Introduction
Tests auf Zellbasis ein wichtiges Instrument für die Entwicklung und Entdeckung neuer Antikrebsmittel. 1,2 Historisch Schichtkulturen von Krebszellen verwendet worden, um die Wirksamkeit von Testverbindungen gegen bestimmte Typen von Krebszellen zu untersuchen. Die Wartungsfreundlichkeit der Monolayer-Kulturen in Standardkulturplatten, die Kompatibilität der Standardplatten mit handelsüblichen Roboter-Tools für die Zugabe von Reagenzien und mit Screening-Geräte für nachgeschaltete Analyse der zellulären Reaktionen auf chemische Verbindungen sind die wichtigsten Vorteile, die 2D-Kulturen ein attraktives Werkzeug machen für Drogentests. 3 Leider Monolayer-Zellassays häufig nicht die Wirksamkeit der Verbindungen in vivo vorherzusagen, so dass der Arzneimittelentwicklung und Entdeckung eine sehr kostspieliges Verfahren. 4,5 Trotz erheblicher Investitionen und Anstrengungen von Pharmaunternehmen und akademischen Einheiten nur ~ 1% von Anti-Krebs-Medikamente in klinischen Studien genehmigtvon der FDA in den letzten zwei Jahrzehnten. 6 Ungleichheit zwischen 2D Kulturen und der komplexen 3D-Umgebung von Krebszellen in vivo ist ein Hauptnachteil der Monolayer-Kultur-Systeme. 7 daher Screening von Kandidatenverbindungen gegen Tumorzellen in einer Umgebung, die mehr ähnelt die 3D-Tumorumgebung kann die Entwicklung neuer Chemotherapeutika beschleunigen. 8
Krebszell Sphäroide ein den entsprechenden 3D Tumormodell in vitro. 9,10 Sphäroide kompakte Cluster, die durch spontane oder induzierte Anordnung von Krebszellen auf nicht-adhärenten Oberflächen oder in Suspension unter Verwendung von Techniken wie Rotationskolben, Flüssigkeitslagerung, mikrofabrizierten mikro bilden . auch Arrays, Mikrofluidik und hängenden Tropfen 11-16 Spheroids nachahmen Merkmale von soliden Tumoren wie Geometrie und begrenzte Transport von Sauerstoff, Nährstoffen und Wirkstoffen für Arzneimittel in der zentralen Zone; damit sie enger Medikament Verant regenerierense von soliden Tumoren im Vergleich zu Monolayer-Kulturen. 17-19 Trotz dieser deutlichen Vorteil, Sphäroiden nicht routinemäßig für das Screening von chemischen Verbindungen gegen Krebszellen eingesetzt. Schwierigkeit, einheitliche Größe Sphäroiden in einer Standard-Hochdurchsatz-Einstellung, die mit handelsüblichen Robotertechnik und Screening / Imaging-Tools kompatibel ist behindert Einbeziehung der Sphäroid-Kultur in die Entwicklungspipeline. Obwohl benutzerdefinierte Materialien und Platten wurden vor kurzem im Handel erhältlich sein, um diesem Bedarf zu begegnen, aus Kostengründen abschrecken ihren weit verbreiteten Einsatz.
Beide Ansätze erfordern zwei Haupttechniken mit der Fähigkeit zur Herstellung von konsistenten großen Sphäroide in hohem Durchsatz verwendet eine neue Hängetropfen Plattform und mikrofabrizierte Mikrovertiefungen. 13,16,20 jedoch spezielle Platten und Vorrichtungen, die in der Herstellung teuer und unbequem für den Endpoint sind in Kernforschungszentren und der pharmazeutischen Industrie, wo die meisten großen efForts für die Entdeckung von neuen Antikrebsmitteln vorgenommen. Trotz einiger Verbesserungen in der Stabilität der Zellen enthaltende Tropfen mit einem aktuellen Design der hängenden Tropfen Platten wird nur jedes zweite Loch der Platte noch während der Kultur verwendet werden, um die Verbreitung / Zusammenführen von Tropfen zu vermeiden. 16 Diese Versuchsdurchsatz deutlich abnimmt. Drogenabhängigkeit und der Erneuerung ist schwierig, mit manueller oder Roboter Pipettieren und Sphäroiden müssen in eine Standard-Platte für die biochemische Analyse übertragen werden, da diese Platte-Konfiguration ist nur schwer mit der herkömmlichen Screening-Geräte wie Plattenreadern. 21 Mikrobohrungen mittels Softlithographie auch hergestellt eine kontrollierte Größe Sphäroid Produktion. 13,20 Aber Unvereinbarkeit dieser Plattform mit Standard Pipettierwerkzeugen verhindert Behandlung einzelner Kügelchen mit verschiedenen Arzneimittelverbindungen / Konzentrationen, was allen Kügelchen nach einer einzigen Behandlung Zustand. Somit ist dieses Verfahren nicht für HochfallsDurchsatz Screening von Verbindungen, die eine gleichzeitige Prüfung mehrerer Verbindungen / Konzentration erfordert.
