Abstract
Experimentele diermodellen van een beroerte zijn van onschatbare waarde tools voor het begrijpen van een beroerte pathologie en het ontwikkelen van meer effectieve behandeling strategieën. Een 2 week protocol voor repetitieve hypoxische preconditionering (RHP) induceert langdurige bescherming tegen het centrale zenuwstelsel (CNS) letsel in een muismodel van focale ischemische beroerte. RHP bestaat uit 9 stochastische blootstelling aan hypoxie die variëren in zowel duur (2 of 4 uur) en de intensiteit (8% en 11% O2). RHP vermindert infarct volumes bloed-hersen barrière (BBB) verstoring, en de post-stroke ontstekingsreactie weken na de laatste blootstelling aan hypoxie suggereert een langdurige inductie van een endogene CNS-beschermende fenotype. De methode voor de dubbele kwantificering van infarct volume BBB verstoring is doeltreffend worden geëvalueerd neurovasculaire bescherming bij muizen met RHP of andere putatieve neuroprotectieve. Volwassen mannelijke Swiss Webster muizen werden geconditioneerd door RHP of duur equivalent blootstelling aan 21% O
Introduction
Aangezien de voornaamste oorzaak van volwassen gehandicapten en de vierde doodsoorzaak, beroerte is één van de meest slopende ziekten tegenover de volwassen bevolking van de Verenigde Staten. 1 Diermodellen van een beroerte zorgen voor experimenteel onderzoek van nieuwe methoden ter vermindering van ischemische schade en het verbeteren van post-stroke herstel. Een roman avenue voor dergelijke translationeel onderzoek is preconditionering. Voorbehandeling het opzettelijk gebruik van een niet schadelijk stimulus om de schade op een volgende, en ernstiger letsel. 2 hypoxische preconditionering is aangetoond pleiotrope veranderingen in de hersenen die bescherming bieden tegen beroerte in zowel in vivo als in vitro studies produceren . 3 echter eenmalige blootstelling aan hypoxia biedt slechts kortdurende neuroprotectie, induceren minder dan 72 uur van tolerantie tegen ischemie bij volwassen muizen. 4 zelfs na vier weken van 14 uur dagelijkse blootstelling aan hypoxie hypobaric, Lin et al. found dat neuroprotectie werd volgehouden slechts één week. 5 Repetitive hypoxische preconditionering (RHP) wordt gekenmerkt door stochastische variaties in frequentie, duur en intensiteit van hypoxische blootstelling. In tegenstelling tot een voorbehandeling uitdaging RHP induceert een cerebroprotective fenotype die blijft tot acht weken bij muizen. 6 RHP verminderd infarct volumes bloed-hersen barrière (BBB) verstoring, vasculaire inflammatie, en leukocyt diapedesis weken na de laatste hypoxische blootstelling . RHP bijzonder verminderde ontsteking in de ischemische hersenen door verlaging van T-cel, monocyt en macrofaag populaties, met behoud van B-celpopulaties in de ischemische hemisfeer. 7 In feite, RHP induceerde een immunosuppressief fenotype bij muizen vóór elke CNS letsel, waaronder beroerte. RHP-behandelde B-cellen geïsoleerd uit RHP behandelde gezonde muizen vertoonden een unieke anti-inflammatoir fenotype, met een neerwaartse regulatie van zowel antigeenpresentatie en antilichaamproductie. Dealgehele vermindering van pro-inflammatoire antigeen-specifieke afweermechanismen maakt RHP een uitstekende methode om endogene immunosuppressie te induceren niet alleen CNS-specifieke ontstekingsziekten, maar ook systemische verwondingen of ziekte modellen met een pro-inflammatoire pathologie omvatten.
RHP vermindert zowel infarct volume en BBB verstoring na een voorbijgaande midden cerebrale slagader occlusie (tMCAo). Diermodellen van beroerte, zoals de algemeen gebruikte tMCAo, drastisch verbeteren van het begrip van de pathofysiologie van beroerte, alsook het ontwerpen van effectievere Neurotherapeutics. Eerst ontwikkeld door Koizumi et al., In 1986, 8 de tMCAo procedure is een veel gebruikte werkwijze voor het induceren van een beroerte bij knaagdieren en één van de voorkeurswerkwijzen voor het onderzoeken van ontsteking na reperfusie. Als werkwijzen voor tMCAo evolueren, de meer recente gebruik van met silicone beklede filamenten verder het risico van subarachnoïdale bloeding te verminderen in vergelijking met andere modellen 9,10 </ Sup> en het verbeteren van de betrouwbaarheid, maar helaas tMCAo levert vaak een grote variatie in infarct volumes. 11-13 De meeste van deze studies af te bakenen infarct gebieden in coronale hersenen secties door kleuring met 2,3,5- trifenyltetrazoliumchloride (TTC), beschouwd als een gouden standaard voor kwantificatie infarct omdat het een eenvoudige en goedkope manier om levendige, reproduceerbare resultaten. TTC dient als een substraat van dehydrogenasen aanwezig in mitochondria. Wanneer hersenplakjes worden blootgesteld aan het TTC-oplossing wordt TTC selectief in levende cellen genomen als de niet-oplosbare reductieproduct, formazan, precipiteert een dieprode kleur in levensvatbare mitochondria. Omwille van mitochondriale dysfunctie in de ischemisch weefsel, dit weefsel blijft wit, waardoor voor differentiatie van beschadigde en gezond weefsel. 14
RHP vermindert ook BBB verstoring in de ischemische hemisfeer. 6 Daarom is de dubbele kwantificering van BBB integriteit binnen dezelfde Bregens als TTC-gebaseerde infarct volumebepalingen 15 nuttige informatie opleveren over de volledige werking van endogene bescherming en mogelijke causale verbanden tussen BBB verstoring en infarct bij onbehandelde en behandelde dieren te verschaffen. De instroom van perifeer bloed door een verstoorde BBB, secundaire beroerte, neemt leukocyt populaties, pro-inflammatoire cytokines, oxidatieve stress, vasogeen oedeem, en hemorragische transformatie in de ischemische hemisfeer uiteindelijk uitgebreid aantal besmettingen en mortaliteit bij patiënten met ischemische beroerte . 16,17 Een gebruikelijke meetmethode BBB verstoring in diermodellen met kwantificering van Evans blue (EB) kleurstof lekken in de hersenen. 15,18-21 EB selectief bindt aan albumine, een globulair eiwit serum (MW = 65 kDa) dat maakt de BBB niet oversteken ongedeerd dieren. 22 Naar aanleiding van ischemische beroerte, EB infiltreert de hersenen, en fluoresceert bij 620 nm, waardoor voor het meten van de optische dichtheid within geperfundeerde gewonden parenchym. 22 De extinctie is recht evenredig met de permeabiliteit van de BBB bij EB van transcardiale perfusie verricht van de post-mortem corticale vasculatuur gewassen. Met de onmiddellijke verwerking van TTC-gekleurd hersenen bij dieren met EB toediening kan zowel het infarct volume en BBB verstoring effectief worden gekwantificeerd. Opgemerkt zij echter dat neuronaal letsel en BBB verstoring niet gelijktijdige processen in de hersenen na een beroerte, 23,24 zodat de selectie van de tijd van offeren is een belangrijke overweging.
