Introduction
Co-enfeksiyon, aynı anda birden çok enfeksiyonları ile enfeksiyon, doğal ortamlarında normdur. Co-enfeksiyon hastalığı patolojisi ve her enfeksiyonun klinik yönetimi üzerinde büyük bir etkiye sahip olabilir. Ko-enfeksiyon, aşı ve ilaç etkinliğinin yanı sıra, tanısal testlerin bağlamında, olumsuz etkilenebilir edilebilir (1 gözden). Ancak, onun önemine rağmen, patojen araştırma çoğunluğu sadece tek enfeksiyonları düşünmektedir.
Sıtma ve HIV-1 (HIV) küresel morbidite ve mortalite nedenleri lider vardır. 10 - sıtma ve HIV endemik Alanları ko-enfeksiyon riski milyonlarca insanı koyarak ve dolayısıyla daha ciddi klinik hastalık 2 için risk altında, geniş bir coğrafi örtüşme paylaşıyoruz. İki hastalık olumsuz etkileşim. HIV ile infekte olmuş kişiler, daha yüksek bir HIV viral yükü ve CD4 + T-hücresi sayımlarında geçici düşüşler olarak içinde ise, bir sıtma enfeksiyonu sırasında görülebilirsıtma paraziti yük ve klinik ve ciddi sıtma riski ko-enfekte olmuş bireylerin 2,3,5,7,8,10 daha yüksektir. HIV, sıtma şiddetini artıran hangi mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır ve daha fazla incelemeyi gerektirdiği değildir.
Burada, in vitro incelenmiştir edilebilir sıtma ve HIV ko-enfeksiyonu ile bir yöntem açıklanmaktadır. Spesifik olarak, bu yöntem, HIV enfeksiyonu bağlamında sıtma spesifik immün yanıtların incelenmesi için izin verir. Bizim protokol kültürlenmiş P. kronik HIV ile enfekte donörlerden ve in vitro izole edilmiş taze izole edilmiş periferal kan mononükleer hücreleri kullanılarak çok yönlü bir ko-kültür sistemi (PBMC) tarif falsiparum eritrositler (PfRBC) parazitlenmiş. Bu tepkiler üzerine HIV antiretroviral tedavinin etkisi de HIV (+) bağış öncesi ve sonrası terapi prospektif olarak toplanan PBMC kullanılarak incelenebilir.
Biz HIV enfeksiyonu etkisini araştırmak için bu sistemi kullanmışsıtma özgü doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarına 11,12 ve NK hücreleri engelli olduğu sıtma özgü IFNy ve TNF yanıtları belirlemek başardık, HIV (+) bağış öncesi ve sonrası HIV antiretroviral tedavi dan NKT hücreleri, γδ T hücreleri . Ayrıca, monositik işlevleri de HIV (+) vericilerden engelli olduğunu belirlemek, ama post-HIV antiretroviral tedavi kurtarmak için bu sistemi kullanmak mümkün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol, parazit kültürü için kullanılan serum ve RBC için donör alımı gerektirir ve PBMC izolasyonu için, HIV (+) ve enfekte edilmemiş donörlerin. Kurumsal Değerlendirme Kurulları tüm çalışmalarını onaylaması gerekir ve tüm donörler kan beraberlik öncesinde bilgilendirilmiş onam sağlamanız gerekir.
DİKKAT: İnsan kan numuneleri ve insan sıtma parazitleri ile çalışma önlem gerektirir. Her seviye 2 Biyogüvenlik kabinede bir laboratuvar önlüğü, eldiven ve çalışmalarını giyerler. İnsan sıtma yanlışlıkla perkütan maruz kalma durumunda, profilaktik tedavi için Sağlığı ve Güvenliği rapor. Ek güvenlik dikkate de HIV (+) kan ile çalışmak için yerine koymak gerekir. Bir geri kapanış laboratuvar önlüğü giyin. (Üst eldiven lateks olmalıdır) Çift eldiven. Bir seviye 2 Biyogüvenlik kabinedeki tüm taşıma gerçekleştirin. Herhangi bir cam veya keskin nesneler kullanmayın. Aspiratör kullanmayın. Atılmadan önce 1 saat en az virox çözelti veya çamaşır suyu tüm kontamine öğeleri yerleştirin.Kullanımdan sonra 1 saat boyunca virox ve UV tüm yüzeyleri yıkayın. Her kurum takip edilmesi gereken, kendi özgül biyogüvenlik düzenlemelere sahip olacağını unutmayın. Değerlendirme ve olası maruziyet sonrası profilaksi dikkate Sağlık ve Güvenlik HIV ile enfekte kan tüm yanlışlıkla maruz kalma bildirin.