Um diese Hindernisse zu überwinden, wurde eine neue Technik für die Hochdurchsatzproduktion von gleichbleibend große Krebszelle Sphäroiden in Standard-96-Well-Platten entwickelt. 22,23 Der Ansatz basiert auf einem polymeren wässrigen Zweiphasensystem (ATPS) mit Polyethylenglykol (basierend PEG) und Dextran (DEX) als phasenbildende Polymere. 24 ATPS wurden kürzlich in einer Reihe von neuartigen zellbiologische Anwendungen Zelle Mikrostrukturierung erlauben 25-32 verwendet und die lokalisierte Verabreichung von biologischen Reagenzien auf Zellen, die in wässrigen Medien sehr worden. Um ein Formular Sphäroid, sind Krebszellen mit der wässrigen Phase DEX und Untermikroliter-Tropfen der erhaltenen Suspension gemischt wird in eine Vertiefung, die die Eintauchphase wässrige PEG-Lösung pipettiert. Der Tropfen bleibt mischbaren dem Eintauchphase und beschränkt Zellen zur Bildung eines Sphäroids erleichtern. Koboldortantly stellt die stark wässrigen Eintauchphase Nährstoffe zu den Zellen des Sphäroids und das bekannte Problem der Medien Verdampfen gemeinsam zu anderen Assays, die Veränderungen in der Medien Osmolalität und Schwankungen der Wirkstoffkonzentrationen verursacht minimiert. Diese Technik ermöglicht die Produktion Sphäroid und medikamentöse Behandlung nur mit im Handel erhältlichen Reagenzien und Pipettierwerkzeugen in Standard-96-Well-Platten. Wichtig ist, dass Analyse der zellulären Reaktionen von Sphäroiden in der gleichen Platte mit Standard-biochemische Tests und Plattenlesegeräte durchgeführt. Die Leichtigkeit der Arbeit mit ATPS und Anpassungsfähigkeit der Ansatz zur Roboter Liquid Handling ermöglicht Hochdurchsatz-Generation sowohl Monokultur und Co-Kultur Sphäroide eine einfache Labortechnik. Dieser neue Ansatz wird ein wichtiger Schritt in Richtung Integration der Krebszelle Sphäroiden in der Arzneimittelentwicklung und Discovery-Prozesse mit verbesserter Testdurchsatz und Wirtschaftlichkeit (zunehmende Zahl von getesteten Verbindungen und redu seinced Reagenzienverbrauch) und Effizienz (Verringerung der Hands-on-Zeit).
Ein detailliertes Protokoll für Roboter Herstellung von Krebszell Sphäroide in 96-Well-Platten unter Verwendung des ATPS Ansatz wird nachstehend beschrieben. Zusätzlich werden Details der medikamentösen Behandlung der resultierenden Kügelchen und nachgeschaltete Analyse der zellulären Reaktionen unter Verwendung eines kommerziellen biochemischen Test dargestellt.
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Protocol
1. Herstellung der Polymer wässrigen Zweiphasensystem (ATPS)
- Wiege 0,5 g Polyethylenglykol (PEG) (Molekulargewicht: 35.000) und 9,5 ml komplettem Wachstumsmedium hinzufügen, in einem sterilen konischen 15 ml bis 10 ml von 5% herzustellen (w / v) wässrigen PEG-Phase.
Anmerkung: Das Hinzufügen der Hälfte des Mediums mit dem ersten durch Zugabe des Polymers und anschließend konisch dann wird die verbleibende Menge des Mediums minimiert Adhäsion des Polymers an den konischen Wänden und hilft das Polymer lösen sich schneller auf. - Man wiegt 0,128 g Dextran (DEX) (MW: 500.000), um sie 0,872 ml komplettem Wachstumsmedium hinzuzufügen in einem sterilen 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, um 1 ml von 12,8% (w / v) wässrigen DEX Phase herzustellen.
- Vortex sowohl Lösungen für etwa 1 min, um die Polymere in dem Medium zu lösen.
- Halten beide Lösungen in einem Wasserbad bei 37 ° C für 1 Stunde, um die Auflösung und homogene Mischungen zu gewährleisten. Halten der Kappen oberhalb des Wasserspiegels, um die Möglichkeit einer Kontamination der Lösungen aus dem Bad zu vermeidenWasser.
- Laden Sie die PEG-Phase-Lösung in einem sterilen, Kunststoffspritze und führt es durch einen Spritzenfilter von 0,2 um Porengröße, um Verunreinigungen zu entfernen.
