Abstract
L'uso di alcol disturbo (AUD) è una sfida di salute gravi. Nonostante una grande componente ereditaria per AUD, pochi geni sono stati inequivocabilmente implicati nella loro eziologia. Il moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, è un modello potente per esplorare i meccanismi molecolari alla base genetica comportamenti alcol-correlati e detiene quindi una grande promessa per l'identificazione e la comprensione della funzione dei geni che influenzano AUD. L'uso del modello Drosophila per questi tipi di studi dipende dalla disponibilità di saggi che misurano affidabile risposte comportamentali a etanolo. Questo rapporto descrive un test adatto per valutare la sensibilità etanolo e tolleranza rapida in mosche. Etanolo sensibilità misurata in questo saggio è influenzata dal volume e la concentrazione di etanolo utilizzato, una varietà di manipolazioni genetiche precedentemente riportati, e anche la lunghezza di tempo in linea sono alloggiati senza cibo immediatamente prima del test. Al contrario, etanolo sensitivity misurata in questo dosaggio non è influenzato dal vigore di movimentazione mosca, sesso in linea, e la supplementazione di mezzo di crescita con antibiotici o lieviti vivi. Tre metodi diversi per quantificazione sensibilità etanolo sono descritte, tutto conduce a risultati sostanzialmente indistinguibili sensibilità etanolo. La natura scalabile di questo test, in combinazione con la sua semplicità complessiva di set-up e relativamente a basso costo, lo rendono adatto per l'analisi piccola e grande scala genetica della sensibilità etanolo e tolleranza rapida in Drosophila.
Introduction
L'uso di alcol disturbo (AUD) è un problema di salute enorme in tutto il mondo (rivisto in 1). Sebbene i meccanismi di guida lo sviluppo di AUD sono complesse, questi disturbi hanno una notevole componente genetica (ad esempio, 2). La grande ereditabilità di AUD e le risposte comportamentali conservati in etanolo in molte specie (recensito in 3,4) hanno generato un forte interesse ad utilizzare organismi modello genetici per studiare il coinvolgimento di specifici geni nei comportamenti etanolo legate verso una migliore comprensione delle basi molecolari di AUD. Il moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, è emerso come organismo modello principale per esplorare i meccanismi molecolari-genetica dei comportamenti etanolo correlati (recensito in 3,4). Studi in mosche hanno evidenziato i ruoli per diverse vie di segnalazione nelle risposte comportamentali a etanolo (recensito in 5). Curiosamente, alcuni dei geni e dei percorsi che influenzare respons comportamentalies a etanolo in linea sono stati implicati in roditori comportamenti etanolo correlati e / o AUD umana (ad esempio, 6-14). La conservazione di meccanismi di guida comportamenti etanolo legate tra le specie, insieme con la suite di strumenti genetici disponibili nel sistema modello Drosophila, sottolineano l'utilità del modello di mosca della frutta per studiare la genetica di risposte comportamentali a etanolo.
Sensibilità 15,16 e tolleranza (rivisto in 17) di etanolo negli esseri umani è legato allo sviluppo di AUD. Entrambe queste risposte comportamentali a etanolo può essere modellato in linea attraverso una serie di test di laboratorio (rivisto in 3,4). Tutti i saggi mosca noti gli autori sono basati su uno dipendente dal tempo etanolo-indotta sedazione / incoordinazione o di recupero in funzione del tempo da etanolo sedazione.
In un precedente articolo dal nostro gruppo sulla genetica della sensibilità etanolo e rtolleranza APID in Drosophila, un test comportamentale basato su etanolo sedazione vapore indotta di mosche è stato utilizzato 18. Test in questo test è stato avviato con il trasferimento dal vivo adulti vola senza anestesia svuotare fiale alimentari, intrappolando le mosche nelle fiale con una spina di acetato di cellulosa, aggiungendo etanolo verso l'alto (cioè, lato non volo) del tappo di acetato di cellulosa, e sigillare la fiala contenente mosche, spina acetato di cellulosa e di etanolo con un tappo di silicone (vedi schema in Figura S3, riferimento 18). Più fiale che rappresentano diversi gruppi di mosche sono state valutate in parallelo, aumentando la velocità di questo test. Fiale sono stati dati un codice anonimo e sperimentatori sono stati accecati per gruppo di trattamento per prevenire la distorsione intenzionale nella valutazione della sedazione. In un esperimento standard mosche in fiale erano picchiettare leggermente ad intervalli di 6 min e, dopo un recupero di 30 secondi, il numero di mosche sedati in ogni flacone è stato contato e converted per cento mosche attivi. Mosche assorbiti vapori di etanolo dal tappo di acetato di cellulosa in modo dipendente dal tempo, causando un aumento progressivo in etanolo interno 18 e sedazione (riferimento cf 18 e Figure 1A e 1B in questo rapporto). La sedazione in questo test è stato operativamente definita come mosche (i) in piedi in assenza di camminare o (ii) che giace sulla schiena, con o senza sbattere le ali. Qui, questo dosaggio etanolo sedazione è descritta in dettaglio, ulteriore ottimizzazione operativa che riguardano l'uso è previsto, e il test viene utilizzato per indirizzare il contributo delle opzioni integrazione alimentare sulla sensibilità fly sedazione.