Not: P. Farklı suşları falciparum sıtma parazitleri yok. ITG Bu deneyler için kullanılmıştır, ancak farklı suşları kullanılabilir. Donma ve çözülme Plasmodium falciparum parazitler üzerinde mükemmel talimatlar MR4 sitesinde 13 mevcuttur.
1. Sıtma Parazit Kültür RPMI-A Yapımı
- GKD 2 O 950 ml, RPMI-1640 tozu 1 paket, HEPES 6 g sodyum bikarbonat 2 g ve hipoksantin 1.35 mg karıştırılarak RPMI-0 sağlayın.
- Çözülme ısı iki farklı vericilerden insan serumu inaktive. Parazitler O türü yetiştirilen durumunda AB donörler iyi, ancak herhangi bir tercih edilebilirkırmızı kan hücreleri (RBC). Karıştırmak için tüpler ters çevirin. Serum partikül madde içeren veya kalın sıkma 2.000 rpm'de ve sonra 0.45 mikron filtre ünitesi kullanılarak sıvı kısmını filtre.
- 0.2 um'lik bir filtre ünitesi filtre RPMI-0 180 ml insan serumu (her vericiden 10 mi) 20 ml ve / ml gentamisin, 10 mg 0,5 ml kullanılması.
Not: birden fazla filtre birimi gerekebilir, böylece insan serumu filtre yapışmasına neden olabilir. - RPMI-A orta şişe, tarihi ve serum kaynağını Etiket. Gerekli buzdolabında kadar. Buzdolabında RPMI-A bulutlu dönüşebilir. Bu normaldir, fakat artan bulanıklık kontaminasyon bir işaretidir.
Not: Parazit büyümesi, farklı verici serumu içinde değişebilir. O kullanmadan önce iyi parazit büyüme için tüm insan serum toplu test etmek için iyi bir fikirdir.
Parazit Kültür 2. Hazırlama insan kırmızı kan hücrelerinin
Not: Kan bağış tip O. olmalıdır
- Asit-cit içine kan 7-10 ml toplayınoran-dekstroz (ACD) borular. Vericinin kimliğini ve etiketinde koleksiyon tarihini yazın.
- 4 o C'de saklayın kan kadar gerekli. 1 ay içinde parazit kültürleri için kan kullanın.
- % 70 etanol ile tüpün üst silin. Durdurucuyu dikkatlice çıkartın ve atın. 15 ml'lik bir tüp içine kan transferi. 1000 x g'de 3 dakika boyunca spin. Aspirasyon ile plazmayı çıkarın.
- Sıcak RPMI-0 eşit hacimde olan RBC askıya alınması. 1000 x g'de 5 dakika boyunca spin. RPMI-0 5 ml, aspirasyon yoluyla tekrar süspansiyon buffy coat çıkarın ve yıkama 2 kez daha tekrarlayın.
- Süpernatantı ve hacim olarak% 50 RBC bir karışım elde etmek için yeterli RPMI-A ilave edin.
- Gerekli olana kadar 4 o C'de saklayın.