Hinweis: Füllen Sie die Spritze mit der PEG-Lösung, legen Sie sie in den Einsatz des Filters auf einem konischen Rohr und mit Gewalt, langsam schieben Sie die Lösung durch den Filter. Es ist normal, um den Widerstand gegen eine Bewegung des Spritzenkolbens auftreten. Geringen Verlust der Polymerlösung tritt als etwas von der Lösung im Filter bleibt, sondern die Polymerkonzentration nicht ändert. - Je 10 ul der DEX Phasenlösung und verdünnen Sie es in 10 ul Medium in einem separaten Röhrchen in 6,4% (w / v) DEX Phasenlösung führen. Aspirat 100 ul der PEG-Phase-Lösung und darauf verzichten, in einer Petrischale.
- Verzichtet werden 0,5 ul der 6,4% (w / v) DEX Phasenlösung in die PEG-Phase-Lösung. Überprüfen Sie optisch erfolgreiche ATPS Bildung durch Beobachten einer DEX Tropfen unter dem Mikroskop. Der Rückgang Grenzesollten sichtbar bleiben, die das Vorhandensein von zwei stabilen, separate Wasserphasen.
- Bewahren Sie die Lager wässrige PEG und DEX Phasen Lösungen in 4 ° C bis zur Verwendung.
Hinweis: Es wird empfohlen, Polymerlösungen werden frisch vor jedem Experiment vorbereitet und innerhalb von 24 Stunden der Lagerung.
2. Vorbereitung für den Druck von Cancer Cell Spheroids
- Wachsen die Krebszellen von Interesse (zB, MDA-MB-157-Brustkrebszellen) zu einer 90% -100% konfluenten Monolayer. MDA-MB-157-Zellen, mit einem Medium aus DMEM, enthaltend 10% FBS, 1% Glutamin und 1% Antibiotikum besteht.
- Ernten Sie die Zellen mit Hilfe eines Zelldissoziationspuffer (nach Herstellerprotokoll) und laden Sie die Suspension in einen konischen 15 ml. Zentrifugieren Sie es für 5 min bei 173,3 × g, zu entfernen Überstand und resuspendieren Zellen in 1 ml vollständigem Wachstumsmedium.
- Wägezellen auf einem Hämozytometer und zählen Sie die erforderliche Anzahl berechnenvon Zellen für eine gewünschte Sphäroid Zelldichte. Eine konfluente Monoschicht von MDA-MB-157-Zellen in einer T75-Flasche gezüchtet gibt üblicherweise ~ 7 × 10 6 Zellen.
Anmerkung:. Pro 0,3 & mgr; DEX Phase Abfall Erforderliche Zelldichte für ein Tropfenvolumen zu erzeugen, eine einzelne Sphäroid wird auf dem Zelltyp abhängen 22 beispielsweise eine Dichte von 1,5 x 10 4 oder größer für MDA-MB-157-Zellen empfohlen sicherzustellen Bildung eines einzigen Sphäroid. - Zentrifuge Zellen ein zweites Mal 5 Minuten lang bei 173,3 x g und Resuspendieren in einer geeigneten Volumen an Wachstumsmedium, um die Suspension auf einen gewünschten Zelldichte zu konzentrieren.
Hinweis: Wenn beispielsweise 7 x 10 6 Tumorzellen wurden geerntet, das Gesamtvolumen der erforderlich ist, um ein Sphäroid von 1,5 x 10 4 Zellen in einer Dichte von 0,3 & mgr; DEX Phase Tropfen bilden Zellsuspension werden 140 & mgr; l sein. Jedoch wegen der Verdünnung mit dem DEX Phasenlösung in dem nächsten Schritt, verwenden nur 70 & mgr; l Zellkulturmedium, um Zellen zu resuspendieren. - Die Zellsuspension gründlich zu mischen, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen und Vermischung von DEX-Lösung zu gewährleisten. Auf- und Abpipettieren sollte vorsichtig durchgeführt werden, um eine Blasenbildung zu verhindern.
3. Vorbereitung für den Druck von Co-kultiviert Spheroids
- Wachsen die Krebszellen (beispielsweise MDA-MB-157 menschlicher Brustkrebszellen) und Stützzellen (zB menschliche Fibroblasten) in eine 90% -100% konfluenten Monolayer. Ernten jeden Zelltyp mit einem Zelldissoziationspuffer (gemäß dem Herstellerprotokoll).
- Legen Sie jede Suspension in eine 15 ml konischen, zentrifugieren 5 min bei 173,3 × g, und saugen Stand aus jeder konisch. Die Zellen jeder Kegel in 1 ml vollständigen growth Medium.
Anmerkung: Fluoreszierende Farbstoffe wie Calcein AM (Lebendzell Färbung) und Kern Farbstoffe (Hoechst) verwendet, um die zwei Zelltypen unterschieden werden.
- Legen Sie jede Suspension in eine 15 ml konischen, zentrifugieren 5 min bei 173,3 × g, und saugen Stand aus jeder konisch. Die Zellen jeder Kegel in 1 ml vollständigen growth Medium.