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Protocol
1. Giorno Prima Assay
- Raccogliere mosche in fiale alimenti freschi in gruppi di 11 (sesso unico) in breve (1-5 minuti) CO 2.
- Consentire mosche di recuperare O / N in fiale alimentari in uno spazio ambiente controllato (tipicamente 25 ° C, 60% umidità relativa, 12 hr luce / buio ciclo).
- Preparare la soluzione di etanolo (s) diluendo puro (100%) di etanolo in purificato (≥18 MW) di acqua a concentrazione finale (s) appropriato per l'esperimento previsto. Lasciare la soluzione (s) per tornare alla RT O / N.
Nota: La diluizione di etanolo è esotermica.
2. Giornata di test
- Per ogni flacone di mosche da testare, preparare (i) un ambiente pulito, vuoto alimentare flacone; Per esempio, il test flacone, (ii) un nuovo plug acetato di cellulosa, (iii) un tappo silicone e (iv) 1 ml di soluzione di etanolo (vedi Tabella 3).
- Preparare sala prove regolando la temperatura a 20-25 ° C e umidità relativa al 55-65%.
- Hanno un altro lavoratoreassegnare un codice univoco a ciascun gruppo di flaconi e registrare il codice per dopo. Posizionare fiale codificati con le mosche in sala prove per ambientarsi per pochi minuti.
- Etichetta fiale test vuoti per abbinare i codici di fiale vola da 2.3.
- Costruire un registro test cartaceo inserendo i codici in colonne (una colonna / flaconcino) in un foglio di calcolo simile alla Tabella 1.
- Utilizzo del registro di test come una guida, organizzare fiale alimentari codificati con mosche e fiale di test vuoti in corrispondenza array in sala prove.
Nota: Un ragionevole numero massimo di fiale di test è 24 (cioè, 6 set di 4 flaconcini ciascuna). - Trasferimento vola da flaconcini alimentari in abbinati / etichettati fiale test vuoto e inserire immediatamente spine in acetato di cellulosa in fiale di prova fino a quando le spine di acetato di cellulosa sono 2 cm sotto le cime delle fiale.
- Hereafter, gestire ogni fila di quattro fiale come insieme ad sfalsati min intervalli di 1.
- Per la valutazione tempo 0, cogliere ogni flaconcino individualmente with pollice e l'indice, toccare delicatamente sul tavolo tre volte per battere mosche al fondo della fiala, attendere 30 sec e poi contare il numero di mosche che sono immobili / morti. Registrare il numero di mosche immobili / morte per ogni flacone al tempo 0 min nel registro test cartaceo.
- Inizia timer conteggio continuamente al tempo 0 e iniziare immediatamente aggiungendo 1 ml di etanolo a tappi acetato di cellulosa in fiale per la prima riga / set di 4 fiale. Aggiungere 1 ml di etanolo per i tappi di acetato di cellulosa in fiale a intervalli di 5 sec nell'ordine in cui saranno testati. Aggiungere etanolo per i tappi di acetato di cellulosa in un movimento circolare in modo che l'etanolo viene assorbita in modo uniforme in tutto i tappi di acetato di cellulosa. Quando l'etanolo è stato aggiunto a tutti i 4 flaconcini di test nel set, inserire un tappo di silicone in ogni fiala per sigillarlo.
- A volte 1, 2, 3, 4 e 5 min, aggiungere 1 ml di etanolo al secondo, terzo, quarto, quinto e sesto set di 4 flaconcini, rispettivamente. Continuare inserendo tappi in silicone dopoaggiungendo etanolo per ciascun set di 4 fiale.
- Al momento 6 min, testare la prima serie di 4 flaconi afferrando ogni flacone con il pollice e l'indice, picchiettando delicatamente sul tavolo tre volte per battere mosche al fondo del flacone, in attesa 30 sec e poi contare e registrare il numero totale di mosche che sono sedati. Score vola come sedato se (i) stanno sul pavimento del flacone, ma non camminano o (ii) si trovano sulla schiena, con o senza sbattere le ali.
- Maneggiare ogni flacone all'interno del set ad intervalli di 5 sec utilizzando il programma in tabella 2.
- A volte 7, 8, 9, 10 e 11 min, testare il secondo, terzo, quarto, quinto e sesto set di fiale, rispettivamente, come fatto per la prima serie.
