Eksperimentel Vurdering af Mouse Sociability Brug af en Automatiseret Image Processing Approach

Summary

Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til at kvantificere muse selskabelighed. Mus videofilmet når de bevæger sig og interagere i en særlig bur. Movie behandling giver mulighed for automatiseret kvantificering af selskabelighed med fremragende nøjagtighed og pålidelighed.

Abstract

Mus er den foretrukne model organisme til at teste lægemidler, der skal øge selskabelighed. Vi præsenterer en fremgangsmåde til at kvantificere muse selskabelighed hvor testen mus anbringes i et standardiseret apparat og relevante adfærd vurderes i tre forskellige sessioner (kaldet session I, II, og III).

Apparatet har tre rum (se figur 1), venstre og højre kamre indeholder et omvendt bæger, som kan rumme en mus (kaldet "stimulus mus").

I session I, skal prøven mus anbragt i buret og dets mobilitet er karakteriseret ved antallet af overgange foretaget mellem rummene. I session II, er en stimulus mus placeret under en af de omvendte kopper og selskabelighed af testen musen kvantificeres ved de beløb af tid, det tilbringer nær koppen indeholder den vedlagte stimulus musen vs. den tomme omvendt kop. I session III, er de omvendte kopper fjernet en d begge mus interagere frit. Selskabelighed af testen musen i session III kvantificeres ved antallet af sociale tilgange det gør mod stimulus mus og med antallet af gange, det undgår en social tilgang af stimulus mus.

Den automatiserede evaluering af filmen detekterer næsen af ​​testen mus, hvilket muliggør bestemmelse af alle beskrevne Socialt samvær foranstaltninger session I og II (i session III, fremgangsmåder identificeres automatisk, men klassificeres manuelt). At finde den næse, er billedet af et tomt bur digitalt subtraheres fra hver ramme af filmen og det resulterende billede er binariseres at identificere muse pixels. Musen hale fjernes automatisk, og de to fjerneste punkter i den resterende mus bestemmes; disse er tæt på næse og halerod. Ved at analysere bevægelsen af ​​musen og bruge kontinuitet argumenter, er næsen identificeret.

"Figur 1" src = "/ files / ftp_upload / 52.508 / 52508fig1.jpg" />
Figur 1. Vurdering af Sociability løbet 3 sessioner Session I (øverst):.. Akklimatisering af test musen til buret Session II (midten):. Test musen bevæger sig frit i buret mens stimulus musen er indesluttet i en omvendt kop Session III (nederst): Både test mus og stimulus mus får lov til at bevæge sig frit og interagere med hinanden.

Introduction

Nedsat selskabelighed er en af de primære symptom domæner i en række neurologiske lidelser, herunder autisme spektrum forstyrrelser (ASDs) ^1,2. Det alvorligt begrænser patienternes evne til at udvikle relationer og i høj grad påvirker patienter, familier og omsorgspersoner ^2,3.

I et forsøg på bedre at forstå den mekanisme underliggende forringet selskabelighed og udvikle behandlinger, har flere musemodeller undersøgt ^1,4-9. Én sådan stamme er Balb / c-mus, en indavlet stamme, der udviser forbavsende lav selskabelighed, ligner features, som findes hos patienter med ASD5 ^8-12. For eksempel BALB / c-mus viser en lavere frekvens af sociale tilgange og en sædvanligvis negativ reaktion på sociale tilgange af en stimulus mus (fx social unddragelse) end den schweiziske Webster komparator stamme ^10.

For at teste, om en foreslået behandling er virkningsfulde i stigende selskabelighed, er der behov for objektive mål. Et bredt accepteret ramme er at analysere selskabelighed i standardiseret apparat, som har tre rum (se figur 1).

De venstre og højre kamre hver indeholder en omvendt wire bæger, som huser en socialt fremtrædende stimulus mus. Testen mus frigives i apparatet til tre intervaller på 10 min (sessioner I-III); session I vurderer bevægelsesaktivitet af testen musen, mens sessioner II og III vurdere forskellige aspekter af testen musens selskabelighed.