- Legen jeder Zelltyp separat auf einem Hämozytometer gezählt und auf die erforderliche Anzahl von einzelnen Zelltyp für ein gewünschtes Verhältnis von Krebszellen gegenüber Stützzellen cokultiviert Sphäroide berechnen. Konfluente Monoschichten von MDA-MB-157-Zellen und Fibroblasten in T75-Flaschen gezüchtet geben üblicherweise ~ 7 x 10 6 und ~ 6 x 10 6 Zellen.
- Füge das richtige Volumen aus der Suspension von Stützzellen, Krebszellen-Suspension, um ein gewünschtes Verhältnis der Anzahl von zwei Zelltypen ergeben. Beispielsweise verwenden die ein Verhältnis von 50 Krebszellen 1 Fibroblastenzellinie.
- Zentrifuge der konische enthaltend das gemischte Zellsuspension für 5 min bei 173,3 xg und Zellen in einem geeigneten Volumen an Enddichte ergeben, bestehend aus gleichen Volumen des Wachstumsmediums und der 12,8% (w / v) wässrigen DEXPhasenlösung (1.2) hergestellt.
- Pipette vorsichtig die resultierende Zellsuspension nach oben und unten, um die Homogenität der Suspension zu gewährleisten.
4. Drucken von Tumorsphäroide in eine 96-Well-Platte
- Einen Tag vor Versuchsmantel nichtbehandelten Rundbodenplatten mit 96 Vertiefungen mit 1% (w / v) Pluronic bei 37 ° C für 24 Stunden. Diese Beschichtung verhindert, dass die Zellhaftung über die Kulturdauer.
- Geben Sie 50 & mgr; l des gefilterten 5% (w / v) wässrigen PEG-Phase in jeder Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen (Zielscheibe).
- Mit einer Pipette mischen die Zellsuspension (in Schritt 2 oder 3 für die Mono- und Co-Kultur bzw. vorbereitet) und fügen Sie 20 ul der Suspension zu jedem anderen auch von einer Spalte einer 384-Well-Platte (Source-Platte) .
- Schalten Sie den Liquid Handler und "Heimat" der Pipettierkopf Koordinaten registrieren. Dann kompilieren Sie eine zuvor definierte Protokoll (unten in 4.6), um sicherzustellen, Laborgeräte und Parameter richtig definiertly. Diese "Homing" Schritt kann für verschiedene flüssige Handlern können.
Anmerkung: Die Strömung des Protokolls gezeigten Schritt-für-Schritt nachfolgend 4.6, wird ähnliche unabhängig von der verwendeten Roboter-Flüssigkeitshandhabungsgerätes ist; jedoch kann die Programmierschnittstelle abweichen aufgrund der Verwendung unterschiedlicher Software. - Legen Sie die Quellplatte, die Zielscheibe und Pipettenspitze Boxen an definierten Positionen auf der Arbeitsstation des Liquid Handler wie in Abbildung 1 dargestellt.
- Führen Sie das Protokoll, das die folgenden Schritte beinhaltet:
- Laden Sie eine Spalte der Fässer aus dem Pipettieren Leiter der Liquid Handler mit Mischpipettenspitzen (8 Tipps) von der Arbeitsstation (Abbildung 1).
- Mischen der Zellsuspension in Vertiefungen der Quellenplatte (Abbildung 1). Wählen Sie ein Mischvolumen kleiner als der Zellsuspensionsvolumen in den Vertiefungen um eine Blasenbildung zu vermeiden.
- Werfen Sie Tipps in einen leeren Deponien Feld (Abbildung 1). Laden Sie eine Spalte der Fässer vom Pipettierkopf mit 10 ul Abgabe Pipettenspitzen (Abbildung 1).
- Aspirat 0,3 ul der Zellsuspension aus der Quellenplatte (1) in jede Pipettenspitze.
- Abgeben der Zellsuspension in die Vertiefungen in einer Spalte des Zielplatte (Abbildung 1). Verwenden eine Abgabehöhe von 0,5 mm und eine Abgabedurchflussrate von weniger als 1 l / s an.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.6.1 durch 4.6.6 bis die Spalte für Spalte Druck in den gesamten Zielplatte abgeschlossen ist.
- Die Ziel-Platte vorsichtig aus dem Workstation Oberfläche und legen Sie sie in einem feuchten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. Pflegen Sie die Platte waagerecht transportiert es in den Inkubator zu Aufbrechen von DEX Phasentropfen mit Zellen zu vermeiden.
- Die Platte für 24 Stunden, um die Aggregation von Zellen in ein Sphäroid im DEX Phasenausfall ermöglichen.
Beachten Sie, dass das folgende Protokoll ist für einen 4-Tages-medikamentöse Behandlung und umfasst eine Erneuerung mit frischen Droge für Tag 2. Es kann für andere Behandlungszeiten geändert werden.
- Überprüfen Sie optisch Sphäroidbildung in 96-Well-Platten nach 24 Stunden. Falls erforderlich, Bildquellen für die Messung der Größe der Kügelchen durch Mittelung der kleinsten und größten Durchmesser jedes Sphäroid.
