Abstract
Difetti Locomotive derivanti da malattie neurodegenerative possono essere un sintomo di esordio tardivo della malattia, dopo anni di degenerazione subclinica, e quindi attuali strategie di trattamento terapeutico non sono curativi. Attraverso l'uso di sequenziamento exome, un numero crescente di geni sono stati identificati per giocare un ruolo nella locomozione umana. Nonostante l'identificazione di questi geni, non è noto come questi geni sono essenziali al funzionamento normale locomotiva. Pertanto, un test affidabile, che utilizza organismi modello per chiarire il ruolo di questi geni per identificare nuovi bersagli di interesse terapeutico, è necessaria più che mai. Abbiamo progettato una versione sensibilizzata del test geotassi negativi che consente il rilevamento di difetti lievi anteriore e ha la capacità di valutare questi difetti nel tempo. Il saggio viene eseguito in un cilindro graduato in vetro, che è sigillato con un film barriera di cera. Aumentando la distanza limite ad essere scalata a 17,5 cm ed aumentando la durata dell'esperimento per 2 min abbiamo osservato una maggiore sensibilità nella rilevazione disfunzioni mobilità lievi. Il test è conveniente e non richiede una formazione completa per ottenere risultati altamente riproducibili. Questo lo rende una tecnica eccellente per lo screening candidati farmaci in mutanti di Drosophila con difetti di locomozione.
Introduction
Malattie neurodegenerative devastanti come il morbo di Parkinson, la sclerosi laterale amiotrofica, e paraplegia spastica ereditaria sono sempre più riconosciuti. Sfortunatamente, la maggior parte di questi disturbi neurodegenerativi sono ancora senza trattamenti. L'uso clinico diffuso di test genetici, imparziali genoma come il sequenziamento dell'esoma ha portato ad un numero sempre maggiore di geni di essere coinvolto in disturbi locomotiva umani. Nonostante questi progressi, la progressione patologica dalla mattina presto alla fase avanzata, rimane inafferrabile in questi disturbi. Drosophila fornisce uno con gli strumenti genetici per lo studio requisito gene in modo spaziale e temporale controllato. Inoltre, Drosophila è dimostrato utile nello screening farmaci per malattie neurologiche come il Parkinson 1, il morbo di Alzheimer 2, ritardo mentale ed epilessia 3,4 5,6 tra gli altri. Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un costo effettivoe il dosaggio affidabile che permetta di alta analisi rendimento che sarebbe ancora abbastanza sensibile per rilevare piccole variazioni nelle prestazioni del motore.
Ci sono diversi test utilizzati per quantificare gli effetti di mutazione genetica e / o le condizioni ambientali sul comportamento arrampicata Drosophila. La maggior parte dei saggi capitalizzare la naturale tendenza di mosche da scalare, noti come geotassi negativi, o il saggio arrampicata. Benzer 7 suggerito nel 1967 che l'apparato controcorrente utilizzato per lo studio di fototassi potrebbe anche essere usato per studiare gravitaxis. Da allora, Ganetsky 8 e molti altri 9 -12 hanno costruito sul dosaggio iniziale. Il principio è quello di mettere un numero noto di mosche in una fiala e toccare la fiala fortemente contro una superficie dura, causando linea a cadere sul fondo della fiala. Dato che è un comportamento innato, linea tenteranno di salire fino alla cima del flaconcino, al contrario di gravità. Questo test è quantitativa e measures quanti mosche sono saliti oltre un marcatore sul flacone nel corso di un periodo di tempo assegnato. Misurazione della velocità invece del numero totale di mosche arrampicata è diventata un parametro affidabile e mostrato difetti nei casi in cui il numero dei criteri mosche non era significativo 13.
Il dosaggio arrampicata è dimostrata utile nello studio di molte malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson 14. Tuttavia, abbiamo notato che i difetti locomotiva non deve essere rilevabile al momento in cui la neurodegenerazione è già visto in studi patologici 14. Pertanto, l'uso del test tradizionale può limitare la capacità di studiare le prime fasi della patogenesi della malattia. La comparsa di difetti locomotiva durante le fasi successive di patologia può riflettere una malattia la cui progressione è troppo avanzato per la completa salvataggio.