I session I, test musen akklimatisere til apparatet. I denne session, er antallet af overgange, at testen musen gør mellem de forskellige rum målt. Vigtigere, Socialt samvær foranstaltninger opnået i standard tre rum apparat er afhængig af bevægelsesaktivitet, og reduceret bevægelsesaktivitet kan forvirre fortolkning af socievne data.

I session II, er testen musen bevæger sig frit og en stimulus mus er placeret under en af ​​de omvendte kopper (kontravægts). De stimulerende mus er 4 uger gamle udavlede ICR-mus, alders- og køn-matchede til test mus. Stimulus mus er indesluttet i en omvendt kop i den side, der er udpeget som den sociale rum, og en tom omvendt bæger placeres i den side, der er udpeget som den nonsocial rum. I session II er selskabelighed af testen musen kvantificeres ved at sammenligne den tid, det tilbringer i nærheden af "sociale" omvendt kop (under 2 cm væk) vs. tid, det tilbringer i nærheden af "nonsocial" omvendt kop, og af den tid det tilbringer i det sociale rum vs. den tid, det tilbringer i nonsocial rum. Swiss Webster komparator mus tilbringer betydeligt mere tid i det sociale rum og nær social inverterede cup sammenlignet med BALB / c-mus, der viser ingen signifikant præference for den socialeomvendt kop eller det sociale rummet ^12.

I session III, test- og stimulus mus lov til at interagere frit (omvendte kopper fjernes). Foranstaltninger af selskabelighed, stereotype adfærd og overgange mellem rum er pålideligt opnået i den tredje 10 min session gratis samspil mellem test og stimulerende mus og analyseret. I denne rapport er selskabelighed af testen musen kvantificeret via to foranstaltninger: 1) antallet af sociale tiltag det gør mod stimulus mus, hvor en social tilgang defineres som bevæger sig fremad (næse først) mod stimulus musen, så næse er mindre end 2 cm fra stimulus mus; 2) antallet af undgåelser sociale henvendelser fra stimulus musen. Testen mus anses for at være at undgå den fremgangsmåde, hvis det viser eller bevæger sig væk fra stimulus mus, eller hvis den midlertidigt stopper, ( "frysning opførsel") efter at stimulus musen har henvendt test mus. BALB /c mus viser et fald i antallet af sociale henvendelser mod stimulus mus og en stigning i antallet af negative reaktioner på de sociale tilgange ved stimulus mus, sammenlignet med den schweiziske Webster komparator stamme ^10.

Evalueringen af de adfærdsmæssige film har traditionelt været udført manuelt, dvs ved at se filmen omhyggeligt (muligvis med reduceret hastighed) og aktivering stopure for den tid musen tilbringer i en bestemt rum eller i nærheden af en af de omvendte kopper ^10. Denne metode kræver watching af filmen gentagne gange og er derfor meget tidskrævende. Ligeledes bliver nøjagtigheden begrænset af rater reaktionstid for stopuret målinger og evne til at opfatte, om musen er inden for 2 cm af den omvendte kop. I nyere arbejde, to forbindelser, (D-serin og D-cycloserin) har vist sig effektiv til at genskabe selskabelighed i BALB / c-mus ^9,10,12. Det er kendt, at både komponenter modusent NMDA-receptoren, som vides at spille en central rolle i social adfærd ^2,12. Et stort udvalg af forbindelser er kendt for at modulere NMDA-receptor-aktivitet i en række veldefinerede måder, og potentialet for et gennembrud i ASD behandling så fremskyndet evaluering af disse forbindelser til en prioritet og en hurtig automatisk metode til vurdering meget ønskeligt.

Beskrevet nedenfor er en automatisk analyse procedure udviklet til vurdering af muse selskabelighed. Det bruger billedbehandling metoder på alle rammerne af musen film til at identificere positionen af ​​musen eller mus. I sessioner I og II, den yderligere detekterer næse position og bruger den til at beregne Socialt samvær foranstaltninger. I session III, registrerer den automatisk alle tilgange, men manuel klassifikation (social tilgang, social unddragelse, eller andet) er påkrævet.