3. Parazit Kültürleri bakımı
- Önceden sıcak RPMI-A 37 o C
- RPMI-A 5 ml ~% 3 bir hematokrit yıkanmış insan eritrosit 75 ul bir T25 şişesi içine çözülmüş parazit (eritme işlemi için MR4 protokolü) yerleştirin.Not: Hematokrit toplam hacmine göre eritrosit hacmi ölçer. Hesaplamak için hematokrit orta artı RBC toplam hacmine paketlenmiş RBC hacmini ölçmek. Çözülmüş parazitler RBC 75 ul katkı olacağını varsayabiliriz. % 3'lük bir hematokrit (150 ul / 5000 eşittir ortamın 5 ml RBC 150 ul'lik toplam vardır şişeye (paketlenmiş RBC 75 ul ekleyerek eşdeğer olan) RBC stokunun 150 ul ekleyerek ul),% 100 =% 3 x.
- Parazit gaz karışımı (% 1 O 2,% 3 CO2, denge N2) ile 30 saniye boyunca balon gazdır. Kapatın ve gaz değişimi için büyük bir yüzey alanı sağlamak için bir 37 o C kuluçka makinesi içinde aşağı doğru bir şişeye, geniş yan yerleştirin.
- RBC katmanı rahatsız değil için orta değiştirmek ve parasitemi (günlük yapılması gereken) kontrol etmek için dikkatlice şişeyi taşıyın. Steril takılı Pasteur pipeti kullanarak kan tabakası bozmadan kültür ortamı kapalı çizin.
- Pa kontrol etmek içinrasitemia, kan tabakasının 10 ul örneği kaldırmak cam slayt üzerine yerleştirin ve ince bir kan filmi bir ikinci cam slayt oluşturmak kullanarak. Slayt kurumasını bekleyin.
- Yavaşça, bir şişeye, taze RPMI-A 4 ml yerleştirin 30 sn için, gaz karışımı, ve 37 ° C'de inkübatörde yer.
- Üreticinin protokolüne uygun olarak Hema3 boyama kiti kullanılarak lamele.
- Optimal boyama için, dip 10 saniye, 10 saniye boyunca bir çözeltisi, ve 30 saniye süreyle bir çözüm II sabitleme çözeltisi içinde kayar. Suda durulayın ve kurumaya bırakın slaytlar.
- PfRBC sayarak parasitemia hesaplayın RBC (lekeli pembe) toplam sayısı karşısında (koyu mor lekeli). Doğruluğunu sağlamak için 300 hücrelerinin toplam güvenin.
- Parazitler 5% bir paraziteminin ulaştığında, RPMI-A 40 ml ve RBC 500 ul kullanılarak, T75 şişesi içine kültür genişletme.
4. Parazit Senkronizasyon
Not: t gün önceO, deneme alanin ile işlenerek parazit kültürü senkronize edin. Sadece halka sahne parazitler ve bulaşmamış RBC bu tedavi hayatta kalacaktır. Alanin senkronizasyon saf trofozoit Kültür size ko-kültür deneyleri kullanılabilen bir sonraki gün verecektir. Halka sahne parazitler çoğunluğu içeren bir parazit kültürü ile başlamak emin olun.
- Alanin 8,01 g (300 mM) ve GKD 2 O 300 ml Tris (10 mM) 0,365 g karıştırılarak alanin çözeltisi hazırlayın 7.4 pH değerini. Filtre 0.2 mikron filtre ünitesi kullanılarak sterilize edin.
- Önceden sıcak alanin çözümü için 37 o C
- Parazit kültürü (5 dk x 1.000 xg) aşağı doğru döndürün ve orta kaldırmak.
- Alanin çözeltisi 19 cilt olarak süspanse pelet (1 ml 19 ml alanin çözüm RBC paketlenmiş). Oda sıcaklığında 15 dakika süreyle inkübe edilir.
- Spin 5 dk x 1.000 x g. Süpernatant aspire. RPMI-0 kez yıkayın. Aspire supernatant ve tekrar süspansiyon RPMI-A ve ~% 3 hematokrit ayarlayın. G37 o C şişeye ve dönüş olarak
Not: ko-kültür deneyleri için 5% trofozoitleri minimum parazitemi optimal olarak% 10 parazitemya ile gereklidir.
