Introduction
혈전증의 개발 및 항 혈전 약제의 효과의 평가에 관련된 메카니즘의 연구는 또한 실험 동물 모델을 확립 요구한다. 설치류가 1보다 인간에게 더 큰 용기가 제공 유사한 큰 동물 모델을 사용하는 제했다. 그러나 높은 비용이 요구되는 더 큰 시설을 조작하는데 어려움이 유전자의 사용에 큰 단점이며, 설치류에 예비 시험이 결정적인 결과 2 주어진 일단 큰 동물은 지금 늦은 전임상 연구로 제한됩니다. 생체 내 테스트에 필요한 혈전 약물의 양을 최소화하는 유전자 및 녹아웃 균주 및 작은 크기의 넓은 가용성, 생쥐는 주로 혈전증 연구에 사용된다. 따라서, 혈전 성 질환의 몇몇 모델 생쥐 3에 개발되어왔다.
대부분의 설립 혈전증 모델은 intim을 방해혈전 (4)의 형성을 유도하는 혈액 흐름에 서브 내피 세포 외 기질의 노출 뒤에 혈관 벽의 층. 혈전은 /과 응고 캐스케이드 (5)를 활성화 조직 인자의 노출 또는 혈소판 활성화를 트리거 콜라겐 노출 될 수 있습니다. 몇 가지 기술이어서 초기 혈관 손상을 달성하기 위해 사용된다. Pierangeli는 외. 대퇴부 정맥 6 미세 도구 기계적 파괴 모델을 개발 하였다. Kikushi 등은. 녹색 등 (540 ㎚) 7 관심의 혈관 벽의 특정 여기 뒤에 내피 세포의 지질 이중층에 축적 사진 반응성 화합물 (로즈 벵갈)의 관리에있다 모델을 설명했다. 상처는 짧은 고강도의 펄스 레이저 조명 (8)에 의해 유도 될 수있다. 또 다른 기술은 먼저 쥐의 경동맥에 설립염화 제이철의 국소 적용 (50ml을) 구에있다. 이 경우, FeCl3를 생성 유리기로부터 용기 삭박 결과는 내피 세포 (10)의 지질 과산화 및 파괴를 야기한다. 부상 백혈구 모집뿐만 아니라 혈소판 부착 및 응집을 유발 여러 부착 분자의 발현을 유도한다. 이것은 백혈구, 특히 호중구, 혈전증 11 이어지는 혈액 응고 캐스케이드의 활성화에 결정적인 역할을한다는 것을 증명되었다. 이 방법은 잘 응고 캐스케이드를 재현 적합하다; 연구자들은 인간의 혈전증은 주로 병에 걸린 예에서 발생되는 반면,이 마우스 모델에서, 혈전증은 일반적으로 건강한 혈관에 유도되어, 명심해야합니다. 동맥 경화성 혈관.
이 모델은 구현하기 매우 간단하고 또한 마우스에서 효과적이기 때문에, 지금 주로 사용 혈전증 모드생체 내 연구에서 작은 동물을위한 L. 또한,이 기술은 용기의 다양한 혈전의 형성을 유도 할 가능성을 제공한다. 대상 선박은 동맥 또는 큰 직경 (경동맥, 대퇴, 대정맥) 또는 작은 직경 (장간막, cremaster) 12-14의 정맥이 될 수 있습니다. 최근에, 또한 스트로크 (15)의 모델을 개발하기 위해 근위 중뇌 동맥에 사용 하였다. 혈전 형성이 직접 혈소판 및 백혈구의 형광 표지 한 후 현미경으로 관찰하여 생체 내에 또는 온도 프로브 또는 도플러 프로브 12,16,17과 혈류의 감소를 측정함으로써 모니터링 될 수있다. 이러한 폐색 시간, 혈전 형성 시간이나 혈전 크기와 같은 여러 파라미터는 조사 될 수있다. 혈관 사이의 생리적 차이가 얻은 혈전에 상당한 변화에서 결과를 조사 하였다. 따라서, 연구자들은 일반적으로 그들이 measu 원하는 매개 변수에 따라 상기 타겟 용기를 선택다시 및 / 또는 조사하려는 설정 질병. 일반적으로 경동맥의 모델은 대정맥에 대한 연구가 깊은 정맥 혈전증에 대한 연구에 대한 관련성 반면 심근 경색 또는 뇌졸중에 관한 죽상 혈전증에 대한 연구에 더 관련이있다. 다른 혈관의 접근성 또한 혈전 성장을 측정하는 데 사용되는 방법을 결정한다. 예를 들어, 장간막 혈관은 생체 내에 현미경 관찰 및 혈전 형성의 역학 연구를위한이 모델이 적합하다 액세스하기 쉽다. 경동맥 적게 액세스 가능하지만 혈류 측정 크다 및 폐쇄성 혈전을 연구 우수한 모델을 제공한다.