Protocol

Protokollen for den lette forklaringen er opdelt i 2 dele: 1) Eksperimentel procedure og 2) Automatiseret analyse. Alle dyr blev behandlet i overensstemmelse med den vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr ^15, og alle procedurer blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg.

1. Eksperimentel Procedure

1. Opsætning af buret, som er en sort ikke-reflekterende plexiglas rektangulær kasse (52 x 25 x 23 ^cm3) opdelt i tre rum: sociale, nonsocial og en neutral midterste rum (figur 1). Placer omvendte wire kopper i hver af de endelige rum under sessioner I og II (omtalt nedenfor) og huse stimulus musen under sessionen II.
2. Indstille kameraet på en sådan måde, at buret fylder synsfeltet. Da belysning kan forstyrre mus adfærd, opretholde en luminans på højst 3,5 lux inde i buret, der kommer fra indirekte lys fraen glødepære og målt på burets gulv i opadgående retning. Også bruge en infrarød lyskilde, som musene ikke kan fornemme, men kameraet kan registrere. Optag alle film i 720 x 480 standard definition.
3. Optag et enkelt billede af en tom bur til senere billedbehandling (kaldet "referenceramme"), og gemme som et gråtonebillede.
4. Session I: Indføre test musen ind i buret og bølge hånd over buret, hvilket indikerer starten af ​​sessionen (sammenlign Automated Analysis). Optag film i 10 min. Ved udgangen af ​​10 min, sætte musen tilbage til sin oprindelige bur.
5. Session II: Sæt stimulus musen under en af ​​de omvendte kopper (kontravægts).
6. Brug "Social venstre" eller "Social højre" knappen for at vælge, om stimulus musen er i den omvendte kop på venstre eller i omvendt kop til højre.
   BEMÆRK: Den omvendte kop med stimulus musen kaldes "social kop", mens den andencup "nonsocial cup". Rummet, hvor den sociale bæger er placeret kaldes sociale rum, rummet med nonsocial bæger er den nonsocial rum, og den midterste rum er "neutrale rum".
7. Indføre testen musen ind i buret. Wave hånd over buret for at angive starten af ​​sessionen. Optag film i 10 min. Vigtigere er det, holder mus i selskabelighed apparatet, før du fjerner de omvendte kopper til at begynde Session III.
8. Session III: Fjern de omvendte kopper, slipper både mus og tillade test- og stimulus mus til at interagere frit med hinanden. Wave hånd over buret for at angive starten af ​​sessionen. Optag film i 10 min. Ved udgangen af ​​10 min, sættes både mus tilbage i deres respektive bure.

2. Automatiseret Analyse

BEMÆRK: Kommandoerne i afsnit 2 er udstedt via en grafisk brugergrænseflade (se figur 2), der conselv kontrollerer vores software. Her forklarer vi trin-for-trin-behandling, som vores software tillader det; softwaren er også i stand til at udføre analysen i batch-mode uden brugerinput.