- Al tempo 12 min, testare la prima serie di 4 provette nuovamente come descritto in 2.12 e continuare il test secondo, terzo, quarto, quinto e sesto serie di flaconi a 13, 14, 15, 16 e 17 minuti, rispettivamente.
- Continuare mosche test come descritto in 2.12 fino a quando tutte le mosche sono sedated.
- Inserire il numero totale di mosche in ogni fiala nel registro test cartaceo. Censore mosche immobile / morti al tempo 0 dal numero totale di mosche.
- Calcolare i cento mosche attivi ad ogni valutazione di time-point e dati plot come% mosche attivi (asse y) in funzione del tempo (asse x). Quantificare etanolo sedazione interpolando sedazione Tempo 50 valori (ST50, tempo al 50% sedazione) dal terzo ordine curva polinomiale o sigmoidale adatta o calcolare l'area sotto la curva.
- Compilare i dati provenienti da flaconi decodificati e effettuare analisi statistiche (ad esempio, una via ANOVA con Bonferroni test di confronto multiplo), secondo il disegno sperimentale.
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Representative Results
I dati grezzi di questa analisi etanolo sedazione sono i numeri di mosche che vengono sedati in funzione del tempo di esposizione al vapore etanolo. I dati grezzi sono convertiti in linea attivi cento in funzione del tempo (dati primario, figure 1A, B, D - F). La sensibilità all'etanolo sedazione dai dati primari può essere quantificata come sedazione Tempo 50 (ST50), il tempo necessario per il 50% di mosche per diventare sedato o aea sotto la curva (AUC), via interpolazione curva adatta. In precedenza segnalati 18 terzo ordine curve polinomiali inseriscono i dati primari e come previsto (media R 2 = 0,934, n = 24, Figura 1A), anche se le curve sigmoidali inseriscono i dati primari po 'meglio (R media 2 = 0.997, n = 24; Figura 1B). In alternativa a determinare valori da ST50 curva convulsioni, sensibilità etanolo sedazione dai dati primari può essere quantificata come zonasotto la curva (AUC,% mosche attivi x tempo) (Figura 1C). I risultati di questi tre metodi di quantificazione correlano molto bene con l'altro (Pearson r 2 ≥0.998, n = 24) e sono sostanzialmente indistinguibili (Figura 1C), anche se le unità sono necessariamente diversi per ST50 (min) e AUC (% attiva mosche x tempo). I dettagli riguardanti tutti i calcoli, i fogli di calcolo utilizzati, ecc, sono disponibili presso l'autore corrispondente. Si noti che i valori più alti e più bassi di ST50 (o AUC) indicano smussati e maggiore sensibilità all'etanolo sedazione, rispettivamente. Per coerenza con la relazione precedente 18, valori ST50 derivati dal terzo ordine curva polinomiale attacchi sono stati utilizzati in tutto il resto di questo study.Importantly, il test rileva gli effetti di RNAi contro Cnx14D (Figura 1D) e mutazioni in SCB (Figura 1E) , aru e hppy (Figura 1F),
Durante l'uso di routine di questo test, maschiatura di fiale con tappi di acetato di cellulosa bagnate con 2 ml di etanolo causato l'acetato di cellulosa spine di viaggiare verso i fondi di alcune fiale in pochi esperimenti individuali (non mostrato), così potenzialmente cambiando libera linea ' spazio e la concentrazione di vapore di etanolo. Inoltre, circa 0,25 ml di etanolo raggiunto il fondo (cioè, l'intero lato) delle spine acetato di cellulosa quando sono stati bagnati con 2 ml di etanolo (Figura 2A), aumentando la possibilità che vola in questi test sono stati esposti a etanolo liquido in aggiunta di etanolo vapore. Diminuendo il volume di etanolo nella spina acetato di cellulosa da 2 ml a 1 ml eliminato la migrazione verso il basso delle cellulosspine acetato e durante il test anche dopo maschiatura vigorosa (non mostrato) e anche eliminata quantità misurabili di soluzione di etanolo sul fondo dei tappi di acetato di cellulosa (Figura 2A). Sedazione di mosche era sensibile al volume di etanolo utilizzato anche con volumi inferiori ad 1 ml (Figura 1A - C). Uso 1 ml di etanolo contribuisce pertanto a mantenere una costante spazio aperto per mosche durante il dosaggio e assicura che etanolo liquido non viene ingerito. Le mosche sono quindi presumibilmente esposti a etanolo unicamente come un vapore in questo test. Un ml di etanolo all'85% (vale a dire, il vapore da 1 ml di 85% (vol / vol) etanolo) e 1-5 giorni di età w [A] mosche sono stati utilizzati in tutti gli studi successivi riportati qui a meno che non diversamente indicato.