Het protocol dat volgt geeft de RHP werkwijze de tMCAo werkwijze voor het induceren van een tijdelijke arteriële occlusie die modellen middelste cerebrale arterie occlusie bij menselijke patiënten, en de dubbele histologische methoden om neurale en vasculaire beroerte letsel eindpunten. TTC meet celdood en cumulatief weefselschade, waardoor de kwantificering van de totale infarct volume, terwijl EB voorziet in de hemisferische kwantificering van BBB schade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NB: Dit protocol werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) op UT Southwestern Medical Center, dat zich aan de National Institutes for Health (NIH) beleid voor experimentele gebruik van dieren.
1. Repetitieve Hypoxische Voorconditionering
- Aangepast ontwerp vier flowmeters gas toezichthouders en hechten aan de standaard 15 L inductie kamers met PVC buizen samengeperst gas toestaan van de zuurstof (O 2) tanks te stromen in de kamers via een inlaatpoort. Zie apparatuur en materialen voor meer informatie over het aangepaste ontwerp.
- Verdeel muizen in 2 groepen: Repetitive Hypoxische Voorconditionering (RHP) Group, die de vorderingen van ontvangen tot 8% en 11% O 2, en de controle groep, die de vorderingen ontvangt tot 21% O 2 (ruimte lucht) gelijktijdig. Zie tabel 1 voor de variaties in frequentie, intensiteit (8 en 11% O 2 of 21% O 2) en duur (2 of 4 uur) van RHP posities. </ Li>
- Verwijder de bovenste filterdeksel per kooi en plaats de kooi met voedsel en water flessen intact, in de kamers verbonden met hun respectievelijke O 2 tanks. Sluit en zet het deksel van de kamer.
- Open de hoofdgasklep voor tanks en stel de voorloop per inductiekamer tot 2 liter per minuut (LPM) voor de eerste 5 minuten van blootstelling. Verminder het debiet tot 1 LPM voor de rest van de blootstelling.
- Aan het einde van de belichting, vermindering van de stroming aan 0 LPM en sluit de gasklep van de tanks.
- Open de kamer deksels en vervang het filter deksel op elke kooi. Plaats de kooien in de standaard woningbouw tot de volgende hypoxische blootstelling.
- Spray omlaag elke inductie kamer met NPD (Steris) of een gelijkwaardige desinfecterend middel / deodorant na elk gebruik.
- Expose zowel 21% en RHP muizen op hetzelfde tijdstip in de loop van twee weken zoals beschreven in tabel 1.
2. TransientMidden cerebrale slagader occlusie (tMCAo)
- Zie discussie voor meer informatie over de timing van een beroerte na de definitieve RHP blootstelling.
- Bereid een aseptische operatie werkplek. Schone omgeving werkplek met 70% ethanol of een gelijkwaardige ontsmettingsmiddel en autoclaaf alle chirurgische instrumenten.
- Stel de Laser Doppler Flowmetry (LDF) instrument om de relatieve veranderingen in de cerebrale doorbloeding (CBF) te meten. Zet het verwarmingselement tot 37 ° C. Zet de incubator tot 34 ° C.
- Verdoven muizen met een korte blootstelling aan een mix van 4% isofluraan / 70% NO 2/30% O 2 in een klein inductie kamer. Bevestig de juiste verdoving door licht te knijpen de poot. Als de muis trekt zijn poot, de terugkeer van de muis om de inductie kamer en isofluraan blootstelling blijven.
- Verwijder muizen uit de narcose inductie kamer en steek snel de neus van de muis in de neuskegel. Open de gasstroom naar de neuskegel afsluiten van stroom naar de anesThesia inductie kamer.
- Zonder de 70% NO 30/02% O 2 gasmengsel, vast isofluraan 1,8% als onderhoudsdosering voor de rest van de procedure. Ademhaling moet langzaam en regelmatig gedurende de procedure blijven, maar als de ademhaling wordt snel en oppervlakkig, verhoging van de dosis isofluraan. Maintenance dosis kunnen inhouden tussen productie en dierlijke gebruikt in het experiment.
- Met een microshaver, scheren haren op de temporale gebied tussen de hoek van het oog en oor en ventrale middenlijn van de nek. Verwijder overtollige bont en oculaire smeermiddel met een steriel wattenstaafje om de hoornvliezen niet uitdrogen tijdens de procedure. Veeg incisie met alcohol pads en swab providon-jood met een steriel wattenstaafje om aseptische omstandigheden te handhaven.
- Dien analgetica volgens knaagdieren chirurgische richtlijnen.
- Maak een incisie door de tijdelijke huid tussen het oog en het oor.Expose de temporalis spier. Met behulp van micro-chirurgische schaar, knip de temporale spier ligament in de temporale nok op het gebied van witte spier strepen.
- Duw de spiermassa zijdelings met een tang om de middelste cerebrale slagader (MCA) door de schedel te visualiseren. Na het insnijden van de temporale spier, kan de ruimte vullen met bloed. Gebruik voorzichtig een wattenstaafje om eventuele bloeden stelpen.
- Richt de de LDF sonde met de MCA gebied. Noteer het gekozen gebied varieert muizen vat.
- Houd de LDF op zijn plaats en gelijk met de schedel tot een stabiele rode bloedcel flux wordt gelezen en noteer deze waarde als de basislijn CBF. Ideaal basislijn CBF op een Laser Doppler Flowmetry zijn> 600 flux, maar dit zal variëren met de fabrikant. Als basislijn CBF <400 flux, de stroom opname hoogstwaarschijnlijk uit een nabijgelegen ader of een onvolledige plaatsing van de sonde in het doelvat.
- Nadat basislijn CBF is gevestigd, repositide muis, zodat de hals wordt blootgesteld. Ondersteunen haar hoofd en houdt de muis onder constante verdoving van de neuskegel.
- Maak een ventrale middellijn incisie van net onder de onderkaak naar het sleutelbeen.