Co-kültür deneyler için 5. Parazit ve RBC Hazırlık
- Iltihabik bir cevabı indüklemek için bir ko-kültür deneylerde PBMC'nin başına 3 PfRBC oranına kullanın. Toplam PfRBC hesaplamak için, 3.5'te tarif edilen, ve hematokrit bir hemositometre kullanılarak Parazit kültürünün mL'si başına RBC sayısını saymak sureti ile ince kan smear yaparak paraziteminin ölçmek.
PfRBC =% parazitemi sayısı kültürünün toplam RBC / ml x ml x. Örnek: 10 x 10 6 RBC / ml ve% 10 parazitemya kültürünün 10 mi, 0.1 x 10 6 / ml x 10 ml = 10 x 10 6 PfRBC eşittir. - 1000 xg (RT) 5 dakika boyunca parazit kültürü dönerler. RPMI-S + ml başına 6 x 10 6 PfRBC (500 mi RPMI-1640 da orta aspire, ve tekrar süspansiyon L-glutamin ve HEPES,% 10 ısı ile desteklenmişhareketsiz hale getirilmiş FBS, 1.5 ml gentamisin, 5 100 mM sodyum piruvat mi, 10 mM MEM temel olmayan amino asitler 5 mi, 5 mM β-merkaptoetanol 5 mi).
- Parazit kültürü olarak, ml başına RBC aynı sayıda RPMI-S + hematokrit ve tekrar süspansiyon hesaplamak (Parazit kültürünün muhafaza edilmesi için kullanılan aynı donörden enfekte olmamış RBC), kontrol kan al.
İnsan Periferal Kan Tek Çekirdekli Hücreleri 6. izolasyonu (PBMC)
- (-) Kontrol kronik HIV (+) donör ve bir HIV hem sodyum heparin tüplerinde venöz kan (yeşil üst) toplayın. EDTA kalsiyum şelat eylem hücre fonksiyonunu etkileyen bir anti-koagülant olarak EDTA kullanmayın. Ortalama kan 10 ml başına 6 10 x 5-10 arasında PBMC'yi bekliyoruz. Tipik bir deney için, her vericiden kan 30 ml toplar. Kan hacmi deneysel gereksinimlerine göre ayarlanması gerekir.
- Mümkün olduğunca çabuk ve kesinlikle kan bir saat toplanan içinde olduğu gibi,Plastik 50 ml tüp içine tüpler ve yerden kan kaldırın. Özellikle Monositler aktif ve cama yapışır, böylece cam kan toplama tüpleri kullanıldığında hücrelerin mümkün olduğu kadar çabuk çıkarılır önemlidir edilecektir.
- 15 dakika boyunca 1000 xg'de kan Spin ve plazma toplamak (- değil bu adım atlanır olabilir eğer bu gerekirse diğer çalışmalar için de kullanılabilir). Sonra soğuk DPBS içinde eşit hacimde kan seyreltin.
- 50 ml'lik bir tüp içine RT Ficoll 15 ml yerleştirin. Yavaşça, steril plastik transfer pipet kullanarak, herhangi bir şekilde karıştırmadan Ficoll üzerinde kan / DPBS çözümü katman. Kan / DPBS çözeltisi 25 ml maksimum Ficoll her 15 ml'den daha fazla katmanlı olabilir.
- 600 x g'de oda sıcaklığında 30 dakika boyunca geçişlerini dönerler. 'Fren' ayarı açık olduğundan emin olun.
- Hücreler bükülmüş sonra, iki faz arasındaki arayüz için bak. PBMC nerede budur. Arayüzden PBMC'yi toplamak steril plastik transfer pipet kullanarak (bkzŞekil 1). RBC tarafından kirlenmeyi en aza indirin.
- Tüp başına en fazla 20 ml, 50 ml tüpler içinde toplandı hücreleri yerleştirin. Steril soğuk DPBS ile 50 ml kadar Üst tüp.
- 300 x g, 4 o C'de 10 dakika boyunca hücreler dönerler.
