TIRFM og pH-følsomme GFP-sonder for å evaluere Neurotransmitter Vesikkel Dynamics i SH-SY5Y neuroblastom celler: Cell Imaging og dataanalyse

Abstract

Synaptiske vesikler slipper nevrotransmittere ved kjemiske synapser gjennom en dynamisk syklus av fusjon og gjenfinning. Overvåking av synaptisk aktivitet i sanntid og dissekere de forskjellige trinnene av exo-endocytose ved enkelt-vesikkel nivå er avgjørende for forståelsen av synaptiske funksjoner i helse og sykdom.

Genetisk kodet pH-følsomme sonder direkte rettet mot synaptiske vesikler og Total Internal Reflection Fluorescensmikroskopi (TIRFM) gir rom-tid-oppløsningen som er nødvendig for å følge vesikkel dynamikk. Det svinnende felt som genereres av total indre refleksjon kan bare eksitere fluoroforer er lagt i et tynt lag (<150 nm) over glassdeksel som holder cellene, hvor prosessene av exo-endocytose finne sted. De resulterende bilder med høy kontrast er ideell for vesikler sporing og kvantitativ analyse av fusjonsbegivenheter.

I denne protokollen, SH-SY5Y menneskelig neuroblastoma celler er foreslått som et verdifullt modell for å studere nevrotransmitter-frigjøring på enkelt-vesikkel nivå ved TIRFM, på grunn av deres flate overflate og nærvær av dispergerte vesikler. De fremgangsmåter for dyrking av SH-SY5Y som adherente celler og for å transfektere dem med synapto-pHluorin er anordnet, samt teknikken for å utføre TIRFM og avbildning. Endelig er en strategi som mål å velge, telle, og analysere fusion hendelser på hel-celle og single-vesikkel nivåer presentert.

Å validere bilde prosedyre og dataanalyse tilnærming, er dynamikken i pHluorin-tagget vesikler analysert under hvile og stimulert (depolariserende kaliumkonsentrasjoner) forhold. Membran depolarisering øker hyppigheten av fusjonsbegivenheter, og bevirker en parallell høyning av netto fluorescens-signalet registreres i hele cellen. Single-vesikkel analyse avslører modifikasjoner av fusion-event atferd (økt maksimal høyde og bredde). Disse dataene antyder thpå kalium depolarization ikke bare induserer en massiv neurotransmitterfrigivning men også endrer mekanismen av vesikkelfusjon og gjenvinning.

Med det passende fluorescerende probe, kan denne teknikken bli anvendt i forskjellige cellesystemer for å dissekere mekanismene for konstitutiv og stimulert sekresjon.

Introduction

Kjemisk synaptisk transmisjon mellom nevroner er en viktig mekanisme for kommunikasjon i nervesystemet. Det er avhengig av utgivelsen av nevrotransmittere gjennom en dynamisk syklus av vesikkelfusjon og henting på den presynaptiske siden. Mange av proteinene som er involvert i vesikkel dynamikk har blitt identifisert; Men deres spesifikke bidrag til fenomenet er fortsatt ikke avklart ^en.

Vår forståelse er delvis begrenset av det faktum at de mest brukte analyser for ekso / endocytose er ikke alltid den mest hensiktsmessige. Flere studier relatert til vesikkelfusjon og dynamikk stole på elektrofysiologiske teknikker. Denne teknikken gir en optimal tidsmessig oppløsning og er utmerket for å undersøke den innledende fusjon av vesikler til plasmamembranen, men er ikke i stand til å oppdage mange av de underliggende molekylære hendelser som støtter presynaptiske funksjon. Elektronmikroskopi, på den andre siden, gir den fineste morphological beskrivelsen av hver enkelttrinn, men den dynamiske aspektet av arrangementet ikke kan fanges opp, fordi prøvene må være festet for å bli analysert.

Ankomsten av nye optiske opptaksteknikker ^2,3, i kombinasjon med fremskritt i fluorescerende molekylære prober utvikling ^4-6, muliggjør visualisering av exocytic prosesser i levende celler, og dermed gi nye nivåer av informasjon om den synaptiske struktur og funksjon.

Innledende studier utnyttet aktivitetsavhengige styryl fargestoffer (FM1-43 og relaterte organiske fargestoffer) ^7,8. State-of-the-art imaging teknikker ansette pH-følsomme varianter av grønt fluorescerende protein (GFP) (pHluorin) tjoret til luminale blemmer proteiner ^9. Disse probene er normalt slått av når den er tilstede i vesiklene på grunn av den lave pH-luminal. Etter fusjon med plasmamembranen, er vesikkel indre utsettes for den nøytrale ekstracellulære rom, pH- brått øker, avlaster proton-avhengige leskende av pHluorin og fluorescerende signal vises raskt. Som endringen i pHluorin er raskere enn fusjons hendelse, ved å overvåke fluorescens øker, kan vesikkel fusjon med membranen måles og analyseres. Fordi overflate pHluorin-merkede molekyler er endocytose, fluorescens-signalet deretter tilbake til basalnivå, og derfor den samme konstruksjon kan anvendes også til å overvåke vesikkel gjenvinning ^9.