- Met behulp van een tang stomp ontleden alle oppervlakkige fascia aan de linker gemeenschappelijke halsslagader (CCA) bloot te leggen. Scheid de CCA van bindweefsel en de nervus vagus.
- Permanent ligeren het CCA met een 6,0 zijden hechtdraad. Plaats de ligeren hechtdraad zo proximale mogelijk om genoeg ruimte voor het afsluiten van filament plaatsing mogelijk te maken.
- Loop en losjes bind een tweede zijde 6,0 hechtdraad rond de CCA distale aan de afsluitende hechtdraad. Wees voorzichtig de slagader niet om af te sluiten als de afsluitende filament vervolgens zullen worden geregen door de halsslagader.
- Gebruik een 8 x 2 mm licht micro serrafine areterial klem om de CCA distale klem om de losjes gebonden zijden hechtdraad. Til het CCA met een tang en een kleine longitudinale incisie, als proximale naar het afbinden hechtdraad alskan met 3 mm Vannas.
- Rijg een 12 mm-silicium gecoate 6.0 gauge nylon afsluitende filament door de incisie aan de slagader lumen in te voeren, en vooraf het een paar mm dan. Losjes draai de tweede losse zijden hechtdraad rond de tip van de afsluitende gloeidraad om ervoor te zorgen bloedstroom niet duw de gloeidraad uit de CCA en verwijder de arteriële klem.
- Bij de eerste splitsing van de CCA in de interne halsslagader (ICA) en de externe halsslagader (ECA), draai de afsluitende gloeidraad in de juiste tak van de eerste splitsing naar de ICA.Advance voer de afsluitende gloeidraad 9-10,5 mm verleden de tweede zijden hechtdraad in de linker interne halsslagader (ICA).
- Kort na het invoeren van de ICA, vooraf de afsluitende gloeidraad in de linker tak bij de tweede splitsing tussen de ICA en de pterogopalantine slagader (PPA). Visualisatie van de PPA is onwaarschijnlijk zo gaan totdat je voelt een lichte weerstand met volledige plaatsing van de afsluitende gloeidraad.Het opheffen van de ICA met een tang kan helpen de gloeidraad om gemakkelijker draad in de linker tak van de tweede birfurcation. Draai de tweede zijden hechtdraad.
- Draai de muis, zodat de incisie over de MCA zichtbaar is. Met de LDF apparatuur, bevestigen dat de CBF is geblokkeerd door de LDF metingen. Een succesvolle afsluiting is een reductie> 80% van de uitgangswaarde CBF.
- Volledig scherpen en dubbel-knoop de tweede zijden hechtdraad rond de afsluitende filament wanneer de juiste positie is bereikt. Indien nodig, licht duwen of trek de afsluitende gloeidraad CBF criteria voor een succesvolle afsluiting (bijvoorbeeld> 80% reductie ten opzichte van baseline CBF) te bereiken.
- Sluit de nek en hoofd opening met 6,0 nylon hechtingen.
- Plaats muizen in de 34 ° C incubator gedurende de duur van de occlusie. Aanbevolen lengte van occlusie 60 min, maar dit verschilt voor leeftijd, stamafhankelijke verschillen in cerebrovasculaire anatomie, 25 en de omvang van injury gewenst (mild, matig, ernstig). Zorg ervoor dat dieren weer bij bewustzijn binnen minuten van komende uit anesthesie.
- Opnieuw verdoven dieren met isofluraan, zoals beschreven in stap 2.3, 5 minuten vóór het einde van de vooraf bepaalde periode occlusie, opent de hoofdhuid incisie en bevestigen dat de MCA perfusie nog wordt verminderd door middel van transcraniële LDF metingen. Als CBF niet voldoende gereduceerd (bv <20% basislijn CBF), heeft de MCA reperfusie op enig moment tijdens de occlusie en de muis moeten verdere experimenten worden uitgesloten.
- Open de middellijn hals incisie en losjes bind derde zijden hechtdraad rond de CCA, distaal van de tweede zijden hechtdraad maar proximaal van de CCA bifurcatie zodat de uitwendige halsslagader (ECA) levensvatbaar blijft nadat het filament verwijderd.
- Snijd of ontkoppelen de knoop die de afsluitende gloeidraad (dwz tweede zijden hechtdraad) houdt en langzaam terug te trekken van de afsluitende gloeidraad. Eenmaal verwijderd, snel sluiten van dederde zijden hechtdraad rond de CCA om terugstroom van het bloed te minimaliseren van het ICA. Double-knoop deze hechtdraad en sluit de incisie met 6,0 nylon hechtingen.
- Verplaats de muis om het niveau van de CBF te kwantificeren na 5 min reperfusie. Succesvolle reperfusie wordt meestal verstaan een CBF van> 50% van de uitgangswaarde CBF, maar zoals bij afsluiting debiet, kunnen onderzoekers hun eigen criteria vast te stellen. Wanneer dieren vertonen een CBF dan 50% van de uitgangswaarde, is het waarschijnlijk MCA "vaste" ingesloten, en vormt dus een andere studie exclusiecriterium.
- Sluit beide insnijdingen met 6,0 nylon hechtingen. Zorg saline, verdoving (lidocaïne) en antibiotica volgens knaagdieren richtlijnen. Maar sommige kleine doses antibiotica (3 mg / kg van minocycline) gevonden neuroprotectieve volgende beroerte. 26
- Na het terugbrengen van het bewustzijn in het verwarmde couveuse na een operatie, plaats muizen in een schone, steriele kooi. Zorg voor vochtige food of voedingswaarde hydratatie dieet gel supplementen en een petrischaal van water als de dieren zal hebben beperkte mobiliteit na een beroerte. Nauwlettend dieren tijdens het herstel voor overmatige post-operatieve pijn en dood.
3. Evans Blue (EB) Injection
- Injecteer EB 22 uur na reperfusie en moet circuleren in de bloedstroom gedurende 2 uren voorafgaand aan offeren en TTC kleuring.
- Een oplossing voor injectie EB (EB 2% in zoutoplossing) en meng bij kamertemperatuur. Filter oplossing door filtreerpapier of duwen door een 0,2 um filter gekoppeld aan een kleine spuit om onopgelost EB te verwijderen en bewaar bij kamertemperatuur.
- Bereid de hoeveelheid EB nodig voor injectie (4 ml / kg lichaamsgewicht) Teken de gewenste hoeveelheid kleurstof in een 0,3 cc insuline spuit met een 29 gauge naald en waarborgen dat de oplossing op kamertemperatuur
- Restrain muis met behulp van platte bodem restrainer. Houd de staart, zodat de laterale ader is uppermost. Zijnerven bevinden zich aan weerszijden van de hartlijn van de staart. Houd het puntje van de staart aan de muis stabiel voor injectie houden.