In esperimenti con 24 fiale, le mosche sono battuto leggermente a intervalli di 6 minuti per consentire lo sperimentatore di valutare (cioè, scorrere) tutte le fiale in un ragionevole, Schedul prescrittoe. ST50s provenienti da studi su linea di comando con un minor numero di fiale e intervalli di 5 min erano paragonabili a ST50s da studi con intervalli di 6 min (dati non riportati). Le mosche sono valutati per la sedazione 30 sec dopo avere toccato per consentire il tempo sperimentatore di toccare una serie di quattro fiale in sequenza prima di determinare lo stato di sedazione delle mosche in ogni flacone. Per determinare se le differenze di intercettazioni vigore o tempo di recupero dopo aver toccato la sensibilità sedazione etanolo impatto, valori ST50 in linea di controllo uomini e donne sono stati misurati mentre viene sfruttato normalmente (normale) o molto forte (Hard) e dopo 30 secondi standard o più 60 sec recupero. Vigore Tapping (Figura 2B) e il tempo di recupero (Figura 2C) non avevano alcun effetto misurabile sui valori ST50 nei maschi di controllo o femmine.
Gli antibiotici possono essere utilizzati per sopprimere la crescita batterica nel terreno fly alimentare. Per determinare se l'integrazione del mezzo cibo con antibiotici colpisce sensibilità sedazione etanolo,ST50 valori sono stati misurati in linea allevati per una generazione in presenza o assenza di tre antibiotici (ampicillina, 100 mg / ml; tetraciclina, 20 mg / ml; cloramfenicolo, 125 mg / ml). Mosche di allevamento su queste tre antibiotici non hanno avuto effetti sulla sensibilità etanolo sedazione (Figura 2D).
Mosche sono trasferiti alimentari vuoti fiale e sono quindi privati di cibo e acqua per ~ 5 min-immediatamente prima di essere esposto a vapori di etanolo nel test sedazione. Per determinare se la quantità di tempo vola sono conservati in fiale vuote alimentari prima di iniziare la sensibilità sedazione impatti dosaggio etanolo, mosche digiuno per 6 ore (almeno 70 volte della normale) e quindi sono stati misurati i valori ST50. La fame di 6 ore è diminuito significativamente ST50s in entrambi mosche controllo maschili e femminili (Figura 2E). Anche se l'effetto di fame sulla ST50 era relativamente piccola (9-14% in questi esperimenti), la quantità di tempo vola spend in flaconi vuoti prima di essere esposti a vapori di etanolo nel test dovrebbe essere tenuta uniforme tra gruppi all'interno di un esperimento e anche tra gli esperimenti.
Fly cibo Laboratorio può essere completato con lieviti vivi (ad esempio, 18,20,23,24) per promuovere la produzione di progenie. Ad esempio, fiale alimentari integrati con lievito vivo (Saccharomyces cerevisiae) prodotta adulti prima di quelli con lievito ucciso al calore o nessun lievito vivo (confrontare D10-D11, barre bianche, Figura 3A), anche se il numero totale di progenie prodotta nell'arco di 20 giorni era indistinguibile in fiale integrati con lieviti vivi e ucciso al calore (Figura 3A). Per affrontare la possibilità che vivono lieviti producono quantità significative di etanolo su fly cibo, gli effetti di lievito vivo su (i) etanolo nel mezzo alimentare, (ii) in etanolo mosche, e (iii) la sensibilità etanolo sedazione in linea sono stati misurati. Media alimentare integrato con sub lieviti vivi contenutiquantità sostanziali di etanolo rispetto al cibo arricchito con calore ucciso o no lievito (Figura 3B). Tuttavia, le mosche di controllo coltivate su supporto integrato con live, uccisi o no lievito avuto indistintamente basse concentrazioni di etanolo interna (Figura 3C). Inoltre, la sensibilità sedazione etanolo era indistinguibile in mosche di controllo cresciuti in media integrato con calore uccisi o lieviti vivi (Figura 3D).
Figura 1. opzioni di analisi dei dati (AC) saggio sedazione. Controllo w [A] femmine (w 1118 isogenico, Bloomington Indiana Drosophila Stock Center magazzino # 5905) sono stati esposti a vapore dai volumi del 85% (vol / vol) di etanolo indicate. Dati (A) La sedazione volta portate in forma con terzo polinomi di ordine. (B)Dati sedazione volta portate in forma con le curve sigmoidali. (C) Etanolo sedazione sensibilità misurata come (a sinistra dell'asse Y) valori ST50 interpolati dai polinomi di terzo ordine e curve sigmoidali o (destra asse Y) area sotto la curva (AUC,% mosche Active X di tempo). Volume di etanolo, ma non metodo di analisi, la sensibilità etanolo impatto (ANOVA a due vie; effetto volume, p <0,0001; effetto del metodo di analisi, ns; n = 8 / gruppo; AUC dati trasformati 1/100 rappresentano la differenza grandezza dei valori). (DF) Dati Rappresentante tempo portate da. (D) Espressione di Cnx14D RNAi nel sistema nervoso (ELAV-Gal4 / v5597) smussato etanolo sensibilità relativa ai controlli (v5597 / + e ELAV-Gal4 / + ). (E e F) Mutazione di s cb (SCB Vol2) e Aru (Aru 8,128) maggiore sensibilità sedazione etanolo e mutazione del hppy (hppyKG5537) smussarsi sensibilità sedazione etanolo rispetto ai controlli. Dati in EF sono stati precedentemente segnalati come valori ST50 18.