- 5 ml steril soğuk DPBS süpernatant, tekrar süspansiyon pelet atın ve bir tüpe aynı donörden tüm hücreleri havuz. Steril DPBS ile 50 ml kontör ve yıkama 2 kez daha tekrarlayın adımları.
- 10 ml RPMI-S + orta süspanse hücreleri.
- 20 ul bir kısım çıkarın ve tripan mavisi 20 ul ile karıştırılır. Pipet 10 hematositometrede ul ve canlı hücrelerin (mavi boya kadar almamış hücreler - tüm mavi hücreler ölü) saymak. Aşağıdaki gibi, bir çözelti içinde, hücre sayısını hesaplamak için bir hemositometre kullanın.
Not: hemositometre çizgilerle kapalı alan bilinen şekilde belirtilen boyutlara sahip bir ızgara yer alır.- Hemositometre temiz olduğundan emin olun. Counti üzerine lamel yerleştirinng alanı. Yük V-şekilli kuyu birine pipet yerleştirerek hücre çözeltisinin 10 ul. Lamel altındaki alan kılcal eylem tarafından dolduracaktır.
- Mikroskop altında yüklenen hemositometre yerleştirin. Haemocytometer tam ızgara 1 mm 2 Her 9 kareler içeriyor. Her büyük kare içinde tüm hücreleri saymak. Çok fazla hücre varsa, bundan başka, çözeltinin ve sayımı seyreltin.
- Aşağıda hücre konsantrasyonunu hesaplayın: Toplam hücre / mL = (kareler toplam hücre sayılan /) x seyreltme faktörü x 10.000 hücre / mi, 20 x 10,000 hücre / ml = 20 örneğin, (500 hücre / 5 kareler) x seyreltme faktörü x 10 6 hücre toplam.
- Ml başına 10 x 10 6 (RPMI-S + ortam) içindeki bir nihai konsantrasyona kadar orta ayarlayın.
7. Sıtma / HIV Co-enfeksiyon Kültürü
- Plaka izole PBMC 100 ul ve 24 oyuklu plaka (oyuk başına 1 x 10 6 PBMC) RPMI-S + ortamının 400 ul. Sağlamakkuyular üç nüsha olarak ayarlanmış olduğunu: bulaşmamış RBC 3 kuyu, PfRBC ile 3 kuyu, orta 3 kuyu ve PMA / İyonomisin ile 3 kuyu. (-) Örnek Bu, hem HIV (+) ve HIV.
- PfRBC kuyular için oyuklara (5.2 hazırlanan Parazit kültürünün 500 ul) her biri 3 x 10 6 PfRBC yerleştirin.
- Enfekte olmamış RBC kuyuları, gözlerin her bir 5,3 hazırlanan enfekte olmamış RBC kültürünün 500 ul koyun.
- Orta kuyuları, gözlerin her bir RPMI-S + ortamının 500 ul koyun.
- PMA / İyonomisin kuyuları, (/ ml 2,5 pg / ml, 250 pg) PMA / İyonomisin solüsyon hazırlanır. Her bir göze, bu çözeltiye 500 ul koyun.
Not: T hücresi sitokin salgılanması uyarıcıları, PMA ve İyonomisin hücreleri fonksiyonel sağlamak için bir pozitif kontrol olarak kullanılmıştır zamanda. - % 5 CO2 inkübatör 37 o C'de yerleştirin plakası.
- İsteğe bağlı: Bir RN içinde akım sitometri veya mağaza kullanarak fenotipik analizi için aşırı hücreleri kullanmakGelecekteki mRNA ekspresyon analizi için bir istikrar çözüm.
8. Tespit Sıtma immün cevaplar
Not: sürece 4 olarak gün boyunca ko-kültür deneyleri gerçekleştirin. Hiçbir orta değişiklik bu süre içinde gereklidir. En uygun zaman noktası ilgi hücre tipine ve sorulan soru bağlıdır. Lenfosit tepkileri en 72-96 saat sonra gözlenmiştir ise 12-48 saatlik bir inkübasyon, PfRBCs için monositik yanıtları için en uygunudur. Zaman noktaları deneysel soru dayalı optimize edilmesi gerekecektir. Bozulmamış PfRBC ve PBMC'lere arasındaki etkileşim ilgi ise kısa dönemler (2-4 saat) kullanılabilir.