- Steek de naald in de ader ongeveer 3,5 mm, zorg dat de ader niet te perforeren. Controleer of de naald in de ader door terugtrekken op de spuit en naar bloedsporen.
- Injecteer van de kleurstof in de loop van 1 min. Als de oplossing gaat in de ader dient er minimale weerstand als druk wordt uitgeoefend op de injectiespuit. Bevestig succesvolle systemische veneuze toediening van EB door een onmiddellijke kleurverandering in de staart, ledematen en ogen van de muis.
- Verwijder de naald uit de staart en voorzichtig druk uit te oefenen met behulp van schone gaasje om het bloeden te stoppen.
- Begin timing wanneer de huid van de muis wordt blauw. Laat de EB circuleren gedurende 2 uur om de verzwakte BBB dringen.
4. 2,3,5- trifenyltetrazoliumchloride (TTC) kleuring
- Nadat het poeder volledig is opgelost, onmiddellijk aan een flesje, afdekking in folie en bewaar bij 4 ° C. TTC en weefsel gekleurd met TTC zijn lichtgevoelig.
- Start de perfusie pomp bij 5 ml / min debiet een 60 cc injectiespuit gevuld met ijskoude 0,01 M PBS en verbonden met een 27 gauge naald gevleugelde infusie. Plaats de punt van de naald ongeveer 0,5 cm in de linker hartkamer en snijd het rechter atrium. Progressief verdund veneuze bloed moet uit het atrium stromen tijdens de perfusie tot veneuze bloed verschijnt kleurloos. Transcardially perfuseren 30 ml 0,01 M fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) door het hart.
- Verwijder de reukkwabben door het met een roestvrijstalen 0,21 mm dikke mesje in de tweede sleuf van de rostrale zijde van de matrix.
- Verwijder de kleine hersenen door het met een mes in de vierde sleuf van de caudale kant van de matrix.
- Plaats een lemmet in het midden van de groef overblijvende sleuven in de matrix. Plaats de overige bladen gelijkmatig tweeën deelt het restmateriaal aan de gelijkmatige verdeling van weefsel gedurende het snijden te waarborgen.
- Zodra alle bladen zijn aangebracht, voeg 1-2 druppels PBS om de hersenen te bevochtigen.
- Verwijder het mess een voor een uit de matrix met 'rostrale gebied. Houd de eerste 7 plakjes voor TTC analyse na tMCAo. Gebruik een spatel om de plakken goed te brengen van de tanden om de TTC-vial.
- Wanneer de secties aangebracht op de slede, scant de schuif met een standaard scanner. Stel de resolutie met een minimum van 600 dpi voor beeldanalyse. Zorg ervoor dat u de naam van het dier en een metrische heerser in het gescande beeld op te nemen.
- Flip over de diaen scan de achterkant alle gegevens verzameld waarborgen.
5. Infarct Volume Kwantificering
- Kwantificeren van het infarct volume met behulp van een standaard beeldanalyse software (bijvoorbeeld ImageJ).
- Scan beelden met een hoge resolutie (bv 600 dpi) voor een adequate analyse. Crop beelden. Standaardisering van de schaal voor alle beelden met de metrische heerser opgenomen in de gescande afbeelding.
- Bereken het totale volume van de contralaterale hemisfeer met de volgende formule. Herhaal deze formule om het totale volume van de ipsilaterale hemisfeer berekenen.
Som van de totale contralaterale hemisfeer van elk segment x plakdikte - Bereken de indirecte infarctvolume. . Controle voor ipsilaterale oedeem van een beroerte met behulp van de gezonde, contralaterale halfrond als een controle 27 Gebruik de volgende formule om de indirecte infarct volume te berekenen:
Totale volume van de contralaterale hemisfeer -
(Totaal volume van ipsilaterale hemisfeer -Gemiddelde volume van 3 metingen van infarct)
6. bloed-hersenbarrière (BBB) Integriteit kwantificering
- Ter voorbereiding van EB kwantificering, eerste weegt 2,5 inch wegen boten. Registreer het gewicht en label twee wegen boten voor elk dier: een voor de ipsilaterale hemisfeer en een voor de contralaterale hemisfeer.
- Na het scannen van de TTC-gekleurde coupes, halveren elke sectie met een wegwerp scheermesje in ipsilaterale en contralaterale halfrond. Plaats de ipsilaterale hemisfeer van alle 7 secties in een gewichtboot en registreer het gewicht. Herhaal dit voor contralaterale halfrond.
- Onmiddellijk overdracht van het gewicht boten naar een oven set voor 56 ° C gedurende 48 uur.
- Weeg de droge gedeelten. Transfer beide hersenhelften in afzonderlijke 1,5 ml microcentrifuge buizen.
- Bereken de hoeveelheid formamide nodig voor elke hersenhelft (8 ml / g droog weefsel), en aan hun respectievelijke microcentrifuge tubes. Formamide is lichtgevoelig en heeft betrekking op alle-formamide behandelde monsters in folie vanaf dit punt verder.
- Breng de microcentrifugebuizen een incubator ingesteld op 56 ° C gedurende nog 48 uur.
- Na de 48 uur, pipet uit de blauwe supernatant naar een andere set van gelabelde microcentrifugebuisjes. Duw weefsel naar de bodem van de buis om het volume geëxtraheerde supernatant maximaliseren. Houd de buizen van supernatant en gooi alle weefsel.
- Bereid exponentiële seriële verdunningen van EB in formamide voor de standaardcurve. Inclusief 1 leeg (formamide) en vervolgens 10 exponentiële oplossingen van 0,125 ug / ml tot 64 ug / ml van EB in formamide.
- Pipetteer 300 ul van de verdunningen van de standaardcurve in een 96-wells plaat. Pipetteer 300 ul van de supernatant in overeenkomstige wells.
- Meet de absorptie op een spectrofotometer bij 620 nm.
- Vergelijk de standaardcurve van de EB verdunningen met absorptie of de bovenstaande voorbeelden. De optische dichtheid rechtevenredig met de integriteit van de BBB.