Figura 2. Valutazione dei parametri operativi nel test sedazione. (A) Quantità di etanolo in basso 2 mm di spine acetato di cellulosa. Il volume di etanolo aggiunto alle cime delle spine acetato di cellulosa avuto un effetto significativo sul volume di etanolo che si muoveva nelle basso 2 mm di spine acetato di cellulosa durante un esperimento 60 min finto (ANOVA, p <0,0001; * Bonferroni Test per confronti multipli, 2 ml vs 0 e 1 ml, p <0,05 n = 4). L'etanolo è stata quantificata come un cambiamento di massa dei tappi di acetato di cellulosa. (B) Né vigore delle toccando i flaconi durante i test (Regular, Hard), né il sesso delle mosche testato ST50s colpiti (due way ANOVA; effetto di intercettazioni, ns; Effetto di sesso, ns; n = 12) (C) Né il tempo di recupero dopo aver toccato né il sesso ha avuto effetti significativi sulla ST50s (ANOVA a due vie,. effetto del tempo di recupero, ns, effetto del sesso, ns;. n = 6) (D) Inclusione di antibiotici (ATC, ampicillina, tetraciclina e cloramfenicolo) nel mezzo di crescita non ha avuto effetto complessivo sul ST50s, ma c'era un effetto del sesso sulla ST50 (ANOVA a due vie; effetto di ATC, ns, effetto del sesso, p = 0,001; interazione , ns;. n = 6) (E) Effetto di fame sulla sensibilità etanolo sedazione. ST50s erano significativamente più bassi nei mosche privati di cibo e acqua per 6 ore (Starved) rispetto al normalmente alimentato (Fed) vola; ST50s in maschi e femmine erano indistinguibili complessiva (ANOVA a due vie; effetto di fame, p <0,0001; effetto del sesso, ns; n = 12; * Bonferroni test per confronti multipli, effetto della fame in maschi e femmine, p <0.05) .
Figura 3. Effetto di lieviti vivi sulla crescita, il contenuto di etanolo e sensibilità sedazione. (A) discendenza adulti da flaconi contenenti un mezzo di cibo integrato senza lievito (No Y), calore lievito ucciso (Killed Y) o lieviti vivi (Live Y). Bar bianchi, discendenti degli adulti emergenti durante i giorni 10-11; barre grigie, giorni 12-20. Complessivamente, il trattamento di lievito ha avuto un effetto significativo sulla produzione prole (solo andata ANOVA; tutto (10-20) giorni, p <0,0001; 10-11 giorni, p <0,0001; 12-20 giorni, p = 0.0002; n = 5 ). Numero totale di progenie prodotta durante tutti (10-20) giorni era maggiore di flaconcini con Ucciso Y e Y in diretta di No Y (test di confronto Bonferroni multipla, p <0.05). Durante i giorni 10-11, fiale con Live Y prodotto più progenie di uccisi Y e flaconcini con Ucciso Y prodotto più progenie di No Y (barre bianche, Bonferroni test per confronti multipli, p <0.05). Durante i giorni 12-20, fiale with Ucciso Y prodotta più prole di flaconcini con No Y o live Y (barre grigie, Bonferroni test di confronto multiplo, p <0,05). (B) Etanolo nel medio cibo era significativamente più alta in fiale integrati di Live Y rispetto a flaconi con No Y e ucciso Y (ANOVA, p <0,0001, n = 5; Bonferroni test di confronto multiplo, p <0,05) (C), etanolo interno w [A] mosche di sesso femminile non è stata significativamente influenzata dalla supplementazione con il lievito (uno. -way ANOVA, ns, n = 5-10). Contenuto di etanolo in B e C determinato come descritto 18 (D) valori ST50 non è risultata significativamente alterata dalla supplementazione di mezzo di crescita con il lievito in maschio o femmina w [A] (ANOVA a due vie,. Effetti di lievito, ns; effetto di sesso, ns; n = 12).
