时保持合理的进料速率的培养所需的浓度。
    5. 接下来，废物中型水库可以在一个方便的位置摆上了台面孵化器之外。
    6. 接下来，将进料和废线入泵头确保正确的方向，以使供电线将从新鲜培养基储到单边带泵送介质的“泵部”，和废线将泵从SSB和废中型水库中。
  4. 打开泵上的所需进料速率。
    1. 计算使用文献3并在下面所提供的代表性的结果部分中所述的调整的进料速率方程的进给速率。
    2. 使用具有生长预测沿着最近的细胞计数信息（在步骤5中描述的过程），并且该介质葡萄糖测量来估计，以维持在培养所需要的葡萄糖浓度所需要的进给速率。
      注意：细胞生长率和葡萄糖消耗率就需要在做这些程序来获得。
    3. 设置基于计算出的进料速率泵的转速。
  5. 重复进给速率的计算和调节泵的转速为每个采样点（对于所描述的方法，每三天）。

6.细胞计数，活力和葡萄糖浓度测量

<OL>
  • 从每三天，或根据需要每个生物反应器收集样本。
  • 从使用上述专门取样口连续供给的SSB培养物采取培养样品。
    1. 离开连续加入SSB生物反应器内，附加一个无菌注射器（用5ml的注射器体积为这些研究）的采样口的未过滤的连接。
    2. 向下移动至取样管进入培养基。
    3. 松开管部将注射器，并撤销所述期望的总样品体积。
    4. 移动至取样管上，以便它在培养不再淹没，并继续撤回注射器，直到空气被除去。
    5. 钳哺养注射器管，取下装有样品的注射器，并预留。
    6. 预负荷与空气的第二新鲜无菌注射器，并连接到采样口的无菌过滤器的一面。
    7. 松开管要的注射器过滤器侧取样端口，然后通过经由无菌过滤器轻轻排出空气中的注射器清除取样端口。这确保了采样端口将清楚任何残留的介质。
    8. 再夹紧管将过滤器，断开无菌注射器和丢弃。
  • 采取包含从培养的细胞样品的注射器，它排出到10ml管中。已知体积的子样品可以直接从该管作出。
  • 用于细胞计数，去除细胞的已知体积和转移到微离心管中，并进行1轻轻离心 - 2分钟（约50×重力）。
  • 将上清转移到单独的管，用于葡萄糖的测量，并重新悬浮在相同体积的胰蛋白酶-EDTA溶液中的沉淀（0.25％（重量/体积）胰蛋白酶，0.53毫摩尔EDTA），并使用标准血细胞计数器与一式三份计数如文献53中所述台盼蓝染色。
    1. 添加培养基（血清）到将样品稀释为必要的。
    2. 计数细胞，并通过记录活（未染色）细胞计算细胞活力，和死（染色）细胞独立地（存活率（％）=活细胞/总细胞）。
  • 测量使用血糖仪和单次使用试条在一式三份培养基葡萄糖水平。
    1. 采取如由血糖仪指示代替血液培养基中描述的葡萄糖的测量。
    2. 浸测试条在被测试的介质（从上面数样品收集），并重复对重复的期望数目（三次重复的建议）。
    3. 测试既为葡萄糖浓度的新鲜培养基和废物网上平台。
      注：对于一些米，测量低于20毫克/分升（米可检测阈值），可以观察到与表输出一个错误。

    • 7.球体沉降速率测量

    1. 为了确保CEL升集群不是由连续馈送系统中除去，通过观察在一大直径的塑料吸管其沉降测量β-TC6球状体的沉降速率。
    2. 培养β-TC6细胞SSB生物反应器中，如上所述，以形成球状体。
    3. 在培养3天后，取球体悬浮液和放置30毫升样品中的50ml管中。
    4. 轻轻吸管上下使用宽直径为25毫升吸管分配均匀悬浮，然后在移液管（ 如20毫升标记）已知水平与悬架停止移液，然后记录时间为所有的球体来解决5厘米。
    5. 重复此过程足够的时间达到统计置信（通常N> 3）。
      注：对于生物研究，p值小于0.05被认为是比较测量时是统计学显著。用于报告错误均值的标准差和双尾未配对学生t检验被用来比较对所呈现的数据的条件。

