Articolo metodologico

Pairwise crescita Concorso test per la determinazione della Fitness replica del virus dell'immunodeficienza umana

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DOI:

10.3791/52610

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4 maggio 2015

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1Department of Microbiology, University of Washington, 2Departments of Medicine and Laboratory Medicine, University of Washington, 3U.S Military HIV Research Program, Walter Reed Army Institute of Research, 4Henry M. Jackson Foundation

In questo articolo

Sommario

La competizione di crescita tra virus quasi isogenici fornisce una misura sensibile per determinare l'idoneità alla replicazione relativa. I protocolli qui descritti includono la costruzione di cloni ricombinanti di HIV-1, la competizione per la propagazione e la crescita del virus e metodi di analisi ottimizzati per produrre risultati sensibili e coerenti.

Abstract

I test di idoneità in vitro sono strumenti essenziali per determinare l'idoneità alla replicazione virale per virus come l'HIV-1. Per estrapolare l'idoneità alla replicazione virale sono state utilizzate varie misurazioni, che vanno dal numero di particelle virali per unità infettiva, al tasso di crescita in coltura cellulare e all'idoneità relativa derivata da saggi di competizione di crescita a cicli multipli. I test di competizione per la crescita forniscono una misurazione particolarmente sensibile della fitness poiché i virus competono per bersagli cellulari in condizioni di crescita identiche. Ci sono diversi fattori sperimentali da considerare quando si eseguono saggi di competizione per la crescita, tra cui la molteplicità dell'infezione (MOI), i tempi di campionamento e i metodi di rilevamento virale e di calcolo dell'idoneità. Ogni fattore può influenzare il risultato finale e quindi deve essere considerato attentamente durante il disegno sperimentale. Il protocollo qui presentato include passaggi che vanno dalla costruzione di un nuovo clone ricombinante di HIV-1 all'esecuzione di saggi di competizione per la crescita e all'analisi dei risultati sperimentali. Questo protocollo utilizza valori di parametri sperimentali che in precedenza avevano dimostrato di produrre risultati coerenti e robusti. Vengono discusse le alternative, poiché alcuni parametri devono essere regolati in base al tipo di cellula e ai virus studiati. Il protocollo contiene due metodi alternativi di rilevamento virale per garantire la massima flessibilità, in quanto la disponibilità di strumenti, reagenti e competenze varia da laboratorio a laboratorio.

Introduzione

Viral idoneità replica è definita come la capacità di un virus per produrre progenie infettiva in un dato ambiente 1 ed è un fattore importante che contribuisce a determinare la prevalenza di una variante del virus a livello della popolazione nel tempo 2. Come studi in vivo di fitness non sono realizzabili con virus umani patogeni, come l'HIV-1, vari in vitro e ex vivo replica dosaggi di fitness sono stati sviluppati per studiare gli effetti sul benessere derivanti dalla resistenza ai farmaci e le mutazioni di fuga del sistema immunitario, epistasi e l'evoluzione delle popolazioni virali 3-6. Tra i diversi dosaggi di fitness, analisi della concorrenza crescita sono riconosciuti a produrre misure più sensibili e validi di differenze di fitness, come due o più varianti virali competono per la stessa popolazione di cellule sotto precisamente le stesse condizioni ambientali, come avviene in vivo 1,7,8. Prima di avviare esperimenti di competizione di crescita, molti variables necessario determinare, compreso l'uso di diverse molteplicità di infezione (MOI), rapporto input virale, e tempi di campionamento per l'analisi. Abbiamo studiato gli effetti di questi parametri sulla cinetica di crescita virale e sul risultato di esperimenti di competizione, e abbiamo individuato i fattori chiave necessari per le misure di resistenza del virus HIV-1 di fitness in coltura cellulare 9.

In aggiunta alle variabili saggio, ci sono una varietà di metodi per la quantificazione varianti virali in esperimenti di competizione crescita. Bulk 10,11 o sequenziamento clonale 12,13 è stata utilizzata per determinare il rapporto dei virus concorrenti basati sulle frequenze nucleotidiche del sito (s) di interesse. Idoneità relativa è derivato da cambiamenti in questo rapporto nel tempo. Questo metodo è conveniente come servizi di sequenziamento del DNA sono ampiamente disponibili. Il metodo (PASS) allele-specifica sequenziamento parallelo permette il sequenziamento in più siti e l'individuazione di ricombinanti 14 , Ma richiede anche reagenti appositamente sviluppati e sistemi di rilevazione. Essenzialmente, questi metodi sono stati sviluppati per studiare ceppi virali con un piccolo numero di differenze nucleotidiche in una regione di interesse. Altri metodi usano un piccolo gene reporter 15 o sinonimi mutazioni 4,16-18 come tag per distinguere i virus concorrenti di sequenziamento, le analisi di monitoraggio eteroduplex (HTA) 4,7,17,19 o invertire in tempo reale reazione di trascrizione-quantitativo a catena della polimerasi (RT-qPCR) 15,16,18,20, ognuno dei quali può essere reso applicabile a studiare ceppi competere indipendentemente similarità di sequenza. Un passo ulteriore è necessario per introdurre modifiche in genomi virali e il saggio RT-qPCR richiede anche reagenti e strumentazioni specifiche. Abbiamo scoperto che il sequenziamento di massa rese Sanger risultati comparabili 9.

A seguito di concorso crescita, virale idoneità replica viene presentata come il fitness parente, o un rapporto di idoneità tra two varianti virali. L'idoneità relativa di un virus può essere definita come la percentuale finale di una variante virale viene normalizzato mediante la sua proporzione iniziale in inoculo o come la differenza netta tasso di crescita tra i due virus concorrenti. Abbiamo scoperto che il secondo metodo, utilizzando punti di dati longitudinali solo all'interno della fase di crescita esponenziale, ha prodotto i risultati più robusti 9,20.

In vitro fitness sono utilizzati principalmente per studiare cloni biologici 6-8 e cloni molecolari infettivi di HIV-1. Quest'ultimo, essendo suscettibili di manipolazione genetica, sono spesso impiegati per studiare l'effetto sulla forma fisica di particolari mutazioni o sequenze specifiche di interesse 3-5,21,22. I seguenti protocolli descrivono un flusso di lavoro dal punto di costruire nuovo full-length HIV-1 cloni molecolari infettivi usando HIV-1 vettori contenenti un tag sequenza, introducendo mutazioni di interesse, rendendo stock virali e stabilendo cinetica di crescita virale, Di eseguire il test concorso crescita e calcolando fitness relativa (Figura 1).

Utilizzando i nostri procedure ottimizzate, abbiamo creato tre ricombinanti HIV-1 mutanti e determinato la loro idoneità replica. Il clone molecolare ricombinante è stato costruito sostituendo il gag-p24 regione HIV-1 gene di pNL4-3, un plasmide contenente un integrale genoma infettiva del virus HIV-1 ceppo NL4-3 laboratorio, con un COTB sintetico (Centro-Of Albero, sottotipo B) sequenza gag-p24 23 per creare il ceppo prototipo. Modifiche amminoacidi singoli (T186M, T242N e I256V) sono stati poi introdotti per creare tre cloni mutanti. Ogni mutante era gareggiato contro il virus prototipo per osservare l'impatto idoneità di ogni mutazione nel data background genetico. I tre mutanti dimostrato una diversi livelli di replicazione fsitness da lieve a significativamente inferiore al virus prototipo. La mutazione T242N è stato precedentemente segnalato per avere è d moderatass costano 24-26, simile al risultato mostrato in questo studio. Il costo idoneità delle altre due mutazioni non era stato riportato in precedenza.