| vial → | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| codice → | ||||||||
| totale # → | ||||||||
| 0 min | ||||||||
| 6 min | ||||||||
| 12 min | ||||||||
| 18 min | ||||||||
| 24 min | ||||||||
| 30 min | ||||||||
| 36 min | ||||||||
| 42 min | ||||||||
| 48 min | ||||||||
| 54 min | ||||||||
| 60 min |
Tabella 1: test di registro tipico. Vedere protocollo fase 2.5.
| Fiala | Rubinetto | Valutare |
| 1 | 6 min 0 sec | 6 min 30 sec |
| 2 | 6 min 5 sec | 6 min 35 sec |
| 3 | 6 min 10 sec | 6 min 40 sec |
| 4 | 6 min 15 sec | 6 min 45 sec |
Tabella 2:. Intercettazioni tipico programma di test Vedere protocollo passo 2.13.
| Nome del materiale / attrezzature | Azienda | Numero di catalogo | Commenti / Descrizione |
| fiale alimentari | VWR | 89092-772 | stretto |
| Flugs | Genesee / AVV AL VOLOuff.com | 49-102 | stretto |
| tappo in silicone | Fisher Scientific | 09-704-1l | # 4 |
| etanolo | Farmaco-Aaper | 111000200 | 200 prova |
Tabella 3: Materiali.
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Discussion
Test semplice che riproducibile quantificare fenotipi significativi sono di grande valore per l'analisi del comportamento. Il lavoro qui descritto affronta diversi aspetti pratici di un test per misurare la sensibilità etanolo sedazione e tolleranza rapida in Drosophila. Sebbene non sia un obiettivo di questo lavoro, analisi comportamentali sono facilitate mantenendo l'ambiente e lo sfondo costante genetico per soggetti di prova all'interno di uno studio. Inoltre, i confronti dovrebbero generalmente essere fatti tra gruppi di mosche allevati e testati side-by-side. A tal fine, tutte le mosche all'interno dei singoli esperimenti in questo lavoro ha avuto lo stesso background genetico e sono stati allevati fianco a fianco in condizioni ambientali uniformi (25 ° C, 60% di umidità relativa, 12 ore di luce / buio ciclo) con il supporto alimentare standard (10 % saccarosio, 3,3% di farina di mais, 2% lievito e 1% agar) tranne per quegli esperimenti in cui il mezzo cibo era esplicitamente manipolato.
Il ethAnol sedazione test qui descritto richiede pochi materiali (fiale di plastica, tappi acetato di cellulosa, tappi silicone e etanolo), che sono tutti poco costosi e facilmente disponibili da fonti commerciali (Tabella 3). Questo test etanolo sedazione è simile a ed in gran parte basata su metodi precedentemente riportate (ad esempio, 6,20,25-27, a un riesame in 3,28). Anche se tutti questi test hanno un'utilità per misurare la sensibilità sedazione etanolo, i vantaggi del test qui descritto comprendono (i) le mosche non sono esposti a etanolo liquido durante il saggio, (ii) la possibilità ridotta che vola possa impigliarsi in cotone o altro materiale nel flaconcino test durante il dosaggio, (iii) la possibilità di testare molti gruppi di mosche in parallelo, e (iv) tre opzioni per la quantificazione obiettivo della sensibilità etanolo da insiemi di dati primari. Insieme, questi vantaggi in gran parte eliminare la possibilità che vola bevanda etanolo, that di etanolo potrebbe bagnare le superfici esterne di mosche inibendo così le loro capacità complessive locomotore, e che le prestazioni di mosche nel test potrebbe essere confusi da difficoltà connesse con il materiale impiglianti nell'ambiente di test. Inoltre, questi vantaggi aumentano il throughput complessivo e la riproducibilità del dosaggio. Inoltre, la sensibilità etanolo misurato in questo dosaggio non sono influenzate dalla espressione endogena bianco o il marcatore transgenico mini-bianco 18, che lo rende adatto per studi con transgeni e background genetico comunemente utilizzati in Drosophila analisi genetiche.
Diversi parametri chiave dovrebbero essere controllati per ottenere risultati affidabili dai test etanolo sedazione. Oltre a controllare l'ambiente di crescita e background genetico dei ceppi in prova (vedi sopra), il volume e la concentrazione di etanolo sono naturalmente estremamente importante per la quantificazione di etanolo sensitivity. Si noti che la diluizione di etanolo in acqua è esotermica. Di conseguenza, le soluzioni diluite di etanolo dovrebbe essere consentito di equilibrare alla RT prima dell'inizio dei test di sedazione. Un ulteriore parametro che deve essere reso uniforme tra i gruppi in fase di sperimentazione è la lunghezza di tempo che mosche sono alloggiati in fiale vuote alimentari prima di iniziare il dosaggio sedazione. Due ulteriori parametri dovrebbero essere controllati. Il numero di mosche per flaconcino dovrebbe essere idealmente (a) la stessa in tutti i flaconi e gruppi, (b)
un numero che può essere facilmente contato rapidamente, e (c) un valore sufficientemente elevato per consentire sedazione tempo portate relativamente lisce. Eleven vola / flacone funziona bene nel nostro laboratorio ed è un punto di partenza suggerito. Un ultimo parametro da considerare è l'età delle mosche utilizzate in saggi di sedazione. Anche se nessun effetto riproducibili dell'età sulla sensibilità etanolo sedazione in 1-10 giorni vecchi mosche è stato trovato (dati non mostrati), l'uso di animali giovani pari età sembragiustificato data la vasta letteratura sui cambiamenti comportamentali correlate all'età mosche 29,30.