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    Representative Results

    中血糖水平和波动限制在标准SSB培养细胞扩增

    血糖水平在静态的文化和文化SSB波动在整个培养周期3。这些波动加强与在21天的培养期增加细胞数量并分别在静态和SSB文化几乎相同。这些意见在我们以前的出版物3中。葡萄糖水平可以是超生理的培养期间这两种方法的持续时间。由于这种长期接触可能会抑制细胞生长54，连续供料系统的开发是为了消除血糖波动和提高球体培养过程中营养物质的控制。

    为球体培养的连续供料系统

    连续加入新鲜培养基和培养周期的持续时间中除去旧培养基可以用简单的介质补充系统来完成。在方法2中所述和在图1所示的系统中使用的泵和管道设置为连续补充培养基和一个单独的流出管到，同时防止从培养中除去球体的连续移除介质。所述介质入口是在反应器的相对侧，以尽量减少与OT的正常功能的干扰的任何可能性，并允许彻底混合。新鲜培养基（具有高葡萄糖，450毫克/分升）保持在冰箱温度，以确保长期稳定性，并通过一个介质入口连续加入到培养一个完整的介质置换率每三天以补充营养物。该系统通过用连续过程3,22,23更换手动分批培养基替换处理的限制在培养期间所需的操作和干预。冷媒介进入生物反应器在超过添少量E（0.046毫升/分）相对于总培养物体积（200毫升），给每个“滴”的加入培养基的时间来达到平衡的温度与周围培养基，这是在37℃。这确保了加入冷介质不降低整体培养温度保持在培养箱内。培养基的搅拌也增加热传递效率，和在这些培养改进的温度均匀性。温度维持可能是一个问题，如果非常高的进给率小培养体积中使用，但这些不可能的条件没有对这些研究进行测试。培养体积维持在通过确保平均介质去除速率等于进料速率在连续进料系统恒定水平。用于这些研究在更高的流速比进料速率，因为除去管道部分使用更大直径的管道的泵部实际删除介质中的系统。尽管快雷莫VAL率，将培养体积通过调节流出管的水平反应器内，以所需的培养物体积的水平保持不变。连续加入新鲜培养基到单边带导致反应器中的中等水平的小的增加，并且当介质到达OT的水平，由以更快的速度在反应器中除去介质。将培养基通过多孔玻璃OT除去，留下的细胞球状体在培养直到培养基中的水平下降的OT的底部的下方。该系统避免了使用脆弱的流量和体积传感器，以控制泵的速度的复杂性，并且是使用标准的基于许多单边带培养装置47,48。对OT被设计以确保球状体没有从通过去除电路的培养除去，并且在玻璃料管的孔尺寸和密度足够大（40％和40 - 分别为60微米），以确保线性流速小于所述球体我们的沉降速率编这些文化研究。如详细3所述的计算出的直线流。通过在OT的孔中的平均线性介质速度经计算为0.17厘米/分钟，这远低于最慢观察球体沉降速率慢。如方法7中所述和是2.53±0.26厘米/分在这些研究中使用的球状体，测定平均沉降速度。观察球体的大小，以增加随着培养的进行，并且这些较大的球体定居更快，由于其增加的质量阻比，这进一步降低通过OT去除的可能性。有些球体被困在就OT的外边缘下方毛孔，但当流出管骤降到搅拌中这主要是由于机械碰撞。这并没有阻止OT的正常功能，并没有导致球体在测试的文化可测量的损失。旧约这些研究是每个研究后清理，（用去离子水冲洗），和使用两种培养研究后更换，以避免功能下降的风险。对OT可以每次研究后，如果球体观察到阻塞的特定研究期间的孔（这不是在所提出的工作观察到的）所取代。由于环状除去使用这种方法的介质中，该介质培养体积高达6％波动。波动是由，允许对OT以除去更多的介质后的平均中等水平下降的OT的底部之下的介质的表面张力而引起的。