Protocollo

NOTA: Il protocollo, come descritto di seguito, non comprende le informazioni che ti identificano pazienti e non è quindi considerata soggetti umani di ricerca presso l'Università di Washington Institutional Review Board o soggetti umani Division.

1. Costruzione di chimerico HIV-1 NL4-3 cloni molecolari

1.1) Amplify Inserisci DNA Fragment

  1. Progettare primer chimerici. Il 5 'metà di entrambi avanti e invertire primer contengono una sequenza di HIV-1 vettore, al quale verrà inserito il frammento. La 'metà dei primers 3 deve contenere la fine della sequenza dell'inserto (Figura 2). Verificare che la sequenza di innesco chimerico conserva le originali quadri di lettura aperti.
    1. Utilizzare primers almeno 20 basi di lunghezza, con una temperatura di fusione superiore o uguale a 60 ° C, ~ 50% di contenuto di GC, e una bassa tendenza a formare dimeri di primer, eterodimeri e / o strutture forcella. Valutare queste proprietàutilizzando lo strumento web OligoAnalyzer ( https://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/ ).
  2. Uso PCR 27 ei primer chimerici per amplificare DNA inserito (figura 2). Per ogni reazione di PCR, utilizzare 1X buffer di alta fedeltà, 0.2 dNTP mm, 1 U di alta fedeltà DNA polimerasi, 0,5 micron di primer forward chimerico, 0,5 micron di primer chimerico inverso, e 1 pg0 ng di campione di DNA trasportano regione inserita. Aggiungere dH 2 O ad un volume finale di 50 pl.
  3. Impostare passi cicli termici come segue: Eseguire un passo iniziale denaturazione del DNA a 98 ° C per 10 sec. Amplificare con 30 cicli di denaturazione del DNA a 98 ° C per 10 sec e DNA ricottura a 3 ° C superiore alla temperatura di fusione più bassa delle due primers per 20 sec. Eseguire una estensione finale a 72 ° C per 10 min. Conservare prodotti di PCR a 4 ° C.
  4. Prendere 5 ml di prodotti di PCR dallapasso precedente ed eseguire l'elettroforesi su gel di agarosio 28.
    1. Utilizzare un gel allo 0,7% di agarosio, tampone 1x TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA), 0,5 mg / ml di etidio bromuro (EtBr) concentrazione finale e 1 kb scala come il marcatore dimensioni del DNA. Set tensione di alimentazione di 5 V / cm di distanza tra gli elettrodi. Arrestare il elettroforesi quando il carico colorante migra attraverso circa 2/3 della lunghezza del gel. Visualizzare il gel utilizzando un sistema di documentazione gel 28.
      NOTA: EtBr è un sospetto cancerogeno e deve essere correttamente smaltiti, da regolamento dell'istituzione. I guanti devono essere sempre indossati quando si maneggia gel contenenti EtBr. Cambiare per nuovi guanti dopo EtBr movimentazione finitura contenenti materiale e prima di manipolare altri materiali o attrezzature per evitare la contaminazione incrociata.
  5. Se viene rilevata una sola banda di DNA di dimensioni corrispondenti al prodotto di PCR desiderato, purificare il resto del prodotto PCR utilizzando un kit commerciale come QIAquick PCR Purification Kit accordozione ai protocolli del produttore.
    1. Se altri, bande non specifici sono presenti anche, utilizzare il resto del prodotto della PCR per eseguire elettroforesi su gel preparativo. Utilizzare gli stessi parametri e le condizioni di cui al punto 1.1.4. Assicurarsi che il pozzo gel è abbastanza grande da caricare ~ 45 ml di prodotti di PCR. Tagliare la banda di interesse ed estrarre il DNA dal gel utilizzando QIAquick kit estrazione gel secondo protocolli del produttore.

1.2) introdurre l'inserto Frammento in tutta lunghezza infettiva dell'HIV-1 sottotipo B Vector (pNL4-3)

  1. Utilizzare prodotti di PCR purificati dal punto 1.1.5 come primer PCR. Utilizzare pNL4-3VifA 20 come stampo di DNA in una reazione PCR e utilizzare pNL4-3VifB 20 come modello nella altra reazione (Figura 2). Per ciascuna reazione di PCR, utilizzare 1x tampone alta fedeltà, 0.2 mM dNTPs, 2 U di alta fedeltà polimerasi DNA, 500 ng di DNA primer e 50 ng di DNA stampo in un volume finaleume di 50 ml. Impostare i parametri del ciclo termico a: 98 ° C per 30 sec, 35 cicli a 98 ° C per 10 sec, 48 ° C per 1 min e 72 ° C per 10 minuti, seguito da 72 ° C per 10 min.
  2. Aggiungere 10 U di Dpn I a 50 microlitri della reazione PCR e incubare a 37 ° C per 1 ora per digerire il DNA stampo. Assicurarsi che il DNA plasmide è isolato da un ceppo batterico metilazione competente, ad es., TOP10 chimicamente competente Escherichia coli.
  3. Uso Dpn I digerito prodotto per trasformare cellule batteriche competenti. Utilizzare trasformazione heat-shock con TOP10 chimicamente competente E. coli, secondo il protocollo del produttore. Per selezionare, per cellule batteriche contenenti il ​​plasmide ricombinante, utilizzare Luria Broth (LB) piastre di coltura contenente 100 mg / L carbenicillina.
    1. Raccogliere ~ 10 colonie ben separate e crescere ogni separatamente in 3 ml di terreno LB liquido contenente 100 mg / L carbenicillina e incubare a 30 ° C in unshaker O / N.
    2. Utilizzare QIAprep Spin kit Miniprep per isolare DNA plasmidico dalla coltura liquida batterica, secondo il protocollo del produttore.
  4. Utilizzare doppia digestione di restrizione 29 per determinare se il DNA plasmide contiene il corretto inserimento. Assicurarsi che uno dei siti di restrizione esiste soltanto all'interno della regione inserita e l'altro sito di restrizione esiste solo una volta nel vettore HIV-1, al di fuori della regione inserita.
    1. Digest almeno 300 ng di DNA plasmidico in un volume finale di reazione di 10 microlitri. Selezione buffer di restrizione, temperatura di incubazione e tempo di incubazione secondo protocollo degli enzimi di restrizione selezionate del produttore. Prendete 9 ml di elettroforesi del DNA e gel run digerito come descritto al punto 1.1.4. Selezionare plasmidi ricombinanti che hanno bande di DNA delle dimensioni previste.
  5. Confermare l'integrità sequenza dei plasmidi ricombinanti di sequenziamento Sanger. Mentre rari, indesideratimutazione (s) può essere introdotto durante le reazioni PCR.
    1. Sequenza entrambi i filamenti del DNA plasmide. Seguire le istruzioni riportate al punto 1.1.1.1 per progettare primer di sequenziamento. Inoltre, affinché il forward e reverse primer di sequenziamento ricottura almeno 50 bp a monte ea valle della regione inserita nel plasmide ricombinante, rispettivamente.
    2. Invia plasmide DNA e primer di sequenziamento di un fornitore di servizi di sequenziamento del DNA commerciale. Preparare campione di DNA e primer come specificato dal fornitore del servizio.
  6. Fare un magazzino privo di endotossine del DNA plasmide mutato utilizzando un kit di DNA plasmide gratuito Endotoxin secondo il protocollo del produttore. Preparare almeno 1 mg di privo di endotossine DNA plasmidico per trasfezione nel passaggio seguente.