- Stel dat de optische dichtheid van de contralaterale hemisfeer als achtergrond en worden de formules (ipsilaterale-contralaterale) / contralateraal veelvoudverandering bepalen. Voor meer informatie over statistische analyse zie Martin et al., 2010. 18
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze studie omvatte 25 mannelijke Swiss Webster muizen die 10 weken oud waren bij aanvang van randomisatie tot RHP (n = 10) of 21% O 2 (n = 15) groepen. Twee weken na de laatste RHP blootstelling werden chirurgische procedures uitgevoerd met groepen blind en vorkheftruck tussen dag. Na tMCAo, 1 muis stierf tijdens postoperatieve herstel en 1 muis werd uit het onderzoek uitgesloten omdat het niet voldeed aan de reperfusie CBF criterium. Beide uitgesloten muizen werden van de 21% O 2-groep. Overeenkomstig KOMEN richtlijnen 28 Tabel 2 toont chirurgische parameters. Indirect infarct volumes, hemisferische zwelling (dat wil zeggen oedeem) en Evans blauw (EB) extravasatie worden getoond in Figuur 2. Alle gegevens werden geanalyseerd met ongepaarde t-test (gemiddelde, standaarddeviatie getoond) en uitschieters gedetecteerd met een False Discovery Rate minder dan 1% (Graphpad Prism), waarvan 4 uitschieters verwijderd (2 van 21%, 2 van RHP) van de EB dataset.
3) in vergelijking met 21% O 2 behandelde muizen (62,6 ± 42,6 mm 3), maar dit verschil was niet significant (p = 0,10). Echter, een a priori vermogen analyse voorspelde een vereiste n = 10 per groep, die we niet bereiken met het RHP-behandelde muizen na outliers werden verwijderd. Dit moet worden overwogen bij het ontwerpen van toekomstige experimenten met RHP. Er was geen effect van RHP voor halfbolvormig zwelling, een metriek afgeleid van de TTC volume analyse kan worden gelijkgesteld met oedeem. 6 RHP-behandelde muizen vertoonden een trend (p = 0,05) bij de reductie van BBB storing in de ischemische hemisfeer genormaliseerd tot de contralaterale hemisfeer. Figuur 2D toont een bereik van waarden voor EB rook beide behandelingsgroepen.
Figuur 1:. Speciaal ontworpen RHP kamers bovenste paneel toont de custom-built flowmeters voor de individuele bewaking van de luchtstroom in maximaal vier kamers. Lucht impermeabele buis wordt getoond waarbij de debietmeter en dat aan de inlaatpoort van de 15 L inductie kamer in het onderste deel. Outlet poort blijft open tijdens RHP om voor luchtcirculatie.
Figuur 2:.. RHP vermindert infarct volumes en BBB verstoring RHP (A) vermindert infarct volumes met 46% vergeleken met controlemuizen, maar heeft (B) geen effect voor halfbolvormig zwelling afgeleid van de TTC data (C) In dezelfde dieren, RHP vermindert BBB verstoring (p = 0,05) zoals gedefinieerd bij Evans Blue lekken genormaliseerd met de contralaterale hemisfeer. (D) Representatieve TTC vlekken van zowel RHP-behandelde en 21% O 2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een enkele blootstelling aan systemische hypoxie (dat wil zeggen, 2 uur van 11% O 2) bij muizen "tijdelijk" beschermt de hersenen tegen tMCAo, 29 betekent dat de epigenetische antwoord op de hypoxische preconditionering uitdaging is de korte levensduur, en de basislijn fenotype wordt hersteld binnen dagen. Repetitieve presentaties van de hypoxische preconditionering stimulus dramatisch verlengen van de duur van de neuroprotectieve fenotype. 6 Vele studies hebben aangetoond dat de frequentie, omvang en duur van de repetitieve stimulustrein zijn bepalend voor deze reactie. Bijvoorbeeld, alleen het herhalen van dezelfde intensiteit en duur van hypoxie (2 h 11% zuurstof) 3 maal per week (MWF) gedurende 2 weken resulteerde het therapeutische venster van neurovasculaire bescherming tegen tMCAo, 6 niet uit, maar is voldoende lange induceren term ischemische tolerantie in het netvlies. 30 Interessant, hoewel 5 blootstelling aan systemische hypoxie (5 uur van 8% O 2 </ Sub>) op afstand 6 dagen na elkaar tegen tMCAo geïnduceerd 3 dagen na de laatste hypoxische blootstelling neuroprotectie is verloren als de 5 hypoxische blootstelling 3 dagen na elkaar zijn geplaatst. 31 De reden voor dit verschil is niet duidelijk, maar kan te wijten zijn aan de duur van de ernstige hypoxie ten opzichte van dit protocol en / of onvoldoende hersteltijd tussen hypoxie uitdagingen van deze ernst.
Kortom, titratie van het repetitieve hypoxische challenge over de domeinen van frequentie, omvang en duur, lijkt cruciaal voor de ontwikkeling van tolerantie, terwijl niet induceren schade, geen weefselspecifieke en misschien soortspecifieke gevoelen. Bijvoorbeeld, 3 van 9 van de RHP posities omvatten blootstelling aan 8% O 2 tot 4 uur, maar 6 h 8% O 2 induceert hippocampale neuronale dood. 32 Bijgevolg moet er een strikte naleving van het RHP protocol met betrekking tot duur en ernst van hypoxische blootstelling aan endogene inducerenbescherming. Ofschoon de effecten van circadiane ritme on-preconditionering geïnduceerde bescherming moet verder worden onderzocht, 33 presteren RHP posities op hetzelfde tijdstip voor een bepaalde cohort vermindert het risico van mogelijke verstorende effect. Wat de dosisrespons en werkzaamheid, de meest robuuste RHP-gemedieerde bescherming tegen focale beroerte wanneer aan de tMCAo werd geïnduceerd 2 weken na de laatste hypoxische blootstelling 3 op een moment dat RHP behandelde gezonde muizen vertonen een immunosuppressief fenotype (in het Aangezien ischemisch letsel). 7 deze 2 weken tijdspunt niet samenvallen met de periode van maximale bescherming tegen andere acute CNS letsels of in andere orgaansystemen. Zowel de RHP-protocol, en de tijdelijke kenmerken van de epigenetische respons, zal ongetwijfeld optimalisatie voor elke nieuwe translationeel gebruik nodig.