염화 제이철 유도 혈전증 모델이 병리의 이해에 엄청난 진전을 제공하고 있습니다. 이는 혈전 형성 (18,19)에 폰 빌레 브란트 인자의 역할에 초점을 여러 연구에 사용되었다. 유전 MODI와 결합문법을 없애는 기술은 또한 혈전 성 질환에 관여하는 많은 유전자의 특정 식별을 허용했다. Lamrani 등은. 예컨대 JAK2 V617F 유전자의 녹아웃에 혈병이 불안정 (20)의 가속 형성과 연관되어 있음을 보여 주었다. 장 등이. P2Y12 혈소판 수용체의 생리 학적 의미를 조사 혈소판 특이 수용체를 과발현하는 형질 전환 마우스 만, FeCl3를 21 부상 장간막 동맥에서보다 신속하고 안정적인 혈전 형성을 표시 것을 증명 하였다. 조직 - 형 플라스 미노 겐 활성제 (TPA)과 섬유소 분해 공정에서 키나아제 형 플라스 미노 겐 활성제 UPA ()의 중요한 역할은이 방법 (22)에서 조사되고있다. 또한,이 모델은 또한, 생체 내에서 많은 신규 한 약품의 섬유소 용해 능력을 시험하는 간단하고 정확한 방법을 제공한다. 예를 들어, 왕 등 알. 일이 모델을 사용하고 있습니다활성화 된 혈소판 (23)에 대해 목표로 새로운 재조합 플라스 미노 겐 활성제의 전자 전임상 유효성 검사. 이 방법은 진드기, 뱀파이어 박쥐, 및 모기의 타액이나 대상 24 ~ 27의 특정 식별과 뱀의 독에서 분리 된 치료 용 단백질의 유효성 검사를 활성화. 이러한 예 염화철 모델의 다양성을 증명한다. 이 문서에서 우리는 두 가지 방법에 초점을 두 개의 서로 다른 선종에 염화 제이철 유도 혈전증을 연구; 장간막 혈관 및 경동맥.
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Protocol
동물과 관련된 모든 실험은 알프레드 의학 연구 및 교육 선거구 동물 윤리위원회 (E / 2,015분의 1,534 / B)에 의해 승인되었다. 모든 수술 조작은 완전 마취 하에서 수행하고, 동물은 임의의 단계에서의 통증을 경험하지 않았다. 기재된 모든 실험은 비 - 회복된다.
1. 준비
- 종이 필터 (1mm × 2 ㎜)의 얇은 밴드를 잘라.
- 갓 4 % 염화 제이철 용액이 준비 (w / v)의 6 % (W / V)를 탈 이온수로 희석 하였다. 0.22 μm의를 통해 여과, PBS에 로다 민 6G 솔루션 0.3 %를 준비합니다.
- 주사기 래퍼의 흰색 플라스틱 작은 조각 (5mm X 1cm)을 잘라.
생체 내에 현미경으로 관찰 2. 장간막 세동맥 혈전 형성
- 10 ~ 12 주 된 남성 C57BL / 6 야생형 마우스의 무게를 측정하고 복강 내 주사 비록 케타민의 혼합물 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (10 ㎎ / ㎏)에 따라 마취. 발가락, 꼬리 및 / 또는 피부 핀치, 각막과 눈꺼풀 핀치에서 반응성과 수염 운동의 부재에 응답하여 마취의 깊이를 모니터링합니다. 필요한 경우, 동물의 마취를 유지하기 케타민의 투여 제 (50 밀리그램 / kg)을 주사. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 적용합니다. 37 ℃로 조정 가열 패드에 배치 작은 배양 접시에 마우스를 놓습니다.
참고 : IP 주입은 동물의 고통을 초래할 수 있지만,이 불편의 기간이 최소 (이하 3 초)입니다. 주입과 관련된 통증과 불편 경험이 풍부한 유능한 인력과 적절한 바늘 크기 (25 G)의 사용을 통해 최소화 할 것입니다. 모든 절차에 따라, 자궁 경부 전위 다음 케타민과 자일 라진의 과다 복용을 사용하여 모든 동물을 안락사. - 피부에 약 3cm의 복부 정중선 절개를 수행하고 조심스럽게 복막을 잘라.