Ciò solleva un potenziale problema con la sensibilità del tradizionale test arrampicata. Il potenziale incapacità del tradizionale arrampicata test di rilevare difetti locomotiva lievi può essere attribuito alla quota alla quale linea devono salire. Le tradizionali misure assay 15,16 il numero di mosche a salire con successo su un'altezza di 2 a 5 cm di 10 a 20 sec.
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Protocol
La ricerca sulle Drosophila melanogaster era conforme con l'Università di linee di ricerca di Alberta.
1. Fly Collection
- Raccogliere 20 mosche con CO 2 (g), anestesia e posto in una fiala di raccolta 25 millimetri x 95 millimetri contenente cibo.
- Fiale magazzini contenenti mosche orizzontalmente per evitare di intrappolare le mosche in liquidi che possono accumularsi sul fondo della fiala.
- Incubare mosche per almeno 21 ore a 22 ° C a 45% di umidità in un incubatore per circa per 15 h. Impostare l'incubatore con una luce 12 ore: ciclo scuro.
2. Arrampicata Assay
- La mattina seguente, il trasferimento di 20 mosche da una singola fiala in un bicchiere da 250 ml cilindro graduato. Segnare la posizione del cilindro per mantenere costante quotidiana. Utilizzare un cilindro di vetro per il genotipo per evitare la contaminazione incrociata tra i genotipi. Lavarsi alla fine di ogni esperimento e roli tate tra genotipi.
- Condurre gli esperimenti in luce ambiente (o la luce rossa se esiste un potenziale difetto visivo) rispettivamente a temperatura e umidità di 22 ° C e 40%. Per evitare di confondere circadiano ritmo, sempre esperimenti alla stessa ora del giorno.
- Chiudere la parte superiore del cilindro con un film barriera (strato di cera) per evitare fuoriuscite di linea (Figura 2).
- Impostare la videocamera su un treppiede. Fotocamera Focus sulla linea di 190 ml dei 250 ml cilindro graduato (17.5 cm).
- Contare il numero di mosche morte sul fondo del cilindro e nelle fiale alimentari. Registrare questo numero come la mortalità.
- Molto battere leggermente il cilindro contro un tappetino in gomma a cellule chiuse ripetutamente con forza sufficiente a spostare le mosche per la superficie inferiore interna. Toccare 5-10 volte, mentre con l'altra mano per premere registrare sulla fotocamera.
- Premere il pulsante "Record" sulla fotocamera.
- Avviare il video registrazione della videocamera e toccare il cilindro sei volte in un modello non ritmico distinti.
- Condurre ogni prova per 2 minuti dal momento in cui le mosche sono ultimo sfruttato e registrare il numero di mosche che attraversano l'altezza di 17,5 cm (190 ml) per ogni punto temporale prescelto (quantificare ogni 10 sec). Nota: La marcatura sul cilindro ml varierà da un cilindro modello all'altro a seconda del diametro. Per evitare errori, misurare l'altezza di ogni cilindro utilizzato.
- Una volta che il processo è terminato, disporre di mosche in etanolo al 95%.
- Ripetere i passaggi 2,1-2,9 fino a quando tutte le repliche sono stati testati con mosche freschi ogni volta.
Nota: Anche se 5 repliche possono essere sufficiente con una mutazione che ha un forte effetto sulla locomozione, 10 replicati biologici di 20 mosche (200 mosche) si consiglia di rilevare le differenze più piccole. - Al termine dell'esperimento, lavare i cilindri in lavastoviglie laboratorio e O secco / N per essere riutilizzato.
3. Analisi
- Analyvideo ze di ogni volano prova. Ogni 10 secondi, registrare il numero totale di mosche che passano la linea di tiro.