- Bereiten Sie die Stammlösung eines gewünschten Wirkstoffs durch in einem Lösungsmittel vom Hersteller empfohlen bei einer vorbestimmten Löslichkeitskonzentration Auflösen. Beispielsweise lösen sich Cisplatin in Wasser bei 2 mg / ml.
Hinweis: Schützen Sie die Stammlösung des Arzneimittels von Licht, wenn das Medikament ist lichtempfindlich. - Mit der Verdünnungstechnik, bereiten verdünnten Wirkstoffkonzentrationen mit Zellkulturmedium aus dem im vorherigen Schritt hergestellte Standardlösung. Jede Verdünnung sollte zweimal die gewünschte Konzentration hergestellt werden. Dilution Verhältnisse werden je nach Ausgangsstoffkonzentration variiert und der gewünschten Arbeitskonzentrationen.
- Fügen Sie 50 ul der im vorherigen Schritt in jede Vertiefung vorbereitet Wirkstofflösung. Dies kann maschinell oder durch manuelles Pipettieren erfolgen.
Anmerkung: Jede Wirkstoffkonzentration wird in die Hälfte, um die gewünschte Konzentration von 50 & mgr; l wässrige PEG-Phase bereits in jeder Vertiefung zu verdünnen.- Verwenden Sphäroide aus zwei Spalten von einer 96-Well-Platte (n = 16) für jede Konzentration.
- In Kontrollvertiefungen, fügen nur 50 ul frischem Kulturmedium zu den vorhandenen 50 ul der wässrigen Phase PEG.
- Sphäroide Inkubieren mit dem Wirkstoff für 48 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2, vor Licht geschützt.
- Nach 48 Stunden Inkubation ansetzen Verdünnungen des Wirkstoffs in den gewünschten Konzentrationen und erneuern Medikament durch Zugabe von 50 & mgr; l frisches Medikamentenlösung in jede Vertiefung.
Hinweis: Die Wells die gewünschte Wirkstoffkonzentration enthalten bereits ab dem ersten Medikament tEHANDLUNG. Daher in dieser Erneuerungsphase wird jede Konzentration an die gewünschte Konzentration, da keine Verwässerungseffekte auftreten. - Sphäroide Inkubieren mit dem Arzneimittel für weitere 48 h bei 37 ° C und 5% CO 2, vor Licht geschützt.
6. Analyse der Zelllebensfähigkeit in Spheroids
- Nach 48 h Inkubation mit erneuter Arzneimittel (dh, die Gesamtzeit der Behandlung von Sphäroiden mit einem Medikament 4 Tage), messen die gesamte Volumen des Mediums in ein Well durch manuelles Pipettieren.
Hinweis: Typische Volumen in einer gut ist ~ 140 & mgr; l (eine geringe Abnahme erfolgt durch Verdampfung). - Berechnen des Volumens der Zelllebensfähigkeit Reagenz (zB Presto) als 10% ige Konzentration des gesamten Muldenvolumens. Füge diese Volumen Zellviabilität in jede Vertiefung.
Hinweis: Bei einer vorhandenen Medienvolumen von 140 & mgr; l in einer gut wird ein Volumen von 15,6 & mgr; erforderlich, um eine Konzentration von 10% des Gesamt auch geben. Dieser wird berechnet durchAufteilung des vorhandenen Medienvolumen von 9 (140 ul / 9 = 15,6 ul). - Die Platte mit der Lebensfähigkeit der Zellen Reagenz jeweils für 6 h bei 37 ° C zugegeben und vor Licht geschützt.
- Die Platte wird in einem Mikroplattenleser und lesen Sie das Fluoreszenzsignal bei 560 nm und 590 nm Anregungs- und Emissionswellenlängen auf.
- Die prozentuale Lebensfähigkeit von Zellen in Sphäroiden durch Normalisierung der Fluoreszenzsignal von behandelten Vertiefungen zu der Kontrollvertiefungen nach der Mittelung der Werte aus den gleichen Behandlungsbedingungen.