1.3) Introdurre in piccola scala mutazioni Via mutagenesi sito-specifica

  1. Progettare primer mutageni con sovrapposizione in avanti e reverse primer contenenti la mutat desiderataion (s). Posizionare la base (s) da sostituire, inserito o eliminato a metà del primer, affiancato da 10-15 basi omologhe. Seguire le istruzioni riportate al punto 1.1.1.1.
  2. Utilizzare PCR per sintetizzare plasmidi mutanti. Per ogni reazione di PCR, utilizzare 1x tampone alta fedeltà, dNTP 10 mm, 2 U di alta fedeltà DNA polimerasi, 0,5 micron di primer forward mutageno, 0,5 micron di primer mutageno inversa e 50 ng di pNL4-3VifB chimerico, dal punto 1.2.6 , in un volume finale di 50 pl. Impostare i parametri del ciclo termico a: 98 ° C per 30 sec, 25 cicli a 98 ° C per 10 sec, 48 ° C per 1 min e 72 ° C per 10 minuti, seguito da 72 ° C per 10 min.
  3. Ripetere il punto 1.2.2 a 1.2.6.

2. Generazione di Viral Archivio Utilizzando Trasfezione

  1. Calcolare la quantità di virus azione desiderata e plasmide DNA richiesto. Con un titolo virale di 10 4 IU / ml o superiore, 1,8 ml di virus è sufficiente per due serie di concorso crescita assays, compresi monoinfections, ogni fatto in triplice copia. Per una trasfezione fatto in un 6-pozzetti, circa 1,8 ml surnatante viene raccolto per pozzetto. Occorre Uno pg di DNA plasmidico per ogni trasfezione fatto in una piastra da 6 pozzetti.
  2. Per ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti, preparare 100 ml di miscela di trasfezione, ad es., Consistente in 1 ml X-tremeGENE 9 reagente di trasfezione (o prodotto analogo), 1 pg di DNA plasmidico e DMEM senza siero.
    1. Determinare il volume di DNA plasmidico necessario, utilizzando 1 mg di DNA plasmidico per pozzetto. Assicurare che la concentrazione finale del DNA plasmidico è almeno 50 ng / ml.
    2. Determinare quanto è necessario mezzo privo di siero (DMEM) per pozzetto utilizzando la formula: Volume totale di DMEM a pl = 100 l - Volume DNA microlitri.
  3. Aggiungere 10 6 HEK 293T-17 (ATCC) cellule / pozzetto in 2 ml di mezzo di propagazione (siero fetale bovino DMEM + 10% (FBS)) in una piastra da 6 pozzetti. Incubare per 1 ora a 37 ° C in un5% di CO 2 nell'atmosfera. Seed come molti pozzi, se necessario (determinati nella fase 2.1).
  4. Per preparare la miscela di trasfezione, aliquote il volume appropriato di DMEM senza siero, come sopra determinato, in una provetta da 1,8 ml in polipropilene, e quindi aggiungere il reagente di trasfezione.
    1. Reattivo Pipettare direttamente nella soluzione dei media, non aggiungere alla superficie in plastica del provetta. Aggiungere plasmide DNA scorso. Pipettare su e giù delicatamente per mescolare la soluzione. Incubare per 15 minuti a RT (15 ° C a 25 ° C) per consentire la formazione di complessi trasfezione.
    2. Aggiungere la miscela in maniera goccia a goccia a cellule seminate nella piastra da 6 pozzetti. Scuotere o agitare i pozzi per garantire una distribuzione uniforme dei complessi trasfezione delicatamente.
    3. Piastre di tenuta di involucro di plastica.
  5. Incubare culture a 37 ° C in atmosfera di CO 2 5% per 48 ore.
  6. Utilizzare una pipetta per raccogliere attenzione e trasferire il surnatante in una provetta da 15 ml through un top 0,22 micron filtro.
  7. Utilizzare pipetta di trasferire 250 microlitri o più del surnatante filtrato a 1,8 ml provette per microcentrifuga con guarnizioni in gomma nei coperchi.
  8. Conservare surnatanti filtrato a -80 ° C fino al momento dell'uso.

3. Determinare infettiva Titer degli stock virale su cellule periferiche mononucleate del sangue (PBMC)

  1. Stimolare PBMC con fitoemoagglutinina (PHA). Per una azione virale, seme 2 x 10 6 PBMCs in Modified medio completo di Iscove Dulbecco (cIMDM; IMDM integrata con 20 U / ml di interleuchina umano 2 (HIL-2), il 10% del feto siero bovino e 1% di penicillina / streptomicina) integrato con PHA (1,5 mcg / ml). PBMC Seed a 2 x 10 6 cellule / ml. Incubare PBMC a 37 ° C in atmosfera di CO 2 5% per 72 ore.
  2. Harvest PHA stimolato PBMCs. Trasferimento non aderente PHA-PBMC in una provetta da 50 ml. Spin provetta a 228 xg per 10 min. Rimuovere con attenzione il surnatante senza disrupting il pellet di cellule. Risospendere il pellet di cellule ad una concentrazione finale di 2 x 10 5 PBMC / ml in cIMDM.
  3. Seed 2 x 10 4 PHA stimolate PBMC / bene in 100 l / pozzetto cIMDM in fondo piastra da 96 pozzetti turno.
  4. Effettuare una diluizione 1:10 del titolo virale. Poi, a partire dal primo magazzino diluita, fare dodici diluizioni seriali 3-fold in un piatto principale a 96 pozzetti. Questo schema di diluizione è raccomandato per rilevare titoli virali nell'intervallo 4 Ottobre-6 Ottobre unità infettiva (UI) per ml.
    1. Ad esempio, aggiungere 20 ml di virus stock da 180 microlitri mezzi nella provetta da 1,5 ml. Mescolare la diluizione pipettando con cautela. Poi il trasferimento di 90 l di brodo diluito in 180 ml supporto del primo pozzo e mescolare bene pipettando.
    2. Continuare serie di diluizioni trasferendo 90 microlitri dal pozzo di corrente a 180 microlitri supporti nel pozzo successivo undici più volte. Aumentare o diminuire la diluizione iniziale se titoli superiori a 10 6 IU / mlo inferiore a 10 UI / ml a 4 sono previsti rispettivamente.
  5. Aggiungere 40 ml di magazzino virale in serie diluito dalla piastra di diluizione maestro alla piastra PBMC testa di serie (dal punto 3.3) in quadruplicato. Incubare le piastre a 37 ° C in atmosfera di CO 2 5% per 16-24 ore.
  6. Rimuovere con cautela 100 ml di surnatante da ciascun pozzetto, e sostituirlo con 160 ml di cIMDM fresca per un volume totale di 200 microlitri / pozzetto. Incubare le piastre a 37 ° C con 5% di CO 2 nell'atmosfera (giorno 1).
  7. Nei giorni 4, 7, 10 e 13 di trasferimento 100 ml di surnatante da ogni pozzetto a 100 buffer di rottura microlitri (2% TritonX-100 in PBS), e sostituire con 100 ml di cIMDM fresco. Conservare il surnatante a -20 ° C.
    1. Mantenere il campionamento e l'aggiunta di cIMDM fresco ogni tre giorni fino a quando il titolo si stabilizza.
  8. Determinare la dose del 50% coltura tissutale infettiva (TCID 50) del titolo virale p24 ELISA utilizzando il giorno 7 e 13 campioni come descritto al punto 4.
    1. Se il TCID 50 ottenuto dal giorno 13 è nettamente superiore al titolo di giorno 7, il titolo del virus può avere bisogno di più tempo per espandersi. Ripetere il p24 ELISA utilizzando campioni successivi fino a quando i titoli infettive provenienti da due punti di tempo di campionamento diventano stabili (o diminuzione). Selezionare i titoli di campioni con i più alti titoli.