- 애완 동물의 측면에 마우스를 위치리 접시, 부드럽게 장을 외면 화하다 조심스럽게 페트리 접시의 표면에 적당한 용기를 가지고 2 면봉으로 장간막을 확산. 섬세한 와이퍼가 제대로 건조.
주 : 장간막 혈관의 이동을 제한하기 위해는, 파파 베린은 소화관의 연동 운동을 억제하는 데 사용될 수있다. - 혈관을 팽창 및 백혈구 및 혈소판 레이블을 29 G 주사기와 마우스의 꼬리 정맥에 로다 민 6G (0.3 %)의 30 μl를 주입하기 위해 따뜻한 물에서 마우스의 꼬리를 만끽 해보세요.
- 도립 현미경으로 페트리 접시를 놓고 시야 채널을 이용하여 선택된 세동맥에 초점을 맞춘다.
- 6 % (w / v)의 철 (III) 클로라이드로 여과지 밴드 담가 두 집게 세동맥에 여과지를 적용; 첫 번째 여과지 부드럽게 관심 영역에 그것을 누르 초 하나를 보유한다. 여과지의 증착 다음 처음 10 초에서 혈전 형성을 관찰한다.
참고 : 아주 통신입니다둘러싸인 미세 혈관 및 여과지의 증착 및 부드럽게 압력의 정밀도를 손상하는 데에이 문제를 제한하는 것이 중요하다. - 여과지 : 형광 현미경으로 혈전 형성 (피크 557 nm의 여기, 576 nm의 발광 피크 TRITC 채널)을 관찰한다. 혈전에 로다 민 6G과 통합을 촬영 한 순환 백혈구와 혈소판을 준수하는 것은 따라서 쉽게 식별 할 수 있습니다.
- 철 (III) 클로라이드로 1 분간 노광 후 여과지를 벗고 혈전의 형성을 모니터링하는 것을 계속한다. PBS로 용기를 세척 할 것.
- 관찰하고 로다 민 6G와 혈소판 및 백혈구의 표시로 강조 혈전의 동적 형성을 기록한다. 이미지를 캡처하고 혈전의 크기를 측정한다. 본원에 제시된 이미지 TRITC 형광 채널, 대물 4X 불구 반전 생체 내에 현미경으로 얻었다.
- F모든 절차를 따르게, 자궁 경부 전위 다음 케타민과 자일 라진의 과다 복용을 이용하여 동물을 안락사.
3. 경동맥 동맥 혈전 형성은 혈류의 속도 측정에 의해 평가
- 10-12주에게 세 남성 C57BL / 6 마우스의 무게를 측정하고 복강 내 주사하지만 케타민 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (10 ㎎ / ㎏)의 혼합물로 따라 마취. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 적용합니다.
- 37 ° C로 조정 한 가열 패드, 다리에 접착 테이프를 이용하여 운영 현미경 마우스를 고정.
- 하나의 와이퍼에서 작은 베개를 확인하고 약간 머리를 상승 마우스의 머리 밑에 테이프. (윗니를 사용) 주둥이를 아래로 당겨 집게로 스레드 루프를 사용합니다. 이것은 쉽게 액세스 경동맥의 영역을 노출한다.
- 아래 흉골에 직접 턱 아래 피부의 작은 5mm 깊이 절개를 수행합니다.
- FA를 해부하다scia 및 분기 위의 왼쪽 또는 오른쪽 경동맥 중 하나의 단편을 격리 할 것.
- 조심스럽게-에서의 동맥을 분리하는 신경 핀셋을 소개합니다. 가까운 동맥에 실행 신경을 방해하고 수있는 혈관의 손상을 야기으로 경동맥을 너무 많이 만지지 않도록하지 마십시오. 동맥의 적어도 5 mm의 섹션을 분리.
- 액체는 FeCl3를 방해하는 것을 피하기 적절히 와이퍼 동맥의 면적을 건조.
- 주변 조직에 흡수되지 않는 50ml을 너무 경동맥의 절연 부분 아래에 작은 흰색 플라스틱 조각을 넣어. 이를 위해, 동맥 하에서 플라스틱 용지를 천천히 후 처음으로 조각을 가지고 밀어 제 집게를 사용한다.
- 4 % (W / V) 또는 6 % (W / V) 염화 제이철과 필터 종이를 적시하고 동맥 주위에 모두 배치합니다.
- 3 분 노출 후, 여과지를 벗고 PBS로 씻어 와트 지역을 건조i 번째 와이퍼.