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Representative Results
Der Arbeitsplatz des Roboter Liquid Handler ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Pipettierkopf und alle in der Roboter-Druck von Sphäroiden in Abschnitt 4.6 verwendet Stationen sind beschriftet. Das Bild zeigt die Verwendung von zwei verschiedenen Stationen für Tipp-Boxen (eine Reihe von Tipps für das Mischen und den zweiten Satz zum Ansaugen / Abgeben von Zellsuspension-wässrigen DEX Phasengemisch). Die gesamte Einrichtung ist in einem Standard-biologischen Sicherheitswerkbank, um die Sterilität zu erhalten untergebracht. Abbildung 2 zeigt eine schematische Darstellung des Prozesses "Drucken" mit der wässrigen Zweiphasensystem. Eine Pipettenspitze mit der Zellsuspension in der wässrigen Phase DEX (blau, Musterphase) geladen wird in einem Rund Vertiefung einer 96-Well-Platte die wässrige PEG-Phase (Rosa, Eintauchphase), die abgesenkt werden, um seinen Inhalt in der Nähe verzichten die auch unten. Der resultierende DEX Phase Drop schränkt die Krebszellen von Dispergieren und fördert die Zell-Zell-Wechselwirkungen, die dazu führen,Aggregation von Zellen und Sphäroidbildung. Sphäroidbildung ist spontan und geschieht innerhalb von 24 h Inkubation, wie in dem Versuchsbild der Figur 2 gezeigt. In der Praxis wird diese Sphäroid Druck Spalte für Spalte in 96-Well-Platten durchgeführt. Nach Sphäroide zu bilden, wird Kulturmedium durch die direkte Zugabe von frischem Medium erneuert, Umwandeln des Zweiphasensystems auf einem einzigen wässrigen Phase. Dieser Übergang ist durch Reduzierung der Konzentration von PEG und DEX unterhalb eines für die Trennung von wässrigen PEG und DEX Phasen erforderliche Schwellenkonzentration.
Ausgeben von einem herkömmlichen Luftverdrängungs Pipetiermechanismus des Flüssigkeitshandhabungs wurde parametrisch optimierten und es wurde gefunden, daß ein Abgabehöhe von 0,5 mm, einer Abgabeströmungsrate von weniger als 1 l / s, gefolgt von Abgabe 0,2 ul vorgesaugt Luftvolumen erzeugt die konsequenteste Größe wässrigen DEX sinkt und damit Sphäroiden 3a dis 23 Abb.spielt die Verteilung des Durchmessers von 96 Kügelchen von einer Platte mit einem mittleren Durchmesser von 332 ± 31 & mgr; m. Die bisherigen Erfahrungen zeigen, dass diese Vorgehensweise erzeugt typischerweise Sphäroide mit 8% -10% Standardfehler um den mittleren Durchmesser. 3b zeigt die Frequenzverteilung der Durchmesser der kugelförmigen Körper der gleichen Platte wie in 3a zeigt, dass Messern normal verteilt sind.
Als nächstes wird das Potential dieser Ansatz für Screening von Verbindungen in Standard-96-Well-Platten und Analyse der zellulären Reaktionen in den gleichen Platten, ohne eine Notwendigkeit, Sphäroiden auf neue Platten übertragen wurde demonstriert. 4 zeigt eine dosisabhängige Untersuchung der Lebensfähigkeit von MDA -MB-157-Brustkrebszell Sphäroide mit einer klinischen Chemotherapeutikum Cisplatin behandelt. Arzneimittel behandelten und Kontroll Sphäroide wurden mit einem kommerziellen Presto Reagenz (Zellviabilität Reagenz) inkubiert. Enzymatisch aktive Zellen reduzierte die reagent und führte zu einer Veränderung der Materialfarbe und einer Verschiebung in der Fluoreszenzsignal. Die Verschiebung im Signal am größten mit lebenden Zellen (zB in Steuer Sphäroide). Die Lebensfähigkeit der Krebszellen in Sphäroide mit zunehmender Wirkstoffkonzentration von über 1 & mgr; M. Diese Prüfung führte zu einer 50% tödliche Dosis Droge Konzentration LD50 = 4,67 uM.
Das wässrige Zweiphasensystemtechnik für 3D Kultur ermöglicht die einfache Herstellung von realistischeren Tumormodellen, indem andere Komponenten der zellulären Mikroumgebung wie Stütz- Stromazellen. Es ist bereits, dass auch Stromazellen in 3D Kulturen gezeigt, moduliert Wachstum, Proliferation und Invasion von Krebszellen. 33-35 Wie ein Proof-of-Concept-Experiment, Co-Kultur-Sphäroiden wurden durch Kombination MDA-MB-157 menschlichen Brust erzeugt Krebszellen und menschlichen Fibroblasten in einem Verhältnis von 50:. 1 36 vor den Experimenten wurden MDA-MB-157 und Fibroblastzellen gefärbtenmit einem Kern Farbstoff (blau) und Lebendzellfarbstoff (grün) sind, um den Nachweis von Zellen in Fluoreszenzbildern ermöglichen. 5a zeigt fluoreszierende und Phasenbilder der Kokultur Sphäroide mit einer Dichte von 1,5 x 10 4 Zellen und 50 :. 1-Verhältnis von Krebszellen und Fibroblasten 5b zeigt Steuer Sphäroiden von MDA-MB-157-Zellen für einen Vergleich. Dieser Ansatz ermöglicht die Bewertung der Wirkung von Stromazellen auf verschiedenen Phänotypen von Krebszellen.