4. ELISA (Enzyme Linked Immunoabsorbant Assay) Individuazione del virus HIV-1 p24 per la determinazione virale contagiosa Titer

NOTA: Il seguente protocollo è stato sviluppato utilizzando piastre di cattura dell'antigene p24 preparati nel nostro laboratorio 30. Commercial HIV-1 p24 ELISA piastra / kit può essere utilizzato anche, seguendo il protocollo del produttore.

  1. Prima di lavorare con i campioni, preparare scorte di lavoro di anticorpo primario (coniglio anti-HIV-1 SF2 p24 antisiero).
    1. Scongelare antisiero p24 a temperatura ambiente.
    2. Mescolare 2,5 ml di glicerolo con 2 ml di 10% FBS in phosphatsalina e tampone (PBS).
    3. Aggiungere 0,5 ml di antisiero e mescolare.
    4. Conservare 1 ml di aliquote a -20 ° C.
  2. Scongelare i campioni dal punto 3.7 in un incubatore a 37 °.
  3. Lavare la piastra di cattura p24 5 volte con tampone di lavaggio (1x PBS con 0.05% di Tween-20).
  4. Aggiungere 50 ml / pozzetto di diluente campione (1% di albumina sierica bovina (BSA), 0.2% di Tween-20 in RPMI-1640), poi aggiungere 50 ml di campione pozzetti. Includere almeno tre pozzi con diluente per campioni solo come controlli finte / negativi. Incubare per 2 ore a 37 ° C o O / N a 4 ° C.
  5. Preparare la soluzione anticorpo primario fresco prima dell'uso. Fare un 1: 2.000 volte la diluizione dell'anticorpo primario scorte di lavoro utilizzando il diluente anticorpo primario (12% FBS in RPMI-1640). Assicurare preparare sufficiente per l'uso della soluzione 100 pl per ciascun campione / controllo pozzetto in una piastra a 96 pozzetti.
    1. Ad esempio, per fare una soluzione sufficiente per un piastra a 96 pozzetti, aggiungere 5 ml di worki anticorpo primariong scorte al diluente anticorpo primario per un volume finale di 10 ml.
  6. Lavare piastra di cattura per 5 volte con tampone di lavaggio.
  7. Aggiungere 100 microlitri della soluzione di anticorpo primario in ciascun pozzetto. Incubare per 1 ora a 37 ° C in atmosfera di CO 2 5%.
  8. Preparare la soluzione di anticorpo secondario fresco prima dell'uso. Fare un 1: 14.400 volte diluizione anticorpo secondario (1 mg / ml di capra anti-coniglio HRP) utilizzando il diluente anticorpo secondario (7% FBS, 0,01% Tween-20 in RPMI-1640). Per ridurre gli errori di pipettamento, eseguire una diluizione seriale in due fasi. Assicurare preparare sufficiente per l'uso della soluzione 100 pl per ciascun campione / controllo pozzetto in una piastra a 96 pozzetti.
    1. Ad esempio, per fare una soluzione abbastanza per una piastra a 96 pozzetti, aggiungere prima 1 ml di anticorpo secondario a 99 ml di diluente anticorpo secondario. Aggiungere quindi 70 ml di prima diluizione al diluente anticorpo secondario per un volume finale di 10 ml.
  9. Lavare la piastra cattura 5 times con tampone di lavaggio.
  10. Aggiungere 100 microlitri della soluzione di anticorpo secondario in ciascun pozzetto. Incubare per 1 ora a 37 ° C in atmosfera di CO 2 5%.
  11. Lavare la piastra 5 volte con tampone di lavaggio.
  12. Aggiungere 100 ml di substrato RT TMB. Incubare 30 minuti a temperatura ambiente in un contenitore chiuso per proteggere dalla luce.
  13. Aggiungere 100 ml di soluzione di arresto RT (1 NH 2 SO 4).
  14. Leggere l'assorbanza a 450-650 nm in ogni pozzetto usando un lettore di micropiastre. Utilizzare il valore di assorbanza di segnare ogni bene come infetto o non infetto. Si consideri un pozzo per contenere virus infettivo se l'assorbanza è almeno tre volte superiore al valore letto da pozzetti di controllo finte / negative. Calcola TCID 50 del titolo virale utilizzando il metodo di Reed-Meunch 31.

5. Stabilire Viral crescita Cinetica

5.1) monoinfezione

  1. Seed 3 x 10 5 PHA-stimolata PBMC / bene in 48 pozzettis in un volume totale di 500 microlitri / pozzetto. Conservare le piastre di coltura a 37 ° C in atmosfera di CO 2 5% fino inoculazione.
  2. Per ogni virus, preparare un inoculo contenente 6.000 UI in 2 ml di cIMDM.
  3. Seminare pozzi in triplice copia, con l'aggiunta di 500 ml di inoculo (1.500 UI) alle cellule seminate. Il volume finale della coltura cellulare infettata è di 1 ml / pozzetto e la MOI è 0.005.
  4. Aliquotare 200 ml di inoculo rimanente in ciascuna delle due piastre a 96 pozzetti per l'isolamento di RNA, una delle quali viene salvato come backup.
  5. Incubare culture a 37 ° C in atmosfera di CO 2 5% per 16-24 ore.
  6. Culture Lavare 16-24 ore dopo l'inoculazione.
    1. Rimuovere e gettare 750 ml di cultura surnatante.
    2. Aggiungere 750 ml di cIMDM fresco. Avvolgere piastre in pellicola e di plastica di rotazione per 10 minuti a 300 x g. Rimuovere e gettare 750 microlitri surnatante.
    3. Aggiungere 750 ml di cIMDM fresco. Incubare a 37 ° C con 5% di CO 2 amosfera (giorno 1).
  7. Culture Esempi quotidiani dal giorno 2 al giorno 7.
    1. Trasferire 500 ml di cultura surnatante in una provetta 1,8 ml centrifuga. Spin per 1 min a 3000 x g.
    2. Trasferire 200 ml di supernatante privo di cellule alle due piastre di esempio 96 pozzetti per l'isolamento di RNA, risparmiando così una piastra come backup. Conservare supernatanti a -80 ° C fino isolamento dell'RNA.
    3. Aggiungere cIMDM 500 microlitri fresca ogni cultura. Incubare a 37 ° C in atmosfera di CO 2 5%.
    4. Eliminare le culture in Wescodyne alla fine dell'esperimento.
    5. Isolare RNA da 200 ml di surnatante (utilizzare i kit commerciali come QIAamp Viral RNA Mini Kit) in seguito il protocollo standard del produttore. Per un gran numero di campioni, utilizzare la Qiagen QIAxtractor.
    6. Conservare i campioni di RNA a -80 ° C fino a sintesi del DNA.