Eén van de grootste beperkingen van de tMCAo procedure is de ongelijkmatige verdeling van de infarct voLumes, zoals blijkt uit deze representatieve gegevens set. De collaterale circulatie door de cirkel van Willis, leptomeningiale anastomosen, en dorsale collaterale verbindingen kan leiden tot inconsistente infarct volumes. 34 Variaties tussen de Cirkel van Willis in verschillende muizenstammen, en de aanwezigheid en de openheid van posterior communiceren slagaders, 25 , 35 kan verder de samenhang van het infarct volumes te verminderen binnen groepen. Robuuste steekproefomvang en replicatie vaak noodzakelijk om afdoende resultaten en moet worden opgenomen in het ontwerp van de proef na het inschakelen daarvan. Andere werkwijzen beroerte inductie bijzonder distale focale ischemische werkwijzen zoals occlusie van de MCA primaire tak via een boorgat in de laterale schedel of photothrombosis distale takken van de MCA, vaak tot minder variatie in slagvolume. Fototrombotisch beroertes zijn echter beperkt aangezien daarbij gelijktijdig extracellulair en intracellulair oedeem, een Phenomenon niet gezien bij ischemische beroerte bij mensen. 36 Omgekeerd tMCAos zijn direct toepasbaar op de klinische setting als meer dan 60% van alle beroertes bij mensen optreden als gevolg van obstructie van de midden cerebrale slagader. 37 tenslotte de anesthesie tijdens tMCAo, isofluraan is aangetoond dat neuroprotectie induceren. 38 Om rekening te houden met deze neuroprotectie, isofluraan niveaus moeten consistent tussen operaties en tussen behandelde en onbehandelde experimentele groepen en gehandhaafd op <3% zijn potentieel neuroprotectieve effecten te verminderen. 39
Tijd is ook kritisch in de TTC kleuring proces. Hoewel er grote variatie in de lijn literatuur over de tijd waarin TTC kleuring kan worden uitgevoerd na ischemie, variërend van 4 uur tot 7 dagen na een beroerte, 18,40 TTC kleuring optreedt bij 24 tot 48 uur na een beroerte voor de consistent en duidelijk afgebakend infarct volumes. TTC infarct volumes hebben been gevonden om 24 uur te stabiliseren na een beroerte, maar na 48 uur, een toevloed van macrofagen in de ischemische hersenen maken waarin de infarctvolume moeilijk. 14,40 Verder is de kleuring van hersenweefsel met TTC dient onmiddellijk na opoffering. Uitstellen kleuring zal de kwaliteit van de vlek afnemen vanwege toegenomen mitochondriale dood door dieren dood niet herseninfarct. Een vergelijkbare toename van mitochondriale dood optreden als de hersenen tijdens het inbrengen van de bladen niet vochtig gehouden. Hoewel dit protocol illustreert duidelijk het voordeel van infarct analyse TTC kleuring, kunnen andere immunohistologische vlekken worden gebruikt om het infarctvolume volgende tMCAo kwantificeren. Cresylviolet of fluoro-jade kleuring hebben minder rigide tijd eisen voor de kleuring na offer, maar deze klassieke vlekken vereisen zeer dunne secties verkregen door cryostaat of microtoom, en dus meer tijd voor integratieve sommatie en analyse nodig. 14 Bovendien zijn deze stAins kan niet worden gebruikt met EB kwantificering van BBB verstoring, zoals ontwikkeld door anderen, 15 waardoor de mogelijkheid van een directe vergelijking tussen infarct volume en BBB integriteit in een gegeven hersenen. Opgemerkt wordt dat RHP-behandelde dieren vertoonden typische roze tegenover zuiver wit volumes. 6 Om wegspoelen van infarct in RHP-behandelde muizen vermijden wordt in een kortere periode TTC kleuring die resulteert in meer roze gezond weefsel in tegenstelling tot donkerrood. Evans Blue verwerking kan ook donkerder het infarct gebied zo zuiver wit infarcten waarschijnlijk met de dubbele kwantificering vlekken in dit protocol.
Om EB kwantificering vergelijken binnen en tussen groepen, moeten alle dieren gelijk circulatietijden ondergaan voor EB. Anderen hebben EB onmiddellijk na reperfusie geïnjecteerd en liet EB circuleren voor maximaal 72 uur, 41 of 4 uur na tMCAo circuleren gedurende 4 uur, 15 als alternative benaderingen. De hoeveelheid van EB dat de verstoorde BBB kruist en gaat hersenweefsel geeft de integrale accumulatie van albumine-gebonden kleurstof uit de tijd van de injectie om de tijd van het offer. Zo is de in dit document beschreven werkwijze maakt de status van de BBB precies op het tijdstip tussen 22 en 24 uur reperfusie, en kunnen minder of meer openingen of sluitingen van de barrière missen. Omgekeerd is de methode die door Wang et al. toont de status van de BBB voor 72 uur na beroerte, inclusief alle veranderingen BBB waarde tijdens die 3 dagen na de slagtijd 42 Noch protocol beter of slechter.; Hoewel het gevaar van "ontbrekende" een tijdelijke opening van de BBB met kortere circulatietijden blijft, zij kunnen onderzoekers specifieke temporele kenmerken van BBB pathofysiologie te identificeren en deze te koppelen aan andere methoden, zoals hier getoond. Anderen hebben TTC en EB gecombineerd door het injecteren van EB intracardiaal 1 min na transcardial perfusie. 18 Echter, deze ontmoettehod geproduceerd inconsistente resultaten en een veel ingewikkelder procedure dan het hierboven beschreven protocol.