    消除营养波动SSB培养提高细胞生长

    当与标准的SSB培养连续更换期间在21天的培养期间在使用上述增加培养的产量所描述的系统的SSB培养物中的介质。进料速度在该更换整个培养VOLU速率保持整个培养期间恒定每三天我可以媲美批量喂养SSB文化。消除了养分波动导致尽管高葡萄糖浓度3的增加细胞产量（ 图3）。球体大小亦在由2D显微镜评估（在文献3中描述的标准光镜）培养期结束时测定，在CF-SSB培养物中的球状体分别显著大（P <0.02，学生t检验），在静态或标准SSB文化的文献报道3。这些观察结果支持了细胞计数数据表明在CF-SSB培养要更高的生长速率而存活率保持在相同的高度（96.23±0.85％），无论培养条件。连续进料的SSB（CF-SSB）培养体系消除了球体的文化营养的波动，提高细胞的生长速率，但血糖水平仍可能阻止进一步小鬼超生理 rovement在细胞扩增（ 图2）。在对CF-SSB培养系统，以进一步改善，一种算法被用于在培养期间具有改善的SSB培养葡萄糖水平的控制目标来调整进给速率。

    调整的饲料率的计算

    若干因素可被考虑进给速率的计算，以保持一致的血糖水平。感兴趣的特定因素，可以改变对于给定的研究，并为特定的细胞系。对于这个演示的目的，我们考虑的增长速度，并从以前的文化决定的葡萄糖消耗，以及在调整3时实际的血糖水平。进料速率调整可以在任何时间间隔进行。对于这个示范，收集样品和进料速率基于如下描述的顺序计算每三天调整。

    预测增长率 T“> 计算

    公式1预测期间培养一定时期表示在未来的一段时间内培养的细胞的预期总数细胞生长，与预测的细胞计数（N 2）。此方法使用线性生长速率近似，其中电流细胞数（N + 1）加至在乘以培养期间（t 2 -t 1）球体培养物（R G）细胞的估计增长率。

    式（1） （1）

    计算的基准进给速度

    基线进料速率（R F），通过在培养期间（分子）估计在培养所消耗的葡萄糖和通过在进料培养基中的葡萄糖浓度除以（ 全称使用等式2计算1和N 2的加权平均由公式1所述先前确定的葡萄糖消耗速率为给定的细胞类型（R 1）乘以此消耗率然后通过葡萄糖浓度除以估计（C F）的在补料培养基来计算，以取代在同一培养期间消耗的葡萄糖所需要的平均介质进给速率。

    公式（2） （2）

    调整进给速度与观测到的血糖水平

    进一步调整，以基线料速率制成，以适应在使用等式3.本葡萄糖调整进料速率（GAFR）所选定的时间点所测量的葡萄糖水平的 （C 1）可以用来保持水平时在生长或死亡的意外变化发生在文化。这个方程 Ñ掺入的控制常数（Ⅹ）中，并用于这些数据3的0.5的值。 的 C 1代表在样品上一天的培养基测定的葡萄糖浓度，和C D表示目标介质的葡萄糖浓度。最终值调整从第二计算预测的进给速率。

    公式3 （3）

    图1
    图1：流出管道连续进料系统图。所表现出的系统（A）的图。（B）的烧结玻璃过滤器放置在流出管，以允许从培养除去培养基不含细胞的损失。图转载许可。3

    /files/ftp_upload/52224/52224fig2.jpg“/>
    图2：血糖检测为SSB，CF-SSB和调整CF-SSB文化 （A）使用静态的，SSB和CF-SSB培养方法和标准高糖喂养β-TC6球体文化中的葡萄糖测量。连续馈送是能够消除葡萄糖波动，但在培养基中的变化显着地在培养期间，并远远高于生理范围内的平均血糖水平（由灰色条表示）。调整后的进料是能够消除波动以及维持接近生理水平的葡萄糖浓度为培养期的持续时间。用于葡萄糖测量误差棒太小是上显示的刻度（标准误差为所有测量≤4％）可见。从图中的数据被呈现在前面的出版物许可。3


    图3：SSB，CF-SSB细胞计数，并调整CF-SSB培养与成长调整的饲料价格细胞生长报告在21天的培养周期与对恒定的进给速率定期介质的变化比较SSB细胞数目倍数变化。 SSB文化和调整后的进给速度SSB文化。误差棒报告平均值的标准误差，并报道的p值是一个未配对的双尾学生叔统计检验。转载许可。3