5.2) cDNA Synthesis (trascrizione inversa)

  1. Per ogni RNA sampio, aggiungere 1.2 nmol di dNTP e 1,2 pmol di sintesi del DNA primer (5'-GTTGATCCTTTAGGTATCTTTCCACAGC-3 ', HXB2 nucleotide 7968-7995) a 10 ml di RNA virale. Aggiungere acqua ad un volume finale di 14 microlitri. Flick la provetta per miscelare e spin brevemente per raccogliere il liquido sul fondo della provetta.
  2. Incubare la miscela per 5 minuti a 65 ° C, poi mantenere a 4 ° C fino alla preparazione della miscela master.
  3. Preparare master mix utilizzando 5x primo filamento tampone (250 mm Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl 2), 5 mM DTT, 120 U di SuperScriptIII e 240 U di RNase Inhibitor. Aggiungere acqua al volume finale di 10 pl.
  4. Aggiungere 10 ml di master mix di miscela di RNA, sfiorare per mescolare e girare per la raccolta.
  5. Incubare la miscela per 90 min a 50 ° C per permettere la sintesi di cDNA. Incubare per 15 minuti a 70 ° C per inattivare la trascrittasi inversa. Mantenere a 4 ° C, se necessario.
  6. Aggiungere 2 U di RNasi H, sfiorare per mescolare, e poi girare a raccogliere.
  7. Incubare 20 mina 37 ° C. Conservare cDNA a -20 ° C.

5.3) cDNA Quantificazione Uso qPCR Sistema

  1. Preparare una serie di diluizioni standard. Do 10 volte diluizione seriale, da 3 x 10 6 copie / ml fino a 30 copie / ml, di pNL4-3VifA. Utilizzare acqua distillata per diluizioni. Preparare la serie di diluizioni standard fresco prima dell'uso o preparare piccoli lotti e conservare a -20 ° C. Non congelare-scongelare gli standard più di tre volte.
  2. Impostare una piastra di reazione qPCR 96 pozzetti. Assicurarsi che ciascuna piastra contiene almeno un pozzetto di controllo negativo, un triplice copia della serie di diluizioni standard, e almeno un duplicato di ciascun campione di cDNA.
  3. Per ogni reazione qPCR, utilizzare 12,5 ml di qPCR master mix, 0,2 micron sonda, 0,8 mM ognuno dei primer in avanti e all'indietro e 1 ml di cDNA o la serie di diluizioni standard o acqua / tampone (per il controllo negativo). Aggiungere acqua fino ad un volume finale di 25 microlitri. La sonda qPCR è luce sensitive. Tenerlo in un contenitore chiuso.
    1. Per rilevare cDNA derivato dal clone molecolare basato pNL4-3VifA, utilizzare il VIFA primer sonda: VifAB primer forward (GGTCTGCATACAGGAGAAAGAGACT), VIFA primer reverse (5'-AGGGTCTACTTGTGTGCTATATCTCTTTT-3 ') e sonda VifAB (6FAM-5'-CTCCATTCTATGGAGACTC-3 '-MGBNFQ). Per cDNA derivato da clone basato pNL4-3VifB, utilizzare il VifB primer sonda: VifAB primer forward, sonda VifAB e VifB primer reverse (5'-CACCTGCGTGCTATACCTTTTCT-3 ').
  4. Impostare parametri ciclismo PCR a 50 ° C per 2 min, 95 ° C per 10 minuti, e 40 cicli di 95 ° C per 15 sec e 60 ° C per 1 min. Consultare documento di supporto del produttore per il funzionamento della macchina qPCR.
  5. Calcolare una curva standard utilizzando i dati della serie di diluizioni standard triplicato. Confrontare i dati di amplificazione del campione cDNA alla curva standard per determinare il numero di copie. Consultare documento di supporto del produttore per daelaborazione ta.

5.4) Determinare Viral crescita esponenziale di fase

  1. Tracciare cinetica di crescita virale con il giorno di campionamento lungo l'asse X e il numero di copie cDNA lungo l'asse Y e identificare la fase di crescita esponenziale virale, cioè., Quando cDNA virali copiare numeri aumento in una progressione esponenziale.
  2. Utilizzare lo strumento web GRC ( http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ ) per calcolare il tasso di crescita virale (g). In questa applicazione, l'utensile GRC accetta cDNA copia numeri da almeno due punti di tempo in ingresso, ed emette il tasso di crescita virale (g). Utilizzare solo i dati dei punti entro la fase di crescita esponenziale (vedi sopra punto 5.4.1) per ottenere tassi di crescita accurati. Per una descrizione dettagliata del modello matematico utilizzato nello strumento Web GRC, vedi 20.