- 부상당한 지역에서 선박 주위의 도플러 흐름 프로브를 놓고 흐름의 변화를 기록하기 시작합니다. 성체 마우스의 건강한 경동맥에서, 흐름은 일반적으로 약 1 ㎖ / 분이다. 주의! 접촉은 피해야한다, 그래서 염화 제이철과 프로브의 접촉 프로브가 손상 될 수 있습니다. 본원에 제시된 데이터는 나노 도플러 유동 탐침 0.5 PBS 구비 천음속 시스템 사 유량계, TS420 혈관 주위 모듈 얻었다.
주 : 염화철의 농도가 서로 다른 시간 폐색 결과 혈전 형성의 동력학을 수정할 수있다. 따라서, 6 %에 노출 (/ W가 V) 염화 제이철은 염화 제이철 (/ V W) 4 %로 노출보다 빠른 폐쇄를 제공합니다. - 모든 절차에 따라, 자궁 경부 전위 다음 케타민과 자일 라진의 과다 복용을 사용하여 모든 동물을 안락사 조심스럽게 도플러 프로브를 청소합니다.
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Representative Results
로다 민 6G의 축적을 발표 할 예정 장간막의 형광 생체 내에 현미경 관찰 50ml을 부상으로 혈관 벽을 따라 혈소판 및 백혈구를 표시. 부분 혈전의 점진적 형성은 200 μm의의 장간막 용기 (그림 1)에서 모니터링된다. 혈전 서서히 나타나며 명백하게 FeCl3를 노출 제 분 후에 식별 가능한 (도 1, t는 60 초 =). 40 초 FeCl3를 적신 여과지 제거한 후, 혈전증이 빠르게 진행되고, 최종적으로 관찰 된 전체 용기 구획의 벽에 존재한다 (도 1, t는 100 초 =).
그림 1 :. 혈전 성장 장간막 용기에 형광 생체 내에 현미경으로 관찰이 이미지는, 60 15 초에 찍은삼성 전자와 50ml을 솔루션 (V / W) 6 %로 적신 여과지의 증착 후 100 초. 여과지 노출 60 초 후 제거 하였다. 백혈구와 혈소판은 로다 민 6G의 사전 주입을 표시했다 (W / 0.5 % V). 빨간색 화살표는 혈소판 / 백혈구 집계를 나타냅니다. 스케일 바 200 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
내 경동맥 혈전은 절연 경동맥 주위의 FeCl3 용액에 침지 여과지 애플리케이션 및 도플러 유동 탐침 (도 2)와 함께 기록되어 부상 하류 혈류 변화에 의해 유도된다. 1.1 ml의 주위 전체 일정 혈류 / min으로 비 부상 경동맥 측정된다. 50ml을 솔루션 (/ V W) 4 %에 적신 여과지와 용기의 3 분 노출 후, 폐색 성 혈전은 O입니다13 분, 노광 개시 후 30 초 가림 시간 btained. 6 % 적신 여과지로 3 분간 노광 후 (W / V)의 FeCl3, 폐색 성 혈전이 9 분, 노광 개시 후 30 초 가림 시간이 얻어진다.
도 2의 FeCl3 부상. 혈류 후 경동맥을 통해 혈류의 대표적인 녹음은 4 % (w / v)로 또는 6 % (적신 여과지 하류 경동맥에 배치 도플러 유동 탐침 측정했다 w / V)의 FeCl3. 여과지 노출 3 분 후에 제거 하였다. 제어 혈류 건강 경동맥을 측정함으로써 얻었다있다.
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Discussion
염화철 유도 혈전증 모델은 우수한 연구 도구이다. 본 연구에서 나타난 바와 같이, 그 구현이 매우 용이하고, 생체 내에 현미경 또는 도플러 유량계와 조합하여 사용될 때, 혈전 형성의 좋은 실시간 모니터링을 제공한다. 노출 시간과의 FeCl3의 농도를 조정, 또한 비 또는 폐쇄성 혈전 폐색 하나를 생성 할 수있는 가능성을 제공한다.