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    Discussion

    生成哺乳动物细胞产品的生产生物战剂和细胞治疗需要大规模55文化和哺乳动物细胞的监测- 58。此外，这些应用要求定义和验证的培养条件。简单地增加使用研究技术不能满足所有这些要求细胞的体积。造成波动的营养物质和废物积聚产品中手动修改降低细胞的质量，生存能力和产量。利用生物反应器的是公认的微生物的生物制药应用的商业文化，和类似的策略已经应用到哺乳动物细胞培养物。哺乳动物细胞与他们的环境的复杂的相互作用就必须具体的修改来调节，以优化细胞扩增潜力营养水平。

    为了解决这些问题，我们开发了一个straightforward方法来维持血糖水平在一个特定的目标范围内，近似生理水平中的搅拌悬浮液的生物反应器具有可调节速率灌注进给机构。要做到这一点，在一个搅拌的悬浮液的生物反应器中产生的β细胞系的球体。灌注料系统被采用以提供连续的进给机构，以取代标准批量馈送的程序。观察细胞的生长速率，并用于预测近似葡萄糖利用速率。实际葡萄糖水平也被过在培养的时间调整响应于消耗的实际营养物，并存放于由细胞的培养基的代谢产物的进料速率进行测定。这种方法防止了在与其他静态和SSB系统3，其中血糖水平用介质的变化，每3天显着地波动看出葡萄糖水平的波动。使用批量喂养策略，血糖浓度下降了高达275毫克/分升三天，在后期阶段■在为期21天的扩张。这些波动在葡萄糖水平限制细胞产量。

    培养基更换速率为并入该细胞系的建立生长率和葡萄糖消耗率调整进料系统的示范，以及观察到的（测量）培养在每次喂食时间点密度和血糖水平的计算。对不同类型的细胞，或者为更复杂的组织培养系统中，这些假设可能不成立。以确保更精确的血糖控制，该算法还包括一个反馈控制系统以考虑各个培养物的可变性。仅基于生长速率灌注方法的限制，包括非均质的葡萄糖利用整个球体和根据参数如分化的干细胞中的葡萄糖消耗的变化的影响对于细胞，可以通过一个反馈控制系统来缓解。根据不同的应用，即显示出expone细胞微分方程边值问题的生长速率或更复杂的生长型材可以实现提高算法的性能。用于进给速率的计算的假设和值可以改变，以坚持实际的培养条件。

    所提出的方法的目的是产生细胞的治疗性应用，其中球状体的扩张和培养将是有限的持续时间，将细胞本身的产品。它可能希望一些研究者使用不断扩大或培养细胞类似的方法，但是，这将呈现为这些研究没有遇到的其他挑战。如果长时间培养，所述球状体将继续在尺寸上生长，并在旋转椭圆体的核的一些细胞的活力可能遭受由于增加养分和氧气的扩散限制。这些培养物，可能需要进一步的操作以解离大球体，以防止这种限制长期培养物在需要时。观察到与该协议生成球状体在存活率没有减少，这表明这一限制在此研究的21天的培养期间未达到。

    用于细胞疗法，这些技术可以结合使用与附加的调节系统，以提高细胞产量，功能和活力。例如，该单边带方法可以以便利的技术，包括微载体表面培养粘附细胞，以提高细胞生长速率，或细胞或球状体的封装组合。另外，更复杂的调整算法可以被实施，以提供更紧密的培养控制。喂养调整可与多个其他参数，例如pH值的控制下，溶解氧浓度，温度，和注射用试剂，以进一步改善59,60相结合。为了改善在其他应用程序的结果，该方法可以是自动的15,24，和进料速率，可以计算米矿石或较少，进一步完善培养条件。

    制造工艺61 - 63必须被定义，并严格控制，以使重现的生物制品。使用连续介质置换可以用于减轻在大规模细胞生产观察的关键营养物的波动，并结合可调节的供料系统可以实现对细胞环境甚至更多的控制，以维持所需的营养水平。所描述的方法可以与其它哺乳动物细胞对于细胞和药物产品中使用。