1. For hver film, udføre følgende procestrin:
   1. Load film (Klik på Load knappen).
   2. Vælg bur konfiguration, som fortæller analyseprogram placering af bur grænser, rum grænser og kop steder. Vælg en af ​​fire gemte konfigurationer eller manuelt justere alle koordinater.
      BEMÆRK: Konfigurationen normalt ikke ændrer sig fra et eksperiment til det næste, og kan derfor genbruges.
   3. For hver ramme af filmen, udføre følgende procestrin (2.1.3.1-2.1.3.6).
      1. Konverter rammen til gråtoner ved at klikke på "gråtoner" knappen.
      2. Digitalt trække gråtoner referenceramme (se trin 1.3) ved at klikke på knappen "Træk". BEMÆRK: Målet med dette trin er at gøre pixel values af rammen meget tæt på nul overalt undtagen for muse position.
      3. Binarize rammen ved at indstille alle pixels under en vis tærskelværdi til sort, alle pixels over dette niveau til hvid (klik på knappen "Binarize").
         Bemærk: Tanken er, at da musen pixels generelt har højere værdier end de resterende pixels, vil musen pixels bliver hvide og alle andre pixels sort. Den optimale tærskelværdi afhænger lysforholdene og kan bestemmes ved at vurdere musen form gennem en film. Hvis tærsklen er valgt for lavt, forekommer for stor musen, og pixels, der ikke hører til musen kan farves hvidt. Hvis tærsklen er for høj, musen bliver lille og kan disintegrere i adskilte stykker. I de optagede film, den optimale tærskelværdi var altid mellem 20 og 35 (på en skala fra 0 til 255).
      4. Erode ¹³ de binariseres billede e gange, derefter spile ¹³ 2e gange, så erode igen e gange, ved at trykke på knappen "EROD / Dil".
         Bemærk: Formålet med denne procedure er at fjerne halen. For beslutningen (720 x 480), der blev brugt, e = 3 arbejdede under alle forhold.
         Bemærk: Softwaren kontrollerer automatisk for tilstedeværelsen af ​​en hånd i billedet (under optagelsen af ​​film, er hænder viftede gennem billedet for at indikere begyndelsen af ​​en session). Hvis en hånd er til stede, vil der være usædvanligt mange hvide pixels i binariseret ramme, fordi hånden er meget større end en mus. Betingelsen for tilstedeværelsen af ​​en hånd er, at der er mere end 10.000 hvide pixels i binariseres ramme. Softwaren bestemmer begyndelsen af ​​sessioner I, II, og III, ved at detektere rækken af ​​frames, hvor håndbevægelser forekomme.
2. I sessioner I og II, fortsætter som følger:
   1. Detect den største tilsluttede komponent af sættet af hvide pixels (Klik på "LComp"). Bemærk: Formålet of dette trin er at fjerne hvide pixler, der ikke hører til musen, fx forårsaget af bevægelsen af stimulus musen i session II. Den største tilsluttede komponent er i næsten alle rammer musen.
   2. Bestem de to fjerneste hvide pixel (kaldet de "ender" af musen) ved at klikke på "Find Ends".
      Bemærk: Softwaren etablerer kontinuitet i de to ender, dvs for hver af enderne i det første billede, som af enderne i de efterfølgende rammer de tilhører. Den generelle idé er, at da frames registreres ved høj hastighed, kan enderne ikke rejse langt fra en ramme til den næste, så der for den korrekte fortsættelse af enderne fra en ramme til den næste, er, at der minimerer summen af ​​de afstande, enderne flytte. Se Diskussion for flere detaljer.
   3. Bestem hvilken ende af musen er næsen.
      1. Bestem, i hvilken retning en mus bevæger sig ved at observere, hvordan tyngdepunktet (COG)ændringer fra ramme til ramme (COG bevægelse er bevægelsen af ​​summen af ​​alle mus pixels).
         Bemærk: COG'en af et sæt af pixels p _1, ..., p _n med koordinaterne x _1, .., _xn er defineret ved:
         