Mens vesikkel-merket pH-sensoren sørger for visualisering eneste av disse vesikler som virkelig sikring med plasma membran, bildebehandling med høy romlig og tidsmessig oppløsning kreves for å beskrive i detaljer trinnene involvert i exo / endocytiske prosesser. Den optiske teknikk som gir nødvendig rom-tid-oppløsning er total intern refleksjon fluorescens mikroskopi (TIRFM), et program av fluorescens mikros ^10.

"> Forekommer total indre refleksjon ved grenseflaten mellom glassdeksel-slip og prøven. Når lysbanen når glasslokk-slip med en innfallende vinkel som er større enn den kritiske vinkelen, er eksitasjonslys ikke sendes inn i prøven, men er fullstendig reflektert tilbake. Under disse betingelser, et flyktig lys bølgeformer ved grenseflaten, og forplanter seg i mediet med lavere optisk tetthet (prøven). Etter hvert som intensiteten av det flyktige feltet avta eksponensielt med avstanden fra grensesnittet (med en inntrengningsdybde ca. 100 nm) bare fluoroforer i nærmeste nærhet til trekket glid kan være spent, mens de lenger borte fra grensen er ikke. I celler transfektert med GFP-konstruksjoner, tilsvarer denne dybde til proteiner uttrykt på plasmamembranen, eller i vesikulær struktur nærmer seg den. Som fluoroforer i cellens indre ikke kan bli eksitert, blir bakgrunnsfluorescens minimeres, og et bilde med et meget høyt signal / bakgrunns rotteio er dannet ^11.

Flere egenskaper gjør TIRFM teknikken av valg for overvåking blemmer dynamikk. Den perfekte kontrast og høyt signal-til-støy-forholdet tillate påvisning av meget lave signaler som stammer fra enkelt vesikler. Chip-basert image oppkjøpet i hver ramme gir den tidsoppløsningen nødvendig for å oppdage svært dynamiske prosesser. Til slutt reduserer minimal eksponering av celler til lys på noen annen planet i prøven sterkt fototoksisitet og gir langvarig intervallopptak ^12.

Dataanalyse er fortsatt den mest utfordrende og viktig med denne teknikken. Den enkleste måten å overvåke vesikkel fusjon er å måle akkumuleringen av reporter fluorescerende proteiner på celleoverflaten, over tid ^13. Som fusion øker, netto fluorescens signal øker også. Imidlertid kan denne metoden undervurdere prosessen, spesielt i store celler og i hvilebetingelser,fordi endocytose og fotoblekingsprosesser motvirke økningen i fluorescens intensitet på grunn av vesikkel-exocytose. En alternativ metode er å følge hver enkelt fusjons arrangement ^14. Denne siste metoden er svært følsom og kan avsløre viktige detaljer om fusion mekanismer. Men det krever manuelt valg av enkelthendelser, fordi helt automatiserte rutiner for å følge vesikler og å registrere svingninger av sine fluoriserende signaler er ikke alltid tilgjengelig. Observasjon av vesikkel dynamikk krever prøvetaking cellene ved høy frekvens. Dette genererer en stor mengde data som neppe kan analyseres manuelt.

Forslaget med denne artikkelen er å optimalisere TIRFM avbildningsteknikk for overvåking av basal og stimulert neurotransmitterfrigivning i SH-5YSY neuroblastom cellelinje, og for å beskrive, trinn-for-trinn, en prosedyre utviklet i laboratoriet for å analysere data, både på hel-celle og single-vesikkel nivåer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Axio Observer Z1	Zeiss	491912-9850-000	inverted microscope
Multiline Argon Laser Lasos 77	Lasos	00000-1312-752	multi-line (458/488/514 nm), 100 mW argon-ion laser
Laser TIRF slider	Zeiss	423681-9901-000
100X Objective	Zeiss	421190-9900-000	Oil, NA 1.45 Alpha-Plan
CCD Camera RetigaSRV Fast 1394	QImaging
LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter	Sutter Instrument Company
Software
Image ProPlus 6.3 Software	Media Cybernetics		spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination
Excel	Microsoft		photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses
GraphPad Prism 4.00	GraphPad Software, Inc.		statistical analysis