Een van de meest veelbelovende toekomstige richtingen voor RHP is het translationele toepassing van deze voorconditionering protocol andere ziektetoestanden. Intermitterende hypoxische blootstelling werden beschermend gevonden in pro-inflammatoire uitzondering ischemie CNS omstandigheden. In een ratmodel van de ziekte van Alzheimer, 2 weken 4 uur dagelijkse blootstelling aan hypobarische hypoxie verminderde aantasting van retentie en verlies van corticale neuronen na intracerebrale injecties van beta-amyloïde geheugen. 43 Intermitterend hypoxia (2 weken 15 uur dagelijkse blootstelling aan hypobarische hypoxie ) werd ook gevonden beschermend ratten na L-buthionine- [S, R] -sulfoximine (L-BSO) infuus, een model van Parkinson die striatale dopaminergische transmissie schaadt. 44 echter deze modellen van Alzheimer en Parkinson alleen onderzocht de korte-termijn effecten vanhypoxische preconditionering. 43,44 Onderzoek naar de lange termijn neuroprotectie veroorzaakt door RHP kan een vruchtbare toekomstige richting voor onderzoek. Bovendien kan de neuroprotectie geïnduceerd door RHP vergroten tot verbetering BBB integriteit in muismodellen van Alzheimer, die kunnen worden geanalyseerd met EB. 45 De dubbele TTC en EB analyse zou nog nuttiger Parkinson model omdat deze ertoe leidt striatale letsel 46 en BBB verstoring, 47 die respectievelijk kunnen worden gekwantificeerd TTC 48 en EB, 49. Overall RHP is een eenvoudige, krachtige vorm van preconditionering met grote translationeel potentieel als het unieke induceert lange termijn, anti-inflammatoire en neuroprotectieve effecten. De dubbele kwantificering van TTC en EB kan ook gemakkelijk worden toegepast op andere ziektetoestanden die mitochondriale verstoring, celdood en BBB lekkage betrekken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flowmeters, regulators | VetEquip, Inc | Specialty order | Four flowmeters are attached to 6.0 mm flexible PVC tubing which connects to the inlet port on each induction chamber with a plastic female connector. These flowmeters are bolted to a 6.5" x 1" x 1" metal bar. This metal bar is bolted to a MI-246-P pressure gauge with a DISS outlet. This pressure gauge and flowmeter equipment can be attached to each new gas cylinder with a wrench. |
| 21% O2 tank | AirGas | OX USP200 | |
| 11% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
| 8% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
| 15 L induction chambers | VetEquip | 941454 | |
| Moor Laber Dopper Flow | Moor Instruments | moorVMS-LDF1-HP | 0.8 mm diameter probe |
| High Intensity Illuminator | Nikon | NI-150 | |
| Zoom Stereo Microscope | NIkon | SMZ800 | Other surgical microscopes may be used. |
| Kent Scientific Right Temperature CODA | Kent Scientific Corporation | Discontinued | Recommended replacement is PhysioSuite with RightTemp Temperature Monitoring and Homeothermic Control (Kent Scientific, #PS-RT). |
| Hovabator Incubator | Stromberg's | 2362-E | Our model is the 2362N. 2362E is a later model and includes an electronic thermostat. |
| V010 Anesthesia system | VetEquip | 901807 | Includes: ten foot high-pressure oxygen hose, frame, flowmeter, oxygen flush assembly, vaporizer, breathing circuit, chamber, nosecones, waste gas evacuation tubing and two VapoGuard filters |
| 250 ml isoflurane | Butler Schein | NDC-11695 | |
| D-6 Vet Trim Animal Cordless Trimmer | Andis | #23905 | Replacement blades are available from Andis (#23995) |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-898-867 | |
| Q-tips | Multiple sellers | Catalog number not available | |
| Gauze Pads | Fisher Scientific | 67622 | |
| Surgical drape | Fisher Scientific | GM300 | |
| Silk Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP115 | |
| Nylon Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP185 | |
| Durmont #5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11251-35 | Angled 45° |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| 3 mm Vannas | Kent Scientific Corporation | INS600177 | Straight blade |
| Hartman Hemostats | Fine Scientific Tools | 13002-10 | |
| Occluding filaments | Washington University | Specialty order | Filaments are silicone coated at Washington Univeristy and provided to UTSW facilities for a fee. |
| Evans Blue | Sigma Aldritch | E2129-10G | |
| Filter Paper | Sigma Aldritch | WHA1001150 | 150 mm, circles, Grade 1 |
| Weigh Boats | Fisher Scientific | 02-202-101 | 2.5" diameter |
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP | Baxter Pharmaceutics | 2B1321 | |
| 0.3 cc insulin syringe with 29 gauge needle | Becton Dickinson Labware | 309301 | |
| Flat bottom restrainer | Braintree Scientific | FB M | 2.0" diameter |
| TTC | Sigma | T8877 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| Water Bath | Multiple sellers | Catalog number not available | Scintillation tubes with TTC may be manually held under running warm water as an alternative to the water bath. |
| Styrofoam board | Multiple sellers | Catalog number not available | |
| Large Syringe Kit | PumpSystems Inc | P-SYRKIT-LG | |
| Perfusion Pump | PumpSystems Inc | NE-300 | |
| 60 cc syringe | Fisher Scientific | NC9203256 | |
| 27 gauge winged infusion set | Kawasumi Laboratories, Inc | D3K1-25G 1 | |
| 20 ml scintillation vial | Fisher Scientific | 50-367-126 | |
| Stainless steel spatula | Fisher Scientific | 14-373-25A | |
| Alto acrylic 1.0 mm mouse brain, coronal | CellPoint Scientific | Catalog number not available | |
| 0.21 mm stainless steel blades, 25 pk | CellPoint Scientific | Catalog number not available | Reusable cryostat blades are an inexpensive alternative. |
| 4% paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | SC-281692 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HP Scanjet G4050 | Multiple sellers | Catalog number not available | Other commercial scanners are suitable for this step in the protocol. |
| ImageJ | National Institute of Health | Catalog number not available | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 205U | |
| Precision Compact Oven | Thermo Scientific | PR305225M | |
| 1.7 ml microcentrifuge tubes (Eppendorfs) | Denville Scientific | C2170 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| 96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-9 | |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek | Catalog number not available |
References
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Gidday, J. M. Cerebral preconditioning and ischaemic tolerance. Nat Rev Neurosci. 7 (6), 437-448 (2006).
- Stetler, R. A., et al. Preconditioning provides neuroprotection in models of CNS disease: paradigms and clinical significance. Prog Neurobiol. 114, 58-83 (2014).
- Bernaudin, M., et al. Normobaric hypoxia induces tolerance to focal permanent cerebral ischemia in association with an increased expression of hypoxia-inducible factor-1 and its target genes, erythropoietin and VEGF, in the adult mouse brain. J Cereb Blood Flow Metab. 22 (4), 393-403 (2002).
- Lin, A. M., Dung, S. W., Chen, C. F., Chen, W. H., Ho, L. T. Hypoxic preconditioning prevents cortical infarction by transient focal ischemia-reperfusion. Ann N Y Acad Sci. 993, 168-178 (2003).
- Stowe, A. M., Altay, T., Freie, A. B., Gidday, J. M. Repetitive hypoxia extends endogenous neurovascular protection for stroke. Ann Neurol. 69 (6), 975-985 (2011).
- Monson, N. L., et al. Repetitive hypoxic preconditioning induces an immunosuppressed B cell phenotype during endogenous protection from stroke. J Neuroinflammation. 11, 22 (2014).
- Koizumi, J. Y. Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Liu, F., McCullough, L. D. The middle cerebral artery occlusion model of transient focal cerebral ischemia. Methods Mol Biol. 1135, 81-93 (2014).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. J Vis Exp. (69), (2012).
- Lin, X., et al. Surgery-related thrombosis critically affects the brain infarct volume in mice following transient middle cerebral artery occlusion. PLoS One. 8 (9), e75561 (2013).
- Yuan, F., et al. Optimizing suture middle cerebral artery occlusion model in C57BL/6 mice circumvents posterior communicating artery dysplasia. J Neurotrauma. 29 (7), 1499-1505 (2012).