그러나,이 방법은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 경동맥, 주요 단점은 가림 시간을 효과적으로 개질 할 수 있지만, 모델 재현성 정확하게 혈전 크기와 성장 속도를 제어하기 위해 열이 너무 약한 남아 있다는 것이다. 몇몇 그룹은 모델 (28, 29)의 표준화에 일했다. 오웬스 등. 그 신뢰성과 재현성 가림 시간 연습과 같은 세 모든 변동 요인을 감소시킴으로써 얻어 질 수있다 제안했다쥐, 생쥐의 유전 배경 이용 마취, 염화 제이철 박람회 기술과 염화 제이철 용액 (28)의 농도. 도플러 프로브 자체도 폐쇄의 결정에 영향을 미칠 수있는 배경 신호 현재 어느 정도의 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 혈류는 불안정한 혈전의 형성에 의해 변경 될 수있다.
장간막 혈관에서 재현성보다 경동맥 및 부상의 정도를 감소 할 수있다 지방의 존재보다 다양 용기의 크기에 의해 영향을받을 수있다. 이는 수득 혈전 매체 층 (30)의 평활근 세포 또는 내피 세포를 흘리기도 영향을 억제 할 수있는 용기 벽 병변의 크기에 따라 달라질 것으로보고되었다. 레이저 조사 모델은보다 재현성을 제공 염화철 모델의 좋은 대안을 구성하는 8. 그러나, 레이저의 침투를 가능하게 할 정도로 투명하다 작은 용기로 제한된다. 또한,이 모델에서, 내피 세포는 염화철인가 후 파괴하고, 따라서 내피 세포의 역할에 대한 연구에 적합하지 않은 것을 주목해야한다. 그러나, 내피 (31)의 활성화에 한정 약한 부상을 얻었다 칼슘 이온 운반체에 의해 염화 제이철을 대체 할 수있다.
이 모델의 또 다른 한계는 질환의 장기 진화를 연구하기에 적합하지 않다는 것이다. 이 요구 사항을 충족하기 위해, Boulaftali 등은. 몇 주 (32)을 통해 같은 혈전의 모니터링을 가능하게 등쪽 피부 집계 챔버를 개발했다. 이 기술은 특히 잘 혈전 성숙에 따른 혈전 약물의 효과를 조사하기에 적합하다. 본 연구에서는, 응고 노화 tissu의 재조합 형태의 용균 작용을 저해하는 것으로 확인되었다현재 인간의 사용을위한 혈전 용해 약물의 황금 표준 전자 플라스 미노 겐 활성제,.
고려주의해야 몇 가지 단점에도 불구하고, 50ml을 모델 인간 혈전증의 연구에 관련이있다. 얻어진 혈전 조성물은 조직 학적 단면과 내 경동맥 (33)에 혈전이 확인 된 혈소판, 피브린 및 적혈구의 존재에서 분석되었다. 게다가, 죽상 무질서의 FeCl3 모델 기계적, 광 화학적 또는 레이저보다 인간 질환의 병리 생리학을 모방 쉽다 옥시도 - 환원 반응하지만 혈관 손상을 유발 지단백질 oxydation 의해 개시되는 것으로 가정되기 때문에 상해 (34)을 유도.
염화철도 항응고제, 항 혈소판 약물 모두에 민감하게 설명되었지만 혈전 형성. 예를 들어 헤파린과 클로피도그렐은 담당자되었습니다경동맥 (29)에 형성된 혈전 폐색 시간을 연장 orted. 히 루딘의 재조합 형태의 관리는 크게 장간막의 미세 혈관 (17)에 혈전 형성 시간을 연장했다. 따라서, 염화 제이철 혈전증 모델에서 우수한 통찰력을 제공하며 새로운 혈전, 항응고제, 항 혈소판 약물의 임상 검증을위한 매우 중요한 도구이다.
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Acknowledgments
저자는 NHMRC와 NHF의 기술 기쁨 야오 박사 카렌 Alt 키의 지원뿐만 아니라 자금을 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whatman chromatography paper | GE Healthcare | 3030917 | |
| Iron (III) chloride 40% (w/v) | VWR | 24212.298 | |
| Rhodamine 6G | Sigma | R4127 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| Digital black-and-white camera | Olympus | XM10 | |
| Doppler flowmeter | Transonic | TS420 | |
| Nano-doppler flow probe | Transonic | 0.5 PBS | |
| Ketamine | Hospira | 0409-2051-05 | |
| Xylazine (Rampun) | Bayer | 75313 | |
| Petri dish | Sarstedt | 82.1472 | |
| Insulin syringe (29 G) | BD Ultra-Fine | 326103 | |
| Cotton tipped applicators | BSN medical | 211827A | |
| Dynek dysilk sutures | Dynek Pty Ltd | CS30100 | |
| Dulbecco's phosphate buffer saline (PBS) | Gibco life technologies | 21600-069 | |
| Heating pad | Kirchner | T60 |
References
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