Abbildung 1. Liquid-Handling-Plattform. Der Liquid Handler besteht aus Stationen, in denen Mischkanülen, Dosierspitzen finden Deponien Feld Quellplatte und Zielplatte Orten platziert werden. Die Lage jeder Station wird in dem Protokoll definiert sind. Mischkanülen werden auf eine Spalte der Pipettierkopf geladen und verwendet, um die Lösung einer wässrigen Phase DEX mischen Zellen enthält, in der Source-Platte. Diese Tipps werden dann von der Deponien Kasten angeordnet ist und die Abgabespitzen werden auf derselben Spalte der Pipettierkopf eingefügt. Diese Spitzen aspirieren 0,3 ul des wässrigen DEX Phase enthaltend Zellen von der Quelle Schale und verteile sie in die Zielplatte zu zellhaltigen Tropfen der DEX Phase innerhalb der Zielplattenvertiefungen der Eint PEG-Phase bereits bilden. Schließlich werden diese Tipps sind ebenfalls aus der Deponien Feld angeordnet ist, dass ein Zyklus von Druck abzuschließen.
Abbildung 2. Spheroid Formation. Der Liquid Handler verzichtet 0,3 ul der wässrigen Phase DEX (blau) enthaltenden Zellen (grün) in einen Brunnen, der die wässrige PEG-Lösung (pink). Dies führt zur Bildung eines Sphäroids nach 24 h Inkubation, wie im Bild rechts dargestellt. Maßstabsbalken 200 um.tps: //www.jove.com/files/ftp_upload/52754/52754fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3. Spheroid Konsistenz Die Daten. (A) Verteilung der Durchmesser der Kügelchen aus einer Platte mit 96 Vertiefungen gemessen wird, stellt jeder Punkt einen Sphäroid. (B) Frequenzdurchmesserverteilung zeigt Normalverteilung der Daten.
Abbildung 4. Drug Verhalten der Sphäroide. Die Lebensfähigkeit der Zellen in MDA-MB-157-Brustkrebszell Sphäroiden nimmt mit Erhöhung der Konzentration von Cisplatin als 1 nM-200 uM-Bereich. Die gestrichelte Linie ist eine sigmoide Passung zur Lebensfähigkeit Daten.
Abbildung 5. Co-Kultur Sphäroide (a) Leuchtstofflampenlicht (links) und Phasenkontrast (rechts) Bilder von Sphäroiden von MDA-MB-157 Brustkrebszellen (blau) co-kultiviert mit Fibroblasten (grün) auf einem 50:. 1 Verhältnis. (B) Spheroide von MDA-MB-157-Zellen werden zum Vergleich gezeigt. Maßstabsbalken 100 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Discussion
Sphäroide ein realistisches Modell, besser zu verstehen Tumorphysiologie und Wirksamkeit von Medikamenten und bieten ein nützliches Werkzeug für Anti-Krebs-Medikamentenentwicklung. Solche Anwendungen würden in hohem Maße von einfachen Techniken Sphäroid Erstellung und Pflege, die nur Standardlaborgeräte, Liquid Handling-Tools und Siebanlagen benötigen profitieren. Die Verwendung eines wässrigen Zwei-Phasen-System spontan Aggregatkrebszellen innerhalb der Tropfenphase ermöglicht die effiziente Produktion und Wartung von Sphäroiden mit Roboterflüssigkeits Handler und in situ Medikamentenbehandlung und Endpunktanalyse der Zellreaktionen mit kommerziellen Reagenzien und Werkzeugen. Somit ist diese Technik einen großen Vorteil gegenüber bestehenden Methoden der 3D-Zellkulturen und stellt einen Screening-Plattform zur Wirkstoffsuche zu beschleunigen.
Erzeugen gleichmäßig große Kügelchen innerhalb einer Mikrowell-Platte ist von entscheidender Bedeutung für die Hochdurchsatz-Screening-Anwendungen, um eine ähnliche Ausgangszell ac gewährleistenvität Ebene in allen Sphäroiden. Mit Liquid-Handling mit einer Luftverdrängungs Pipettiermechanismus, ist es wichtig, den Abgabevorgang durch die Quantifizierung der Auswirkungen der wichtigsten Liquid-Handling-Parameter (Höhe verzichten, verzichten Durchsatz und Pre-saugt Luftmenge) auf Abgabe der wässrigen Phase zu optimieren DEX . Diese Optimierung ermöglicht es dem Pipettierkopf zu fegen die viskose DEX Phasenlösung und Krebszellen in die Vertiefungen und produziert homogene Kügelchen. Obwohl spezifische Mengen für diese drei Parameter im Protokoll für die SRT Bravo Liquid Handler bestimmt wurde, sollte ein ähnlicher Ansatz mit anderen flüssigen Handlern verwendet werden, um optimale Ausgabebedingungen, die in Einklang DEX Phase Tropfengröße in das Tauch PEG-Phase verzichtet führen zu bestimmen. Darüber hinaus ist es möglich, 96 Spitzen zu nutzen und gleichzeitig drucken Sphäroiden in alle 96 Wells. Dies ist jedoch deutlich die Anzahl der Zellen erforderlich, um die Quelle-Platte mit dem füllen erhöhtDEX wässrigen Phase, die Zellen. Unabhängig von der Auswahl spaltenweisen oder Vollplattendruck nähert, ist es wichtig, den Inhalt des Quellplatte vor dem Absaugen mischen. Dies stellt sicher, dass die dichte Zellsuspension in der DEX Phase homogen ist und reduziert Variationen in der Größe der Kügelchen.