- Pelet hücreleri 3 dakika boyunca 300 xg'de Spin plaka. Her kuyudan kültür süpernatanının 700 ul toplayın.
- Herhangi bir enkaz temizlemek için 5 dakika boyunca 1.000 xg'de süpernatant Spin.
- Kısım aşağıda ihtiyaç, etiket ve dondurma gibi süpernatant temizlenir -20 ° C salgılanan faktörlerin analiz zımbal olmak kadaronaylanmamis.
- ELISA veya boncuk dizisi (üreticinin tavsiye protokolleri uygulayın) tarafından sitokin / kemokin yanıtları analiz edin.
- Bir RNA çözeltisi içine stabilize edici plakalarında kalan hücrelere toplayın ve kantitatif gerçek zamanlı PCR 14-16 mRNA ekspresyon analizi için kullanmaktadır.
Kullanma Hücre-spesifik Ccytokine Tepkilerinin 9. Hücre içi Sitometrisi PBMC P. Co-kültürlenmiştir Falciparum Enfekte RBC
Not: ilgi hücre tipine bağlı olacaktır eş-kültür uzunluğu yukarıda belirtildiği gibi. Kısa bir kuluçka dönemi PfRBC için monositik yanıtlar ilgilenen varsa gereklidir. Doğal lenfosit yanıtlarının CD4 ve CD8 T hücreleri için daha uzun süre T hücrelerini, NK hücrelerini, NKT hücreleri) γδ ve Times daha uzun olacaktır. Optimizasyon gerekecektir.
- Analizden önce 6-8 saat tüm kuyulara 1,000x Brefeldin A 1 ul ekleyin. Plaka 37 o C inkübatör dönün. 6-8 saat inkubasyon sonraation, 15 dakika boyunca buz üzerinde plaka.
- Dinç pipetleme kullanarak kuyudan hücreleri çıkarmak ve etiketli microcentifuge tüpler içine koyun. Kazıma monositleri kaldırmak için gerekli olabilir.
- 1000 x g'de 5 dakika boyunca Spin hücreleri. Süpernatantlar çıkarın. 500 ul içinde süspanse hücreleri akış sitometrisi tampon maddesi (1x DPBS,% 2 ısı ile inaktive edilmiş FBS,% 0.02 sodyum azid).
- Divide hücreleri kadar böylece her örnek vardır: Tam antikor boyama (240 ul) için bir tüp, ve floresan eksi bir (FMO) kontrol antikor boyama (240 ul) için bir tüp. Kontrol sitometrisi boyanmamış akış (bu sitometresi akış ayarlama kullanılacak) için her bir örnek (20 ul) bir miktar havuz.
- 500 x g'de 5 dakika boyunca Spin hücreleri. Süpernatantlar çıkarın.
- Fc reseptörleri bloke etmek için 4 ° C'de 15 o dakika sitometrisi tampon maddesiyle 50 ul akışında Konjuge olmayan anti-insan CD16 / CD32 (5 ug / ml) ile inkübe hücreleri.
- Her tüpe akış sitometrisi tampon maddesiyle 1 ml ekleyin. Spin ce500 x g'de 5 dakika boyunca lls. Süpernatantlar çıkarın.
- Akış 50 ul içinde süspanse hücreleri sitometrisi istenilen hücre yüzey belirteçleri florofor konjuge antikor, önceden titre konsantrasyonda tampon. Tüm örnekler için ön karışım yeterince antikor çözüm lekeli edilecek. 20 dakika boyunca 4 o C'de inkübe hücreleri. Light.Note koruyun: her antikor miktarı optimize edilmesi gerekecektir. Rutin olarak CD56, CD3, γδ, CD4, CD8, CD14 için boyanır. Bu antikorların Titre edilmiş miktarları Tablo 1 'de gösterilmiştir.