6. La crescita della concorrenza Assay

  1. Seed 3 x 10 5 </ Sup> PBMCs PHA-stimolata (o 1 x 10 5 CEMx174 celle) in 500 ml di volume totale per bene in un piatto ben 48 a fondo piatto.
  2. Tenere piastra in 37 ° C in una atmosfera di CO 2 5% fino inoculazione.
  3. Per ogni virus, preparare 3 ml di inoculo contenente 6.000 UI.
  4. Trasferire 1,5 ml di ciascuna inoculo virale in una provetta sterile per creare l'inoculo dual infezione. Aggiungere 500 ml di inoculo duale (1.500 UI) di 3 x 10 5 cellule in una piastra a 48 pozzetti. Il volume di coltura, è di 1 ml / pozzetto. Aliquota 200 ml di inoculo a due piastre da 96 pozzetti per l'isolamento dell'RNA; salvare una piastra come back up.
  5. Incubare le cellule inoculate a 37 ° C con una atmosfera di CO 2 5% per 16-24 ore.
  6. Culture Lavare 16-24 ore dopo l'inoculazione.
    1. Rimuovere e gettare 750 ml di cultura surnatante.
    2. Aggiungere 750 ml di cIMDM fresco. Avvolgere piastre in pellicola e girare in plastica per 10 min a 300 x g. Rimuovere e smaltire 75081; l surnatante.
    3. Aggiungere 750 ml di cIMDM fresco. Incubare a 37 ° C con una atmosfera di CO 2 5% (giorno 1).
  7. Selezionare i tempi di campionamento di includere almeno 3 punti di tempo all'interno della fase di crescita esponenziale osservata nel passaggio 5.4.1.
    1. Per ogni campione, seguire passo 5.1.7.
  8. Eseguire cDNA sintesi come descritto nel paragrafo 5.2.
  9. Determinare il rapporto variante virale con qPCR.
    1. Preparare una serie di diluizioni seriale standard in triplice copia, diluendo 10 volte in ogni passaggio da 3 x 10 6 copie / ml a 30 copie / ml di pNL4-3VifA.
    2. Impostare una piastra di reazione qPCR 96 pozzetti. Assicurarsi che ciascuna piastra contiene almeno un controllo negativo, la serie di diluizioni standard in triplice copia, e duplicati di ogni campione di cDNA.
    3. Per ogni reazione qPCR, utilizzare 12,5 ml di qPCR Master Mix, sonda 0,2 micron, 0,8 mM ciascuno dei forward e reverse primer e 1 ml di cDNA o d norma serie ilution o acqua / tampone (per i pozzetti di controllo negativo). Aggiungere acqua fino ad un volume finale di 25 microlitri. La sonda qPCR è sensibile alla luce, tenerlo in un contenitore chiuso.
      1. Utilizzare il primer sonda VIFA per rilevare i segnali nei controlli negativi e la serie di diluizioni standard e con uno duplicato del campione di cDNA. Utilizzare il primer sonda VifB con l'altro duplicato del campione di cDNA.
    4. Impostare parametri ciclismo PCR a 50 ° C per 2 min, quindi 95 ° C per 10 minuti, e poi 40 cicli di 95 ° C per 15 sec e 60 ° C per 1 min. Consultare documento di supporto del produttore per il funzionamento della macchina qPCR.
    5. Calcolare la curva standard utilizzando i dati di amplificazione della serie di diluizioni standard. Confrontare i dati di amplificazione dei campioni di cDNA con la curva standard per determinare il numero di copie. Consultare documento di supporto del produttore per l'elaborazione dei dati.
    6. Utilizzare lo strumento web GRC (ol.washington.edu/grc/">http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/) per calcolare fitness virale relativa (d).
      NOTA: Lo strumento GRC accetta cDNA copiare i numeri o le altezze dei picchi cromatogramma da almeno due punti di tempo come ingresso, ed emette la differenza tasso di crescita netto (d) tra i due virus. Mentre lo strumento in grado di calcolare il tasso di crescita netto da due dati di punti temporali, si consiglia vivamente di dati di input da tre o più punti di tempo. Utilizzare solo i dati ottenuti da punti di tempo all'interno della fase di crescita esponenziale (vedi punto 5.4) per ottenere tassi di crescita accurati. Per una descrizione dettagliata del modello matematico utilizzato nello strumento Web GRC, vedi 20.
  10. Determinare i rapporti virali usando cromatogramma picchi-heights
    1. PCR amplificare HIV-1 vif frammenti contenenti il tag sequenza VifAB utilizzando VifFwd (5'-GAAAGAGACTGGCATTTGGGTCAGGG-3 '; HXB2 posiziona 5266-5291) e VifRev primer (5'-GTCTTCT GGGGCTTGTTCCATCTGTCC-3 '; Posizioni HXB2 5579-5553).
      1. Per ogni reazione di PCR, utilizzare 1 ml di cDNA, 1x NH 4 tampone, 1,5 mM MgCl 2, 0.2 mM dNTP, 2.5 U di Taq polimerasi, e 0,45 micron di ogni primer. Aggiungere acqua fino ad un volume finale di 50 microlitri.
      2. Impostare parametri ciclismo PCR a 3 cicli a 94 ° C per 1 min, 55 ° C per 1 minuto, e 70 ° C per 1 min, seguiti da 34 cicli a 94 ° C per 15 sec, 58 ° C per 30 sec, e 70 ° C per 1 minuto, e quindi tenere a 4 ° C.
    2. Purificare prodotti PCR utilizzando il kit di purificazione QIAquick PCR secondo il protocollo del produttore.
    3. Invia prodotti purificati PCR per un sequenziamento del DNA fornitore di servizi per sequenziamento Sanger.
    4. Controllare il punteggio medio qualità di lettura, che dovrebbe essere fornito dal servizio di sequenziamento. Se la precisione media delle chiamate di base è inferiore al 85%, ripetere passo 6.10.1 a 6.10.3
    5. Utilizzare lo strumento web ChromatQuan (f="http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi">http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi ) per calcolare il rapporto virale in ogni punto. Lo strumento richiede il file di traccia di sequenza (* .ab1) e la sequenza 5 'al sito nucleotide di interesse. Lo strumento misura l'intensità di picco al sito specificato. Il rapporto tra l'intensità di picco corrispondente al rapporto delle due virus (Figura 4B).
    6. Utilizzare lo strumento GRC web ( http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ ) e l'intensità dei picchi registrati come ingresso per il calcolo idoneità relativa virale (d). Vedere il passaggio 6.10.6. 20

Risultati

Per studiare l'impatto idoneità dei cambiamenti di aminoacidi singoli in HIV-1 Gag-p24, abbiamo usato oligonucleotide mutagenesi diretta a introdurre mutazioni in un plasmide pNL4-3 contenente il virus HIV-1 COTB-p24 gene 23,32,33. Scorte virali sono stati generati da trasfezione di cellule 293T e raccolte dopo 48 ore. Abbiamo stimato la dose del 50% coltura tissutale infettiva (TCID 50) di ciascun titolo virale con il metodo Reed-Muench 31. Il TCID50 del prototipo e virus mutanti variavano da 10 aprile - 10 MAGGIO UI / ml (Figura 3A).

La cinetica di crescita del virus ricombinanti sono stati stabiliti in PBMC da un singolo donatore ad una MOI di 0,005. RT-qPCR è stato utilizzato per misurare il numero di copie virali cDNA al giorno per sei giorni. Tutti i virus mutanti e prototipi crescevano esponenzialmente tra il giorno 2 e il giorno 4, a seguito della quale la crescita virale rallentato, come indicato da una diminuita pendenza della crescita virale numero di copie di RNA ( Figura 3B). La diminuzione cDNA numero di copie tra giorno 0 (corrispondente al inoculo) e il giorno 2 è dovuta all'assorbimento di virus di cellule e la rimozione di virioni non legati dal giorno 1 di lavaggio (passo 5.1.6). Nella fase di crescita esponenziale, tutti tre mutanti avevano un tasso di crescita più lenta (g) che il virus prototipo (Figura 3C).

Tutti e tre i mutanti sono stati gareggiato contro il virus prototipo nei test concorrenza crescita a un totale di 0.005 MOI. Cinetica di crescita virale in culture doppiamente infette erano simili a quelle di monoinfezione; la fase di crescita esponenziale virale era tra i giorni 2 e 4, e la crescita virale ha raggiunto un plateau intorno al giorno 5 (Figura 4A).