- Se una mosca si arrampica indietro o scende, record che volano come -1 e contare il prossimo volo per attraversare la linea di destinazione come lo stesso numero del volo che è risalito verso il basso o è caduto. Ad esempio, se il 15 fly scende al di sotto della linea di tiro, il prossimo volo per attraversare la linea (16 th volano) è considerato il 15 ° volo e non 16 °.
- Sottrarre mortalità dal numero totale di linea (20) per ottenere il numero di mosche che rimangono nel processo. Ad ogni punto di tempo, ottenere la frazione di mosche sopra la linea di destinazione.
- Tracciare ogni percentuale in ogni momento (vedi figura 3).
- Analizzare le prestazioni al punto dati 120 secondi ed eseguire studente t-test quando sono presenti 2 gruppi o ANOVA e post-test per confronti multipli (con modifica Bonferroni per pianificati e non pianificati Tukey per comparisons). Il Kolmogorov-Smirnov test 17 viene eseguita per l'accertamento normalità e varianza uguale ma anche per confrontare le distribuzioni del gruppo mutante al controllo.
- Per presentare i dati su invecchiamento, tracciare la percentuale di mosche arrampicata a 120 secondi con le mosche di età diverse (2 giorni, 1 settimana, 2 settimane) per vedere se c'è un deficit progressivo (Figura 4).
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Representative Results
L'arrampicata è un comportamento forte e riproducibile. Infatti, un giorno di vita in linea wild-type di raggiungere le prestazioni arrampicata distanza del bersaglio in rapido (25 - 30 sec). Mosche mutanti presentano una serie di prestazioni da lieve (o ritardato) per completare l'incapacità di salire al bersaglio. Illustriamo questo qui con due diversi alleli mutanti. Il primo è una grave allele del gene spastin causata da una delezione completa del gene spastin (terme 5,75) 18. In questa linea (terme 5,75 con TM6b) un giorno di vita in linea non raggiungono prestazioni arrampicata WT anche dopo 2 min. Questa linea mutante presenta gravi difetti, anche quando si utilizza il metodo flacone (Figura 1A, B). Il vantaggio del metodo presentato qui diviene più evidente quando si studia un mutante per lo stesso gene, ma con una delezione incompleta pubblicato dallo stesso gruppo (terme 17-7 con TM3) 18. In tal caso, le prestazioni fino a 8 giorni è normale (Figura 1C-F (figura 3) o interazione genetica. Per ulteriore prova, includere salvataggio del fenotipo comportamentale con l'espressione di una proteina wild-type per il gene studiato. Per gli studi di interazione, confrontare le mosche che sono eterozigoti per entrambe le mutazioni di interesse con le mosche che hanno solo una mutazione di interesse. Il test permette anche di monitorare la progressione del difetto arrampicata nel tempo, un aspetto importante nel modellare disturbi locomotori progressive (Figura 4). Inoltre, 2 min consentono di vedere meglio la progressione di salire in mutanti gravi.