Altri parametri non sembrano critico in saggi sedazione, almeno quando il test linea di controllo utilizzando gli intervalli di parametri qui descritti. Sesso, la forza di battere, il tempo di recupero da intercettazioni, e l'integrazione di alimenti volo con antibiotici (ampicillina, tetracicline e cloramfenicolo) o lieviti vivi non alterano la sensibilità etanolo misurata come descritto qui. Allo stesso modo, quantificazione della sensibilità etanolo per interpolazione da terzo ordine curve polinomiali, interpolazione da curve sigmoidali, o la determinazione della AUC dai dati time-course sedazione primario porta a interpretazioni essenzialmente indistinguibili. Anche se nessun effetto del sesso è stata costantemente osservata negli studi qui descritti, gli effetti del sesso sulla sensibilità etanolo in diversi background genetico di Drosophila sono stati segnalati 31. Pertanto, è possibile che gli effetti sessuali eranosemplicemente mascherato da variabilità genetica nel w [A] sfondo usato qui. In alternativa, è possibile che misura gli effetti del sesso sulle risposte comportamentali in Drosophila richiedono condizioni di analisi o di crescita ancora non identificati. In ogni caso, la raccomandazione è quello di rendere tutti i parametri più uniforme possibile in saggi sedazione, compreso il sesso di nessun gruppo essere confrontato esplicitamente.
Dato che lieviti vivi producono quantità considerevoli di etanolo in fly cibo, era un po 'sorprendente che la supplementazione di cibo con lieviti vivi non ha aumentato l'etanolo interno in mosche. Una possibile spiegazione è che l'etanolo non è prodotto in modo uniforme su tutta la superficie del cibo e vola potrebbe quindi selettivamente ingerire cibo con nessuna o relativamente basse concentrazioni di etanolo. Ulteriori studi saranno necessari per affrontare questa e altre possibili spiegazioni per questo risultato.
Un gran numero di modifiche al describ testEd qui sono possibili a seconda degli obiettivi dell'esperimento in corso di esecuzione. Ad esempio, il numero di flaconcini testato in un esperimento, il numero di mosche testati in ciascuna fiala, la concentrazione e il volume di etanolo utilizzato, la durata dell'esposizione etanolo, l'intervallo di tempo tra le valutazioni sedazione, l'età e il sesso delle mosche testato , nonché i criteri per la sedazione possono essere modificati per soddisfare le esigenze di un singolo laboratorio. La raccomandazione è di iniziare con uno o due gruppi di quattro flaconi quando inizialmente apprendimento dosaggio e poi scalare fino a utilizzando il numero di flaconcini che fornisce la velocità necessaria per il progetto. Devono essere osservate ST50s inaspettatamente breve o lungo, sarebbe buona prassi per garantire che le mosche di test sono stati sottoposti a breve (1-5 min) volte anestesia, sono stati autorizzati a recuperare da anestesia O / N, sono stati meno di 10 giorni, sono stati non danneggiato fisicamente durante la manipolazione, non sono stati bagnati dalla soluzione di etanolo, e non ha avuto disturbi locomotori.
L'etanolo sensibilità sedazione misure saggio solo e quindi non è progettato o adatto per valutare altre risposte comportamentali per l'etanolo. Come tutti i paradigmi comportamentali etanolo noto in mosche, questo saggio richiede mosche di avere in gran parte normali capacità locomotorie e genotipi quindi con locomozione compromessa non devono essere testati. Un altro limite di sensibilità del metodo è che la concentrazione di vapore di etanolo nel flaconcino è presumibilmente continuo aumento le volatilizza droga dal tappo di acetato di cellulosa. Anche se l'etanolo interno linea 'aumenta progressivamente con il tempo in tutta volare etanolo test comportamentali, sembra possibile che la consegna di una concentrazione fissa di vapori di etanolo per mosche potrebbe migliorare la coerenza dei risultati di questo test. Metodo per fornire una concentrazione fissa di vapori etanolo non è stato ancora identificato che permetterebbe il test da utilizzare su scala qui descritto.