Le differenze di crescita virale sono stati derivati ​​dalla variazione del rapporto virale nel tempo. Il rapporto virale è stato calcolato sulla base di cDNA numero di copie di riferimento e dei virus mutanti mediante RT-qPCR, e confrontando altezzein sequenza cromatogrammi in siti nucleotide distinguendo i due virus (Figura 4B). Le differenze di tasso di crescita determinati utilizzando la copia di RNA virale metodi numerici picco di altezza e hanno dato risultati simili (Figura 4C). Tutti e tre i mutanti avevano idoneità replica inferiore rispetto ai virus prototipo con il I256V mutante avere l'idoneità più basso (Figura 4C).

figure-results-1
Figura 1: Diagramma di flusso dei protocolli presentati in questo documento il virus protocolli Preparazione preoccupazione costruzione di HIV-1 cloni ricombinanti e la generazione di titoli virali.. I protocolli Assays fitness sono per stabilire cinetica di crescita virale e la determinazione fitness virale relativa. Le linee tratteggiate rappresentano flussi alternativi per i protocolli. Ad esempio, una mutazione può essere introdotto direttamente nella HIV-1 NL4-3clone molecolare senza generare un clone ricombinante.

figure-results-2
Figura 2:. Costruzione di HIV-1 NL4-3 COTB Gag-p24 cloni molecolari ricombinanti con estensione sovrapposizione PCR (A) Progettare i primer chimerici. Il 5 'metà dei primer contengono la sequenza vettoriale NL4-3 e il 3' metà contengono le estremità della sequenza dell'inserto. (B) primer chimerici sono usati per amplificare il frammento dell'inserto, COTB Gag-p24. (C) I frammenti inserti sono utilizzati come primers per una seconda PCR per generare un nuovo plasmide ricombinante.

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Figura 3:. Caratteristiche di crescita virale in PBMC (A) Accedi 10 TCID 50 delle scorte virali. (B) cinetica di crescita virale in monoinfections iniziato con un MOI = 0,005. (C) i tassi di crescita virale in sei giorni, compreso la fase esponenziale di crescita (2-4 giorni) derivato da pannello (B). I valori riportati rappresentano la media di tre repliche da un esperimento. Le barre di errore rappresentano 95% intervalli di confidenza.

figure-results-4
Figura 4: crescita virale e relativa idoneità determinazioni (A) la crescita virale in colture PBMC doppiamente infette.. (B) Rapporti di T242N e prototipo virus determinati con RT-qPCR o il metodo di sequenziamento picco altezza. (C) differenze nette virali tasso di crescita (d) tra il mutante ei virus prototipo in culture doppiamente infette, come illustrato in (A). d valori sono stati calcolati fROM i dati riportati in rapporto virale (B). I valori riportati rappresentano la media di tre repliche da un esperimento. Le barre di errore rappresentano 95% intervalli di confidenza.

Discussione

I protocolli presentati consisteva di due parti principali: costruzione di ricombinanti HIV-1 cloni molecolari e saggi di competizione crescita. Per distinguere due virus in coltura cellulare infettata doppiamente, è importante che i cloni molecolari concorrenti contengono tag di sequenza, che può essere rilevata da un RT-qPCR assay primer sonda o da Sanger sequenziamento. Questo protocollo fa uso di tag VIFA e VifB, che occupano la stessa regione del virus HIV-1 NL4-3 vif e codificano la stessa sequenza aminoacidica ma differiscono da sei mutazioni sinonimi. Queste mutazioni non hanno mostrato di influenzare virale replica fisica 20. Il metodo di clonazione PCR-based utilizzati in questo protocollo offre una maggiore flessibilità nella selezione dei siti clonazione, rispetto alla clonazione basata sito di restrizione. Tuttavia, l'efficienza di clonazione PCR diminuisce all'aumentare della dimensione dell'inserto aumenta. Il limite di corrente della dimensione inserto è ~ 5 kb 34. Per clonazione PCR-based e sito diretto mutagenesis, l'uso di una DNA polimerasi ad alta fedeltà è fondamentale per ridurre la probabilità di mutazioni supplementari. È anche raccomandato l'uso di un numero minimo di cicli di PCR necessari a produrre adeguate quantità di prodotti. Nella nostra esperienza, non abbiamo rilevato alcun mutazioni in più dopo la clonazione e sito-passi mutagenesi basate sulla PCR qui descritti. Tuttavia i prodotti di PCR devono essere sequenziati per verificare eventuali mutazioni indesiderate. Idealmente, l'intera regione codificante HIV dovrebbe essere resequenced.

Almeno tre punti di tempo di campionamento dovrebbero essere esaminate entro la fase di crescita esponenziale 9. La cinetica di crescita virale devono prima essere stabilite mediante campionamento giornaliero di determinare il periodo della cultura e tempo di campionamento punti appropriati per il concorso di crescita. Un fattore che influenza la cinetica di crescita virale è la molteplicità di infezione (MOI). Questo protocollo utilizza un MOI totale di 0,005 per entrambi monoinfezione e la concorrenza la crescita, come è stato dimostrato per produrre più rorisultati busto di basso MOI 9. Tuttavia, MOI inferiore possono essere utilizzati per ottenere una fase di crescita esponenziale più se necessario, ma a scapito della consistenza risultato. Questo protocollo suggerisce un rapporto infezione iniziale di 50:50, supponendo che le differenze di idoneità dei virus sono generalmente sconosciuti anticipo. Tuttavia, l'uso di tali rapporti ineguali sono appropriati quando ci sono dati preliminari suggeriscono differenze significative nella cinetica di replicazione virale. In questi casi, un rapporto di infezione di 70:30 è raccomandato per consentire il rilevamento di una grande differenza di fitness dove il virus meno allenati è posto in eccesso 9.

Il protocollo per la determinazione della TCID 50, cinetica di crescita virale, e per l'esecuzione di saggi di crescita della concorrenza sono stati ottimizzati utilizzando HIV-1 sottotipo B, NL4-3 COTB-p24 e PBMC da un singolo donatore il cui sangue periferico hanno dimostrato sensibilità coerente per HIV 1 infezione in vitro. Il periodo di colturae punti di tempo di campionamento presentate in questo protocollo sono suscettibili di essere adatto per studiare HIV-1 gruppo M virus in PBMC umani. Utilizzando PBMC da una singola fonte è altamente raccomandato per ottenere risultati coerenti come la replicazione virale può variare in diverse cellule del donatore 35. Sebbene meno desiderabile, PBMC raccolti da donatori multipli possono essere utilizzati come una sostituzione a condizione che la stessa piscina è utilizzata in tutti gli esperimenti. Un'altra alternativa è l'uso di linee cellulari. Il protocollo presentato qui è stato utilizzato con successo con la linea di cellule T CEMx174 23,36. Tuttavia, è importante che il numero di cellule seminate sono ri-ottimizzati per raggiungere la crescita delle cellule coerente. Cinetica di crescita virale devono essere ripristinati, in quanto può variare in diverse linee cellulari, per determinare i punti di tempo appropriati campionamento nei passaggi concorrenza crescita.