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    β TC-6 Cells ATCC, Manassas, VA CRL-11506 Mouse Insulinoma cell line (adherent cell type)
    DPBS No Ca, No Mg Invitrogen, Carlsbad, CA 14190-144 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144?ICID=search-14190144
    Dulbecco's Modified Eagles Medium Invitrogen, Carlsbad, CA See below for product numbers 
    DMEM High Glucose (500 mM) Invitrogen, Carlsbad, CA 11965-092 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092
    DMEM Low Glucose (100 mM) Invitrogen, Carlsbad, CA 11885-084 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (note that this medium already contains pyruvate)
    L-glutamine Invitrogen, Carlsbad, CA 25030081 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-product
    Sodium Pyruvate Invitrogen, Carlsbad, CA 11360070 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070?ICID=search-product
    Heat Inactivated Porcine Serum Gibco - Life Technologies 10082147 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147
    Trypsin-EDTA Invitrogen, Carlsbad, CA 25200056 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056?ICID=search-product
    T-150 Tissue Culture Treated Flasks Corning, Corning, NY 430825 http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences)
    &categoryname=
    NuAire Cell culture incubator Princeton, MN US Autoflow. Any water-jacketed CO2 regulating cell culture incubator could be used.
    Centrifuge Sorvall RT 7 (Any similar benchtop centrifuge may be used)
    Refrigerator Any laboratory refrigerator could be used (a small table-top version was used for these studies)
    1 L Glass Bottle Corning, Corning, NY 1395-1L Any vendor could be used. http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Lifesciences)
    &categoryname=
    2 L Glass Bottle Corning, Corning, NY 1395-2L Any vendor could be used
    250 ml stirred bioreactors  Corning, Corning, NY 4500-250 http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Lifesciences)
    &categoryname=
    Stir Plate Fisher Scientific 11-496-104A Any incubator safe stir-plate can be used, any vendor
    Tissue Culture Dishes 100 mm Diameter Nunc, Rochester, NY (Fisher Scientific) 1256598  Any vendor could be used (ordered through Fisher Sci)
    FALCON 50 ml Conical Tubes Falcon, San Jose, CA 1256598 Any vendor could be used
    Delran Plastic Used for Custom Parts McMaster Carr Various Any material of choice could be used, but Deran is chosen because it is autoclave safe, non-reactive, and easy to machine. http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac
    Stainless Steel Pipe for custom lids McMaster Carr Various Any vendor could be used. http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91
    Custom Modified Delran Bioreactor Lids for Continuous Feeding Custom made Not aware of any vendors producing a similar product
    Custom Modified Glass Bottle Lids for Continuous feeding Custom made Some vendors (e.g., Fischer Sci, Corning) make similar products in the links below.
    Masterflex Digital Peristaltic Pump Cole Parmer, Vernon Hills, IL EW-77919-25 Any precision peristaltic pump could be used. http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_
    Cartridge_Pump_System_115_230
    _VAC/EW-77919-25
    PVDF Tubing Connectors (various) Cole Parmer, Vernon Hills, IL see link Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium
    _Luer_Fittings/55889
    Pharmed BPT Tubing L/S 16 Cole Parmer, Vernon Hills, IL WU-06508-16 Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-16
    Pharmed BPT Tubing L/S 14 Cole Parmer, Vernon Hills, IL WU-06508-14 Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-14
    Pharmed BPT Tubing L/S 13 Cole Parmer, Vernon Hills, IL WU-06508-13 Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-13
    Millipore Millex GP PES membrane 0.22 µl sterile syringe filter (used for venting, and medium filtration) Fisher Scientific SLGP033RS Any vendor could be used
    25 ml Graduated Pipette Fisher Scientific 13-678-11 Any vendor could be used, and various sizes may be used
    Pipetter Fisher Scientific 13-681-15E Any vendor, or similar product could be used
    Hemocytometer Fisher Scientific 02-671-6 Any vendor, or similar product could be used
    Trypan Blue Gibco - Life Technologies 15250-061 Any vendor, or similar product could be used. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061
    Inverted Light Microscope Leica Any vendor, or similar product could be used
    One Touch Ultra Blood Glucose Meter Fisher Scientific 22-029-293 Any vendor, or similar product could be used (e.g., Bayer)
    One Touch Ultra-Strips Fisher Scientific 22-029-292  Any vendor, or similar product could be used (e.g., Bayer)

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    References

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    生物工程，115期，葡萄糖，营养调节，连续进料，搅拌的生物反应器，扩张，球体，文化，生物反应器
    在球体哺乳动物细胞大规模扩张营养调控连续通
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