         Mus bevæger normalt fremad (dvs. mod deres næse). I et afsnit af flere hundrede billeder, er der altid meget høj tillid til hoved / hale detektion.
         Bemærk: Softwaren bestemmer automatisk mod hvilken af ​​den detekterede ender musen bevæger sig; herpå er identificeret som næse og markeret med en rød cirkel i filmen. Når den detekterede næsen er markeret med en rød cirkel i hver ramme, kan brugeren kontrollere kvaliteten af ​​detekteringen.
3. I session III, fortsætter som følger:
   1. Detect to største komponenter af hvide pixler.
      1. Hvis begge er af acceptabel størrelse for amOuse og deres tyngdepunkter (COGS) er forenelige med musen tandhjul i den forudgående ramme, overveje disse to komponenter de to mus.
      2. Overvej musen størrelser acceptable, hvis de ikke har ændret med mere end 20% siden sidste frame, og overveje tandhjul på to på hinanden følgende rammer som kompatibel, hvis deres forskel er ikke større end afstanden en mus kan rejse i tiden mellem frames (denne afstand følger fra den maksimale mus hastighed, som kan bestemmes som led i forberedelserne af et eksperiment serie ved at analysere bevægelse af flere individuelle mus (som i sessioner i og II).
         Bemærk: Hvis de to største komponenter er ikke acceptable størrelser for en mus, eller de tænder er for forskellige fra dem i den foregående ramme, softwaren automatisk øger tærsklen binariseringen indtil de to største komponenter er af acceptabel størrelse og deres tandhjul er kompatible med dem af den foregående ramme.
   2. Klik testen musen iden første ramme. Brug analysen i 2.3.1 at identificere både test og stimulus mus i hver frame af sessionen III.
   3. Identificer rammerne i session III, hvor den ene mus socialt nærmer den anden. Bemærk: Softwaren gennemfører dette trin ved automatisk at kontrollere, at afstanden mellem mus er mindre end den typiske interaktion afstand af mus (vi bruger 2 cm).
   4. Når softwaren spiller en kort segment af filmen med den registrerede tilgang til brugeren, skal du klikke på en knap for at angive, om denne fremgangsmåde kan betegnes som en social tilgang af testen musen, social undgåelse af testen musen, eller ingen af ​​delene.
      Bemærk: Trin 2.3.4 kan automatiseres, hvis det er kendt, hvilke mus er testen mus. Da denne information går tabt når musene kommer for tæt på hinanden (eller klatre oven på hinanden), og da vi endnu ikke har fundet en måde at mærke mus på en måde, der kan påvises pålideligt efter vores software og gør ikke påvirke deres adfærd, har vi vendt tilbage tilmanuel klassificering for nu.
4. For at evaluere forarbejdede film, load film ved hjælp af Load knappen.
   1. Klik på Start Session 1 for at vise det første billede af sessionen 1 (eller Start Session 2 for at vise det første billede af sessionen 2).
   2. Klik på Start / Stop for at afspille og stoppe film.
      Bemærk: De behandlede film vil vise mus med hoved og hale markeret med forskelligt farvede cirkler. vises alle Socialt samvær foranstaltninger på skærmen og opdateres som filmen afspilles.
   3. Eksport Socialt samvær data i Excel-format ved at klikke på "Export".
   4. Klik på "Compile data" for at indsamle alle data af alle film i en mappe i en enkelt Excel-fil.

Representative Results

Figur 3 viser en farve ramme af en adfærdsmæssig film med en tom bur. Musen er ikke blevet indført i buret endnu. Placeringen af ​​kopper, (sociale og nonsocial) og rum grænser er overlejret. Farven ramme af tomme bur omdannes til 8 bit gråtoner, som vist i figur 4 og anvendes som referenceramme. Referenceramme subtraheres fra hver anden ramme i den optagede video.

Figur 5 viser en af rammerne fra filmen under sessionen I, igen med de rum grænser og kop positioner oven. Referenceramme subtraheres fra prøven ramme og resultatet, kaldet forskellen ramme, er vist i figur 6.

Figur 7 er det binariseret version af forskellen rammen. (Se afsnit 2.1.3.3). Figuren viser også positionen af ​​næsen (rød cirkel) og bunden af ​​tail (grå cirkel), som bestemt i punkt 2.2.4).

Når næsen position er etableret for hver frame af filmen, kan bane af muse analyseres på enhver ønsket måde. Figur 8 viser positionerne af muse næse (hvide cirkler) for en del af filmen, der dækker cirka 1.000 frames (~ 30 sek).

Figur 9 viser resultatet af en selskabelighed analyse for session I. Antallet af overgange mellem bur rum anvendes som et mål for lokomotorisk aktivitet (i det viste eksempel 59 overgange i 10 min angives normal bevægelsesaktivitet). Den tid i forskellige dele af buret tjene som en baseline at bedømme præference for det sociale rum / kop i session II.