Due metodi differenti per determinare il rapporto virale per calcolare fitness sono inclusi nel ProtoColo. Il primo utilizza RT-qPCR per misurare virale numero di copie di cDNA in ogni punto di campionamento. Viral idoneità replica stata quindi calcolata dal rapporto virale, basata sul numero di copia cDNA. In alternativa, il rapporto virale può essere determinato in base al rapporto tra l'altezza di picco cromatogramma nei siti tag VifAB. I due metodi hanno fornito risultati comparabili (Figura 4). Il metodo altezza del picco cromatogramma può essere applicato ad altri ceppi HIV-1 senza un tag sequenza ingegnerizzato. Per RT-qPCR, l'uso di primer o sonde per distinguere varianti virali deve prima essere attentamente valutato (vedi 20). Tuttavia, RT-qPCR conferendo una maggiore sensibilità per campioni con una piccola quantità di RNA virale, come quelli del primo punto temporale all'interno della fase di crescita esponenziale. La misura diretta della cDNA virale permette anche la rilevazione di problemi tecnici che possono sorgere dalle operazioni di estrazione di RNA e sintesi del DNA. Utilizzo di cloni molecolari con sequence tags fornisce una soluzione conveniente to metodi RT-qPCR, come sono necessari solo due coppie di primer e sonde per studiare più virus. Questa strategia evita anche il problema della variazione di picco altezza in sequenza cromatogrammi causa di basi adiacenti 37, come sequenziamento viene eseguito nello stesso sito attraverso tutti i virus in studio. I prodotti di PCR prodotti per RT-qPCR e sequenziamento Sanger può anche essere utilizzato con altri metodi per determinare il rapporto virale, come massa sequenziamento del singolo clone 12,13, HTA 4,7,17,19 o saggio oligonucleotide legatura (OLA) 38 .

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione. Le opinioni qui espresse sono quelle degli autori e non devono essere interpretati come ufficiale o che rappresentano il punto di vista del Dipartimento della Difesa statunitense e il Dipartimento dell'Esercito.

Ringraziamenti

Questi studi sono stati finanziati dalle sovvenzioni dei servizi sanitari pubblici statunitensi P01AI057005, R01AI047734, R01AI111806 e dal Functional Profiling and Computational Biology Core del Center for AIDS Research (P30 AI027757) dell'Università di Washington.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Costruzione di cloni ricombinanti Primer
chimerico/mutageno/Sequenziamento PrimerIDTOligo DNA personalizzati
pNL4-3VifA e pNL4-3VifB PlasmideSi prega di contattare il Dr. James I Mullins (jmullins@uw.edu)DNA
polimerasi ad alta fedeltàThermo ScientificF-549S Tampone
ad alta fedeltàThermo ScientificF-549S
dNTPBiolineBio-39026
TermociclatoreLife TechnologiesBiosistemi applicati® GeneAmp® Sistema PCR 9700
Colorante di caricamento del DNAThermo ScientificR0631
1 kb Plus Scala di DNAInvitrogen10787-018
Kit di purificazione QIAquick PCRQiagen28104
Kit di estrazione del gel QIAquickQiagen28704
DpnI enzimaNew England BiolabsR0176S
TOP10 chimicamente competente Escherichia coliInvitrogenC4040-10
Luria Brodo base in polvereInvitrogen12795-084
CarbenicillinResearch Products InternationalC46000-25.0
QIAprep Spin Miniprep kit Qiagen27104
Maxi Kit di plasmidi EndoFreeQiagen12362
Trasfezione
X-tremeGENE 9 Reagente di trasfezione DNARoche6365787001
HEK 293T-17ATCCCRL-11268http://www.atcc.org/
0.22 μ m tubo orizzontale filtranteVWR International89220-716 
Coltura
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Life Technologies10566016
Iscove′ s Dulbecco modificato′ s Medium (IMDM)Life Technologies31980-030
RPMI-1640 mediaLife Technologies61870-036
Fitoemoagglutinina (PHA)Thermo ScientificR30852801
Interleuchina umana-2Roche11147528001
Siero fetale bovinoJR Scientific43640
Penicillina e streptomicinaCorning Cellgro30-001-CI
Piastra a 6 pozzettiVWR Scientific73520-906
Piastra a 48 pozzettiVWR Scientific62407-338
Piastra a fondo piatto a 96 pozzettiISC BioexpressT-3015-4
Piastra a fondo tondo a 96 pozzettiBD Falcon353077
Tubo per microcentrifuga da 1,5 mlMt. Baker BioMBD-1500
Provette da 1,5 ml con O-ringVWR Scientific89004-290
Provetta conica da 50 mlISC BioexpressC-3317-6
ELISA
Triton-X 100Sigma-AldrichX100
Soluzione salina tampone fosfato (PBS)Invitrogen14190-250
Siero fetale bovino (FBS)Sigma-AldrichF0392
gliceroloSigma-AldrichG5516
Tween 20Sigma-AldrichP1379
Albumina sierica bovina (BSA)Sigma-AldrichA2153
Coniglio anti-HIV-1 SF2 p24 antisieroNIH AIDS Reagent Program4250
Capra anti-coniglio HRPKPL474-1516
TMB Microwell Perossidasi SubstratoKPL52-00-01
H2SO4Fisher ScientificA300-500Provoca gravi ustioni da tutte le vie di esposizione. Utilizzare dispositivi di protezione individuale. Utilizzare solo sotto una cappa chimica. Risciacquare immediatamente con abbondante acqua per almeno 15 minuti.
Programma standard HIV p24per l'AIDS e il virus del cancro (NCI-Frederick)Per i dettagli dell'ordine, contattare Julian Bess, Jr. (bessjw@mail.nih.gov); http://ncifrederick.cancer.gov/Programs/Science/Acvp/bio/Bess.aspx
Lettore di micropiastreMolecular DevicesVMax Kinetic ELISA Lettore di micropiastre
Isolamento dell'RNA Sintesi
QIAxtractorQiagenhttp://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/sample-prep/qiaxtractor
Mini kit di RNA virale QIAampQiagen52906
dNTPBiolineBio-39026
SuperscriptIIIInvitrogen18080-085
Tampone del primo filamento Invitrogen18080-085
Ditiotreitolo (DTT)Invitrogen18080-085
Inibitore della RNASIRoche3335402001
RnaseHInvitrogen18021-071
qPCR
Macchina qPCR in tempo realeLife TechnologiesApplied Biosystems 7300 Real-Time PCR 
TaqMan® Gene Expression Master MixLife Technologies4369016
Primer diretto e inversoIDTOrdine personalizzato
ProbeLife TechnologiesOrdine personalizzato
Piastra di reazione ottica a 96 pozzettiLife TechnologiesI19N3Q216
PCR+sequenziamento
Taq DNA polimerasi (Biolasi)BiolineBio-21043
tampone NH4 BiolineBio-21043
MgCl2BiolineBio-21043
Primer per sequenziamentoIDTOrdine personalizzato
QIAxcelQiagenhttp://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/detection-and-analysis/qiaxcel-advanced-system
Fornitore di servizi di sequenziamento del DNAhttp://www.htseq.org/
Strumento web GRChttp://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/
Strumento web ChromatQuanhttp://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi
cellularedel cDNA

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