La sedazione etanolotest qui descritto è particolarmente adatto per l'analisi genetica della sensibilità etanolo e rapida tolleranza 18. Crescita ambiente, background genetico, la concentrazione e il volume di etanolo, la quantità di tempo vola passano in fiale vuote alimentari, e il numero e l'età di mosche utilizzati dovrebbero essere controllati. Assumendo questi parametri sono adeguatamente controllati, il saggio sedazione dovrebbe essere adatto sia inversa e in avanti approcci genetici che indagano le basi molecolari per le risposte comportamentali di etanolo in Drosophila.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| food vials | VWR | 89092-772 | narrow |
| Flugs | Genesee/flystuff.com | 49-102 | narrow |
| silicone stopper | Fisher Scientific | 09-704-1l | #4 |
| ethanol | Pharmaco-Aaper | 111000200 | 200 proof |
References
- Rehm, J., et al. Global burden of disease and injury and economic cost attributable to alcohol use and alcohol-use disorders. Lancet. 373, 2223-2233 (2009).
- Prescott, C. A., Kendler, K. S. Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins. The American journal of psychiatry. 156, 34-40 (1999).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research. Annual review of neuroscience. 36, 121-138 (2013).
- Scholz, H., Mustard, J. A.
- Rodan, A. R., Rothenfluh, A. Functional Plasticity and Genetic Variation: Insights into the Neurobiology of Alcoholism. Reilly, M. T., Lovinger, D. M. 91, Elsevier. (2010).
- Schumann, G., et al. Genome-wide association and genetic functional studies identify autism susceptibility candidate 2 gene (AUTS2) in the regulation of alcohol consumption. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7119-7124 (2011).
- Corl, A. B., et al. Happyhour, a Ste20 family kinase, implicates EGFR signaling in ethanol-induced behaviors. Cell. 137, 949-960 (2009).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
- Scholz, H., Franz, M., Heberlein, U. The hangover gene defines a stress pathway required for ethanol tolerance development. Nature. 436, 845-847 (2005).
- Riley, B. P., et al. Alcohol dependence is associated with the ZNF699 gene, a human locus related to Drosophila hangover, in the Irish affected sib pair study of alcohol dependence (IASPSAD) sample. Molecular psychiatry. 11, 1025-1031 (2006).
- Morozova, T. V., et al. Alcohol sensitivity in Drosophila: translational potential of systems genetics. Genetics. 183, 733-745 (2009).
- Ogueta, M., Cibik, O., Eltrop, R., Schneider, A., Scholz, H. The influence of Adh function on ethanol preference and tolerance in adult Drosophila melanogaster. Chemical senses. 35, 813-822 (2010).
- Han, S., et al. Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence. American journal of human genetics. 93, 1027-1034 (2013).
- Lind, P. A., et al. A genomewide association study of nicotine and alcohol dependence in Australian and Dutch populations. Twin Res Hum Genet. 13, 10-29 (2010).
- Schuckit, M. A. Low level of response to alcohol as a predictor of future alcoholism. The American journal of psychiatry. 151, 184-189 (1994).
- Schuckit, M. A., Smith, T. L. An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects. Archives of general psychiatry. 53, 202-210 (1996).
- Tabakoff, B., Cornell, N., Hoffman, P. L.
- Chan, R. F., et al. Contrasting Influences of Drosophila white/mini-white on Ethanol Sensitivity in Two Different Behavioral Assays. Alcohol Clin Exp Res. 38, 1582-1593 (2014).
- Eddison, M., et al. arouser reveals a role for synapse number in the regulation of ethanol sensitivity. Neuron. 70, 979-990 (2011).
- Wen, T., Parrish, C. A., Xu, D., Wu, Q., Shen, P. Drosophila neuropeptide F and its receptor, NPFR1, define a signaling pathway that acutely modulates alcohol sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 2141-2146 (2005).
- Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcohol Clin Exp Res. 33, 1794-1805 (2009).
- Bhandari, P., et al. Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors in Drosophila, Caenorhabditis elegans and mice. Genes, brain, and behavior. 11, 387-397 (2012).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
- Chen, J., Wang, Y., Zhang, Y., Shen, P. Mutations in Bacchus reveal a tyramine-dependent nuclear regulator for acute ethanol sensitivity in Drosophila. Neuropharmacology. 67, 25-31 (2013).
- Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
- Maples, T., Rothenfluh, A. A simple way to measure ethanol sensitivity in flies. J Vis Exp. , e2541 (2011).
- Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, 199-211 (2006).
- Nohronha, A. Ch. 23. Neurobiology of Alcohol Dependence. 23, Elsevier. 467-495 (2014).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental gerontology. 46, 320-325 (2010).
- Martin, I., Grotewiel, M. S. Oxidative damage and age-related functional declines. Mechanisms of ageing and development. 127, 411-413 (2006).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Acute ethanol responses in Drosophila are sexually dimorphic. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 21087-21092 (2012).