Figur 10 viser resultatet af den selskabelighed analyse for session II. Af særlig interesse er de tidspunkter brugt nær den sociale vs. nonsocial kop (i den viste example 230,8 vs 72,3 sek) og den sociale vs. de neutrale og nonsocial rum (314,7 vs. 109,4 vs. 185,5 sek). Den klare skævhed til den sociale cup og rum er typiske for kontrolmus, og sammenligning med data fra session I (figur 9) viser tydeligt, at forspændingen er virkelig et resultat af tilstedeværelsen af en stimulus mus.

Figur 11 viser resultatet af den selskabelighed analyse for session III. Det store antal sociale tilgange (35 i 10 min) samt de overvældende positive reaktioner på de sociale henvendelser fra stimulus mus (9/10) er typiske for mus med normal selskabelighed.

Figur 2. Grafisk brugergrænseflade. Venligst cslikke her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. Tøm Cage. Dette anvendes som referenceramme efter omdannelse til grå skala. Den røde cirkel viser placeringen af ​​den sociale cup og nonsocial kop i den modsatte side. De lodrette hvide linjer opdele buret i forskellige rum og rektanglet viser den indre grænse af buret.

Figur 4. Gråtoner Version af figur 3.

Figur 5. Original Frame. En film ramme i gråtoner format. Den sociale cylinder er markeret med en hvid cirkel, ogen ekstra grå cirkel med en radius 2 cm større end den sociale cylinder henledes på afgrænse det område, hvor prøven mus betragtes som "tæt" på sociale cylinder. I det modsatte hjørne, er det nonsocial cylinder markeret med en grå cirkel og igen, en yderligere cirkel med en 2 cm større radius henledes på afgrænse det område, der anses for tæt på nonsocial cylinder. De lodrette hvide linjer opdele buret i forskellige rum og rektanglet viser den indre grænse af buret.

Figur 6. Difference Image. Billede opnået ved at subtrahere referencerammen fra prøven ramme.

Figur 7. binariseret billede. De pixels af difference billede, der overstiger en bestemt tærskel (30 i dette eksempel), anses musen pixels og er vist hvid. Den røde cirkel angiver næse og hvide cirkel er halen.

Figur 8. Mus Trajectory. De små hvide cirkler viser placeringen af næsen fra starten af sessionen I, indtil denne ramme blev fanget.

Figur 9. Resultater af Sociability Analyse for Session I. Tallene over de respektive bur rummene angiver de tidspunkter musen tilbragte i dem (i dette tilfælde 254,3 sek i venstre kammer, 155,2 sekunder i den neutrale rum, og 237,0 sek i den rigtige rum). Numrene inde i cirkler angiver de tidspunkter musen brugte tæt på respective kop ( "close" betyder mindre end 2 cm væk, eller inden for den ydre af de to cirkler): 140,0 sek tæt på venstre kop, og 105,6 sek tæt på den højre kop. Tallet i nederst i midten angiver, hvor ofte musen skiftet mellem de forskellige rum i buret (59 gange i eksemplet).

Figur 10. Resultater af Sociability Analyse for Session II. Tallene over rummene og inde i cirkler indikerer gange tilbragt i anden del af buret som i figur 9 / session I. Bemærk, at i session II, er der en stimulus mus i én af de omvendte kopper (venstre én i dette tilfælde), så dette bæger bliver den "sociale" kop. Ud over de foranstaltninger session I, tidspunktet testen musen tager at komme tæt (inden for 2 cm) til sociale cylinder til gives første gangi nederste højre for midten. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 11. Resultater af Sociability Analyse for Session III. Nummeret efter "metode" angiver antallet af sociale tiltag, som testen musen, tallene efter "Pos. Resp. "Og" Neg. Resp. "Tilstand antallet af positive og negative reaktioner fra testen musen til sociale tilgange ved stimulus musen.

Discussion

Ved at kombinere videooptagelser mus og automatisk film analyse, har vi skabt en overkommelig, pålidelig high-throughput screening teknik.