Figura 1. Confronto tra diversi dosaggi di arrampicata. Per gravi mutazioni diversi gradi di difetto arrampicata possono essere visti utilizzando diversi metodi, ma le mutazioni più lievi può non essere rilevato con alcuni saggi. Per dimostrare questo abbiamo utilizzato due linee mutanti pubblicate per la spastin gene:. Spastin 5-75, che contiene una delezione completa del gene spastin e spastin 17-7 che contiene una parziale delezione del gene spastin (A) In primo luogo, l'arrampicata è valutata avendo mosche salire fino alla cima di un alimento fiala vuota. Viene registrato il numero di mosche in alto dopo 18 secondi. Usando questo protocollo un difetto significativo è visto in Spast 5-75 / TM6b rispetto ai controlli wild-type (N = 10, p <0.001). (B) Successivamente, arrampicata prestazioni è valutato con il metodo descritto qui. Arrampicata è anche d efective nello stesso genotipo Spast 5-75 / TM6b. La differenza di prestazioni è altamente significativa (N = 5, p <0.001), ma la differenza di prestazioni è più grande. Per mutazioni dimostrato di avere minore pensiero effetto (ad esempio, Spast 17-7 contiene una delezione parziale del gene spastin), il metodo del cilindro presentato qui può essere più sensibile. (C) nessun difetto significativo è stato osservato con 3 giorni di età spast 17-7 / TM3 con il metodo fiala (N = 5). (D) nessun difetto significativo è stato osservato con 3 giorni spast 17-7 / TM3 con il metodo cilindro (N = 5). (E) Una tendenza non statistica è notato con 8 giorni spast 17-7 / TM3 vola (N = 5). (F) Ma un significato è osservato per 8 giorni spast 17-7 / TM3 testati con il metodo cilindri presentato per lo stesso numero di repliche (N = 5, p <0.001).rget = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Rappresentazione schematica della sperimentale istituito. 20 mosche sono inseriti in un cilindro di vetro e poi ricoperti con un film barriera di cera. Le mosche sono poi sfruttato fino in fondo e il numero di mosche che attraversano la linea mediana viene registrato con una fotocamera per 120 sec. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Risultati rappresentativi dell'esperimento arrampicata. La percentuale di mosche dopo aver superato la linea di soglia è rappresentata ogni 10 sec negli duratisulla del dosaggio. In questo esperimento, 3 controlli geneticamente adeguati (wild-type, UAS terme -RNAi / +, ELAV-GAL4 / +) sono confrontati con le mosche transgeniche contenenti sia UAS e componenti GAL4 (spa Elav-GAL4 / UAS -RNAi). Il UAS terme-RNAi è da VDRC # 108739. Questa rappresentazione permette per la valutazione del tasso di arrampicata per ogni genotipo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. grafico rappresentante per il profilo di invecchiamento. Poiché molti disturbi locomotori sono progressivi, è importante per ritrarre l'evoluzione nel tempo. In questo grafico, le mosche WT sono confrontati con i mutanti eterozigoti (terme / WT) e mutanti trans-eterozigoti (spast5-75 / spast17-7) a 2 giorni (A) e 8 giorni (B)(N = 10, p <0.001). I risultati sono anche descritti nel tempo per il 120 sec. punto di tempo (C). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Drosophila ha già dimostrato di essere un ottimo modello di malattia 14 e altre malattie neurodegenerative 1,2 di Parkinson. Oltre agli strumenti genetici disponibili in Drosophila, suo genoma è altamente conservata per geni coinvolti nei disordini neurologici 19. L'avvento di ampi metodi di screening genetico genoma (compresi sequenziamento dell'intero esoma) è probabile che continuerà a fornire una più grande lista di geni candidati associati con disturbi del movimento umano. Lo sviluppo di trattamenti per queste condizioni richiede modelli animali per aumentare la nostra comprensione della patologia coinvolti nelle prime fasi della neurodegenerazione. L'uso della Drosophila e test geotassi negativo fornisce un metodo economico e affidabile per identificare i geni coinvolti nei difetti della locomotiva e successivamente lo screening candidati farmaci per fenotipo salvataggio. Questo si aggiunge alla molecolari, elettrofisiologici e Prove di imaging tcappello può anche essere ottenuto nello stesso modello animale. Usando il test di arrampicata, altri hanno riprodotto con successo i difetti del motore in linea mutanti per i geni che perturbano locomozione umana. Tuttavia, la ricerca precedente ha dimostrato che i cambiamenti patologici potrebbe precedere il rilevamento di difetti locomotiva di parecchi giorni 14. Questo fenomeno si osserva anche in condizioni neurodegenerative in cui si parla di cambiamenti subcliniche. Noi crediamo che attraverso la comprensione e quindi il trattamento di questi cambiamenti subcliniche, modifica la malattia sarebbe migliorata notevolmente.