- Kuraoka, M., et al. Direct experimental occlusion of the distal middle cerebral artery induces high reproducibility of brain ischemia in mice. Exp Anim. 58 (1), 19-29 (2009).
- Feng Zhang, J. C. Animal Models of Acute Neurolgoical Injuries II. Springer Protocol Handbooks. Chen, X. X. J., Xu, Z. C., JZ, W. ang , Humana Press. 93-98 (2012).
- Ludewig, P., et al. Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 inhibits MMP-9-mediated blood-brain-barrier breakdown in a mouse model for ischemic stroke. Circ Res. 113 (8), 1013-1022 (2013).
- Sandoval, K. E., Witt, K. A. Blood-brain barrier tight junction permeability and ischemic stroke. Neurobiol Dis. 32 (2), 200-219 (2008).
- Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiol Dis. 16 (1), 1-13 (2004).
- Benedek, A., et al. Use of TTC staining for the evaluation of tissue injury in the early phases of reperfusion after focal cerebral ischemia in rats. Brain Res. 1116 (1), 159-165 (2006).
- Yasmina Martin, C. A., Maria Jose Piedras, A. K. Evaluation of Evans Blue extravasation as a measure of peripheral inflammation. Protocol Exchange. , (2010).
- Belayev, L., Busto, R., Zhao, W., Ginsberg, M. D. Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Res. 739 (1-2), 88-96 (1996).
- Martin, J. A., Maris, A. S., Ehtesham, M., Singer, R. J. Rat model of blood-brain barrier disruption to allow targeted neurovascular therapeutics. J Vis Exp. (69), e50019 (2012).
- Kaya, M., Ahishali, B. Assessment of permeability in barrier type of endothelium in brain using tracers: Evans blue, sodium fluorescein, and horseradish peroxidase. Methods Mol Biol. 763, 369-382 (2011).
- Chen, Z. L., et al. Neuronal death and blood-brain barrier breakdown after excitotoxic injury are independent processes. J Neurosci. 19 (22), 9813-9820 (1999).
- Abulrob, A., Brunette, E., Slinn, J., Baumann, E., Stanimirovic, D. In vivo optical imaging of ischemic blood-brain barrier disruption. Methods Mol Biol. 763, 423-439 (2011).
- Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31 (11), 2707-2714 (2000).
- Xu, L., et al. Low dose intravenous minocycline is neuroprotective after middle cerebral artery occlusion-reperfusion in rats. BMC Neurol. 4, 7 (2004).
- Goldlust, E. J., Paczynski, R. P., He, Y. Y., Hsu, C. Y., Goldberg, M. P. Automated measurement of infarct size with scanned images of triphenyltetrazolium chloride-stained rat brains. Stroke. 27 (9), 1657-1662 (1996).
- Drummond, G. B., Paterson, D. J., McGrath, J. C. ARRIVE: new guidelines for reporting animal research. J Physiol. 588 (Pt 14), 2517 (2010).
- Miller, B. A., et al. Cerebral protection by hypoxic preconditioning in a murine model of focal ischemia-reperfusion). Neuroreport. 12 (8), 1663-1669 (2001).
- Zhu, Y., Zhang, Y., Ojwang, B. A., Brantley, M. A., Gidday, J. M. Long-term tolerance to retinal ischemia by repetitive hypoxic preconditioning role of HIF-1alpha and heme oxygenase-1. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (4), 1735-1743 (2007).
- Cui, M., et al. Decreased extracellular adenosine levels lead to loss of hypoxia-induced neuroprotection after repeated episodes of exposure to hypoxia. PLoS One. 8 (2), e57065 (2013).
- Prass, K., et al. Hypoxia-induced stroke tolerance in the mouse is mediated by erythropoietin. Stroke. 34 (8), 1981-1986 (2003).
- Svorc, P., Benacka, R. The effect of hypoxic myocardial preconditioning is highly dependent on the light-dark cycle in Wistar rats. Exp Clin Cardiol. 13 (4), 204-208 (2008).
- Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17 (4), 738-743 (1986).
- Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
- Lesak, M. D., Howieson, D. B., Loring, D. W. Neuropsychological Assessement. , Oxford University Press. 195-197 (2004).
- Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism. Neuroreport. 13 (11), 1431-1435 (2002).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. J Vis Exp. (47), (2011).
- Liu, F., Schafer, D. P., McCullough, L. D. T. T. C. fluoro-Jade B and NeuN staining confirm evolving phases of infarction induced by middle cerebral artery occlusion. J Neurosci Methods. 179 (1), 1-8 (2009).
- Wang, Z., Leng, Y., Tsai, L. K., Leeds, P., Chuang, D. M. Valproic acid attenuates blood-brain barrier disruption in a rat model of transient focal cerebral ischemia: the roles of HDAC and MMP-9 inhibition. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (1), 52-57 (2011).
- Rosenberg, G. A., Estrada, E. Y., Dencoff, J. E. Matrix metalloproteinases and TIMPs are associated with blood-brain barrier opening after reperfusion in rat brain. Stroke. 29 (10), 2189-2195 (1998).
- Goryacheva, A. V., et al. Adaptation to intermittent hypoxia restricts nitric oxide overproduction and prevents beta-amyloid toxicity in rat brain. Nitric Oxide. 23 (4), 289-299 (2010).
- Lin, A. M., Chen, C. F., Ho, L. T. Neuroprotective effect of intermittent hypoxia on iron-induced oxidative injury in rat brain. Exp Neurol. 176 (2), 328-335 (2002).
- Paul, J., Strickland, S., Melchor, J. P. Fibrin deposition accelerates neurovascular damage and neuroinflammation in mouse models of Alzheimer's disease. J Exp Med. 204 (8), 1999-2008 (2007).
- Deumens, R., Blokland, A., Prickaerts, J. Modeling Parkinson's disease in rats: an evaluation of 6-OHDA lesions of the nigrostriatal pathway. Exp Neurol. 175 (2), 303-317 (2002).
- Lee, H., Pienaar, I. S. Disruption of the blood-brain barrier in Parkinson's disease: curse or route to a cure. Front Biosci (Landmark Ed. 19, 272-280 (2014).
- Jenkins, B. G., et al. Non-invasive neurochemical analysis of focal excitotoxic lesions in models of neurodegenerative illness using spectroscopic imaging). J Cereb Blood Flow Metab. 16 (3), 450-461 (1996).
- Chen, X., Lan, X., Roche, I., Liu, R., Geiger, J. D. Caffeine protects against MPTP-induced blood-brain barrier dysfunction in mouse striatum. J Neurochem. 107 (4), 1147-1157 (2008).