Nøjagtigheden af ​​den automatiserede analyse blev sammenlignet med resultaterne af manualen analyse for mere end 100 film. I langt de fleste af rammer (> 99%) af rammer, er næsen af ​​mus identificeres med god præcision. De fleste af de (få) misdetections har ingen virkning på selskabelighed foranstaltninger, således at omkring 80% af de film ikke kræver nogle rettelser.

I de film, der indeholder misdetections, langt det mest almindelige problem er, at hoved og hale er forvirret, så vi har inkluderet i softwaren en enkel måde at skifte hoved og hale til en film segment. Selv hvis film er set at kontrollere for og rette alle misdetections, kan denne kontrol ske på omkring 3 gange realtid hastighed, således at evalueringen tiden forbliver meget kort. De dele af filmenhvor musen ikke er tæt på en af ​​cylindrene kan ses på endnu højere hastighed.

Aftalen mellem alle automatisk og manuelt fastlagte Socialt samvær foranstaltninger er fremragende (forudsat at eventuelle misdetections er blevet rettet). Faktisk kvaliteten af ​​de bestemmes automatisk Socialt samvær foranstaltninger er overlegen i forhold til manuelt bestemt dem, fordi objektive kriterier konsekvent anvendes til at bestemme afstande og tider, mens manuel evaluering lider grænserne for menneskelig perception og reaktionstid. Disse grænser bliver mere alvorlige med højere visning hastigheder, som er ønskeligt at begrænse evalueringen tid.

Bemærkning vedrørende trin 2.2.2 .: Denne rutine gennemføres ved at reducere mængden af hvide pixels til sin grænse ved hjælp af standard billedbehandling værktøj ¹⁴ og beregning af afstanden mellem to grænselag pixels. At finde de fjerneste punkter er nyttigt, fordi næsen og halerodentendens til at være meget tæt på disse to ender.

For fuldstændighedens skyld er gennemførelsen af ​​kontinuiteten i enderne (trin 2.3.4) beskrevet nedenfor. I en given ramme med ender c og d, og en forudgående ramme med enderne a og b, om c tilhører en og d til b eller c tilhører B og D til en (se figur 12).

Figur 12. Kontinuitet Bestemmelse. Mus i lysegrå farve med næse og hale markeret som henholdsvis A og B er den oprindelige position. Mus i hvid farve med næse hale mærket c og d henholdsvis er placeringen af ​​musen i den næste ramme.

Den generelle idé er, at for den korrekte fortsættelse, summen af ​​de afstande, enderne er mindre end for den forkerte fortsættelse, fordi musen bevæger mindre end sin egen længde fra en ramme til den næste. I eksemplet (fig 2 δ ₁ = | c - a |, δ ₂ = | d - b |, Δ ₁ = | c - b |, og Δ ₂ = | d - a |, og sige, at fordi δ ₁ + δ ₂ <Δ ₁ + Δ _2, den korrekte fortsættelse er en → C og b → d. Et godt mål for den tillid af en sådan fastlæggelse er forholdet r = max (δ ₁ + δ _2, Δ ₁ + Δ ₂₎ / min (δ ₁ + δ _2, Δ ₁ + Δ _2), som beskriver, hvordan meget mere enderne ville rejse i en continuation versus den anden. Per definition r er større eller lig med 1. For aflange mus figurer, r er typisk større end 10, kun hvis musen formen bliver mere cirkulær (f.eks fordi musen står på bagbenene), r kan komme tæt på ene og fortsættelsen er upålidelig. For pålidelig fortsættelse, har en tærskel på r> 2.5 været brugt. Med denne tærskel, de sektioner af frames over hvilken kontinuiteten i enderne er etableret, ligger typisk i området fra hundreder til tusinder af rammer. For hvert afsnit, at fastslå, hvilken ende musen bevæger sig inden for et afsnit. Når kontinuitet i et afsnit er etableret, "tyngdepunkt" (COG, de gennemsnitlige koordinater for alle mus pixels) for hver ramme i afsnittet bestemmes. Forskellen i COG fra en ramme til den næste definerer hastigheden af ​​musen mellem de to rammer. Denne hastighed er projiceret på vektoren, der forbinder de to ender for at se, om og hvor meget musen bevæger blårARDS den første eller imod den anden ende. Det samlede bevægelse (som er enten mod den første eller den anden ende) er summation af bevægelserne af alle rammer.