Vi presentiamo qui un modello che permette il rilevamento di difetti locomozione lievi che possono aiutare a capire il passaggio dalla "presintomatica a sintomatici" di patologia neurodegenerativa utilizzando un modello di Drosophila. Molti gruppi hanno utilizzato una breve distanza di arrampicata (5-10 cm), ma, abbiamo aumentato la distanza di 17,5 centimetri come Palladino et al. 20. Sebbene questa differenzatra altezze arrampicata possono sembrare minori, l'aumento in altezza intendeva aumentare la difficoltà dosaggio, facilitando così l'identificazione dei difetti arrampicata relativamente minori. Inoltre, alcuni metodi scelto per illuminare la parte superiore del cilindro con una lampada a fibre ottiche, per sfruttare la risposta phototaxic di adulti Drosophila. Tuttavia, la sorgente luminosa può causare riflessione della luce all'interno del cilindro; quindi, una sorgente di luce fluorescente ambientale diffuso viene utilizzato in sostituzione. Inoltre, la mutazione nei geni coinvolti nella neurodegenerazione può influenzare la funzione degli occhi e quindi BiAS i risultati. L'aumento delle dimensioni del campione da 10 a 20 in linea aumenta la potenza statistica di ogni prova. Inizialmente, abbiamo aumentato il numero ad un massimo di 30 mosche, ma è stato successivamente ridotto in modo da minimizzare gli effetti di sovraffollamento e di interazione tra le mosche. I campioni vengono scartati dopo un singolo uso, piuttosto che essere una durata di quattro prove ripetute per campione, per eliminare il possibilità di apprendimento o stanchezza. A causa di mosche con estremamente scarso rendimento arrampicata, era controproducente per registrare il tempo necessario per il 50% delle mosche di attraversare la linea di tiro per esso potrebbe richiedere una considerevole quantità di tempo per questo criterio da rispettare. Piuttosto, le mosche hanno avuto una durata di 2 minuti per attraversare la linea di tiro. Il numero di mosche per attraversare la linea è stata registrata e cestinate in incrementi di 10s, e il valore risultante espresso in percentuale.
Queste condizioni creano sono una valutazione più sensibile della capacità di arrampicata di un mosca adulta. Mentre altri disegni del test sono ancora utili, questo paradigma può essere considerato in casi in cui sono indagati miti primi difetti. Inoltre, questo test può aiutare a rilevare i cambiamenti minori nel contesto delle sperimentazioni di farmaci.
Un aspetto importante è che il comportamento negativo geotassi si basa sulla linea essendo sfruttato al fondo del cilindro. È therefORE importante valutare altre forme di locomozione, come su una superficie piana o fuga. Altri aspetti come la motivazione e l'interazione sociale devono essere considerati come potenziale confondente. Un altro avvertimento è che il saggio presentato consente a un solo di valutare locomozione in mosche adulte. Ciò limita la possibilità di ottenere correlati neuropatologiche per il comportamento osservato che è molto importante per comprendere la patogenesi della malattia. In effetti, la maggior parte opera neuroimaging è stato fatto alla giunzione neuromuscolare larva finora in Drosophila. Ottenere il comportamento locomozione in larva può essere un passo importante per attirare correlazione diretta tra il comportamento e alterazioni patologiche.
E 'molto importante controllare la temperatura e l'umidità in cui le mosche sono sollevate e testati. In aggiunta all'effetto sullo sviluppo fly, questi fattori hanno avuto un effetto importante sul di salita di mosche sollevate e immagazzinati in condizioni non ideali. Nella pRESENZA di un aumento di elettricità statica o di umidità, le mosche non ha effettuato in modo ottimale. Questo effetto non è uguale per tutti i genotipi, mutante mosche solito essere più influenzata da fattori rispetto ai controlli. Inoltre, i cilindri devono essere lavati e asciugati correttamente tra ogni esperimento.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila stocks | The stocks are selected depending on the experiments. The temperature and humidity in the room and in the incubator must be controled and consistent to avoid flies being too staticky or too wet. | ||
| Video camera | Any digital camcorder will do. Make sure they can focus on close object. | ||
| Graduated cylinder | Kimble | 20028W | Different models of graduated cylinder may have different diameter. It is therefore imporant to measure the height. |
| Computer | Any model will do. We used the computer to monitor the climbing of the flies and record the number of flies at each time point. |
References
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