Mehrere Studien zeigen, dass Krebszellen Sphäroiden imitieren einige wichtige Eigenschaften der avaskulären Tumoren wie Morphologie und Diffusionsbeschränkungen von Reagenzien; somit stellen sie ein physiologisch relevantes Modell zur Bewertung der Wirksamkeit von neuen und üblichen Verbindungen gegen Krebszellen im Vergleich zu herkömmlichen Monolayer-Zellkulturen. 8,17,18,21,23,37 Es wird gezeigt, dass die wässrige Zweiphasensystem Konzept zur Herstellung von Sphäroiden können bequem Wirkstoff-Screening in der gleichen Platte, einfach durch Zugabe und Erneuerung einer Wirkstoffverbindung an den gewünschten Zeitpunkten und automatisierte Screening der Lebensfähigkeit der Zellen mit einem Standard-Mikroplattenlesegerät. Dieseist ein großer Vorteil gegenüber Verfahren, wie hängende Tropfen erfordern würde, dass die Übertragung Sphäroide mit einer Standardplatte für die Analyse von zellulären Reaktionen auf Arzneimittel. 21. Darüber hinaus ist es bekannt, Stützzellen in der Tumorumgebung und deren Wechselwirkungen mit Krebszellen in Verbindung gebracht verschiedenen bösartigen Phänotyp von Krebszellen. 33-35,38,39 Daher ist die Fähigkeit zur Kokultur Sphäroiden von Krebs erzeugen und Stromazellen unter Verwendung der wässrigen Zweiphasentechnik hilft bewerten Einfluß Stützzellen Tumor-Mikroumgebung auf den Antworten von Krebs Zellen, die verschiedene Behandlungen. Die Co-Kultur-Experiment in dieser Studie durchgeführt, dient als Proof-of-Konzept, das diese Technologie erfolgreich Sphäroiden enthält, Krebszellen und Stromazellen zu generieren. Zukünftige Studien werden diese Fähigkeit zu nutzen und zu untersuchen Differential Eigenschaften der Mono- und co-kultiviert Sphäroiden wie Proliferation und Arzneimittelreaktionen. Zusätzlich sindTechnologie bietet eine Plattform, um die In-vivo-Tumor-Mikroumgebung mehr genau imitieren, indem andere Stroma-Komponenten in der Tumormodell. 40
Zusammenfassend diesem Protokoll ermöglicht spontane Bildung von Sphäroiden in 96-Well-Platten ohne Verwendung von externen Kräften. Anpassung der Technik an einem Roboterflüssigkeitshandhabungs verbessert die Geschwindigkeit und Effizienz der Sphäroid-Produktion in einem Standard-Format mit hohem Durchsatz. Die Kompatibilität der Technologie mit kommerziellen Imaging und Testanalysen Plattformen können mit verschiedenen Instrumenten in akademischen und industriellen Laboratorien. Für zukünftige Anwendungen wird dieses Protokoll Wirkstoff-Screening mit 3D-Zellkulturen ein Routineverfahren zu straffen. Zusätzlich kann dieser Ansatz leicht modifiziert werden, um Sphäroide unterschiedlicher Größe für unterschiedliche Zelltypen, verschiedene Kombinationen von Krebs und Stromazellen in Kokultur Sphäroide zu bilden, und bis zu höheren Durchsatz Mikrowell-Platten t skalierto weiter beschleunigen Anti-Krebs-Wirkstoff-Screening.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Consumables | |||
| Polyethylene glycol, MW: 35,000 | Sigma-Aldrich | 94646 | |
| Dextran, MW: 500,000 | Pharmacosmos | 5510 0500 9007 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| Glutamine | Life Technologies | 35050-061 | |
| Antibiotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Clacein AM | Life Technologies | C3100MP | |
| Hoechst | Life Technologies | 33342 | |
| Cisplatin | Spectrum Chemicals | 15663-27-1 | |
| PrestoBlue | Life Technologies | A-13261 | |
| Pluronic F-108 | Sigma Aldrich | 542342 | |
| Disposable Tips (10 µl) | Fluotics | C-P10V11.ST | |
| Disposable Tips (70 µl) | Fluotics | C-P70V11.ST | |
| Round-bottom 96-well plates | Nunc | 268200 | |
| Equipment | |||
| Liquid Handler | Agilent Technologies | SRT Bravo | |
| Microplate Reader | Biotek Instruments | Synergy H1M | |
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