Nærværende protokol kan ændres på flere måder at løse forskellige eksperimentelle behov. Hvis forskellige aspekter af musens bevægelse (f.eks den gennemsnitlige hastighed) er af interesse, kan disse ekstraheres fra den beregnede muse bane. Hvis lysforholdene er meget forskellige fra dem, der er beskrevet her, kan tærsklen i binariseringen trin, der giver musen pixels justeres. Selv ændringer som en anden bur facon kan implementeres ved at ændre vores nuværende bur konfiguration rutine.

Den beskrevne software lejlighedsvis forvirrer hoved og hale (på mindre end 20% af de film, der er behov for korrektion, fordi hovedet / hale flip ville påvirke vores evaluering). Vi skrev et praktisk værktøj, der giver brugeren mulighed for at identificere den første og the sidste frame af intervallet, hvor hoved og hale behov for at blive vendt, og derefter udføre denne korrektion med ét klik. Meget få film (et par procent) havde andre end hoved / hale flip problemer, for disse vi foretaget en mere generel korrektion værktøj, der giver brugeren mulighed for at specificere i hvilken del af buret testen muse næsen er under enhver interval. Bemærk, at der er behov for korrektion sker så sjældent, at effekten på evaluering tiden er lille.

Planlagte udvidelser ved protokollen er at også detektere mere socialt relevante adfærd, såsom at forfølge og anogenitale sniffing (som kan påvises ved at overvåge afstanden fra næsen af ​​testen musen til kroppen og anus af stimulus mus, henholdsvis). Stereotype adfærd kan også være detekterbar, fx opdræt, som kan detekteres fra ændringen i musen form. En anden interessant udvidelse er anvendelsen af ​​mus af forskellig farve, som bør være ligetil, så længe farven på testen end stimulus mus har god kontrast med farven på burets vægge og burets gulv.

Sammenfattende den beskrevne protokol har en eksperimentel og en billedbehandling del. I eksperimentet del, de vigtigste trin er at kontrollere belysningen og placeringen af ​​buret og derefter at registrere muse opførsel under tre sessioner (I: alene i bur, II: med begrænset stimulus mus, III: frit interagere med stimulus mus). I analysen del, de kritiske trin er at indlæse en film og bur konfiguration, til at udføre billedbehandling på hver film ramme til at bestemme næse og hale positioner og derefter at beregne statistikken er nødvendige for at kvantificere selskabelighed fra næse og hale baner.

En begrænsning ved den beskrevne fremgangsmåde er, at den kun er blevet testet for mus med hvid pels. Det er indlysende, at den automatiserede analyse vil arbejde lige så godt med andre fur farver så længe apparater vægge og gulv giverstærk kontrast til pels farve, men det er endnu ikke fastlagt.

En anden begrænsning er den manglende automatisering af evalueringen af ​​sessionen III. Det største problem for os, som for andre grupper, er at holde styr på, hvilke mus er den test musen og som stimulus musen i løbet af de hyppige Nærkontakt af mus. Vi har fundet, at vi kan løse dette problem med markører såsom farvede prikker mellem musenes ører, men alle de mærkningsmetoder, som vi har prøvet hidtil har irriteret mindste en del af musene og ændrede deres adfærd væsentligt. Derfor er vores nuværende analyse af sessionen III registrerer automatisk alle tilgange, men kræver manuel klassificering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plexiglas cage	Norva Plastics, Norfolk, VA	custom made	Dimensions and layout described in manuscript, can be adjusted according to needs. Use non-reflective plexiglas for to facilitate image processing
Wire cups	Kitchen plus	315	Use one to house stimulus mouse, one empty
Video camera	SONY	HDR-PJ790	Can be replaced by any camera with Comparable specifications
OpenCV (Image processing library)	Willow Garage	N/A	Any modern image processing library can be used.