- Her tüpe akış sitometrisi tampon maddesiyle 1 ml ekleyin. 500 x g'de 5 dakika boyunca Spin hücreleri. Süpernatantlar çıkarın.
- Her tüpe Cytofix / Cytoperm çözeltisi 100 ul ekle. 4 O C 'de 20 dakika boyunca inkübe hücreleri Işıktan koruyunuz.
- Kurutma / yıkama tamponu 1 ml ilave edilir - Her bir tüpe (10x konsantre olarak verilmedi GKD 2 O ile 1x seyreltilmiş). 500 x g'de 5 dakika boyunca Spin hücreleri. Süpernatantlar çıkarın.
- 100 u eklemeperma l / FMO kontrol antikor boyama tüplerine yıkama tamponu ve hücreleri tekrar süspansiyon karıştırın.
- Tam antikor boyama tüplerine arzu edilen hücre içi belirteçleri (örneğin, sitokinler / kemokinler) için florofor konjuge antikor, önceden titre konsantrasyonu ile kurutma / yıkama tamponu 100 ul ekle.
Not: her bir antikor miktarı optimize edilmesi gerekir. Biz rutin, anti-TNF ve anti-IFNy antikorları ile leke. Bu antikorların Titre edilmiş miktarları Tablo 1 'de gösterilmiştir. - 4 O ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin tüm tüpler Işıktan koruyunuz.
- Her tüpe Perm / Wash tamponu 1 ml ilave edilir. 500 x g'de 5 dakika boyunca Spin hücreleri. Süpernatantlar çıkarın.
- 300 ul içinde süspanse hücreler% 1 paraformaldehit ile tampon akış sitometrisi. HIV nötralize etmek için 15 dakika en az bekletin.
- Akış sitometresinde kurmak tazminat için kullanılacak, tazminat boncuklar kullanarak tek antikor lekeli örnekleri hazırlayın. Tazminat türüBoncuklar kullanılan antikorlar bağlıdır (yani., anti-fare Ig, anti-fare / hamsteri Ig). Vortex boncuklar. Antikor başına boncuk bir damla ekleyin. Boyama için kullanılan olarak antikorun eşit miktarda ekleyin. Akış sitometri tampon maddesiyle 200 ul ekle. Bunlar artık kullanıma hazırdır. Boncuk yıkamak için gerek yoktur.
- En kısa sürede sitometresinin ve en iyi sonuçlar için 24 saat içinde bir akış örnekleri edinin. Mümkünse biz hemen satın öneririz böylece Tandem boyalar depolama ayrışma duyarlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Grafikleri NKT hücreleri popülasyonu elde etmek CD56 +, CD3 + γδ- kapıları kullanan, NKT hücreleri IFNy üretimi (Şekil 2), seviyesini tasvir (veriler gösterilmemiştir). Hücreler boyamadan önce 72 saat süre ile kültüre edildi. Bir kez 100,000 CD3 + hücreleri sitometresi NK, NKT ve γδ hücrelerin (ilgi hücreleri) yeterince büyük popülasyonları elde etmek akışında elde edildi, boyandı. 5600 NKT hücrelerinin en az her bir grafik üzerinde gösterilir. TNF üretimi aynı şekilde elde edildi (veriler gösterilmemiştir). (-) PfRBC maruz kalanlarda grafikleri açık IFNy üretimi HIV (+), HIV ile karşılaştırıldığında bireylerden alınan hücrelerde daha düşük olduğunu göstermektedir.
Sitometri analizi Flow çok subjektiftir. Her deney için tüm uygun kontroller olması esastır (bakınız Şekil 2). Arka plan düzeyi, sitokin boyama doğru sunulmasından sağlar FMO örnekleri, kullanılarak hesaplanır.PMA / İyonomisin ile uyarılan hücreler, bir pozitif kontrol olarak kullanılmıştır (veriler gösterilmemiştir). PMA ve İyonomisin T hücresi sitokin üretimin güçlü uyarıcısıdırlar. Bu örneklerde IFNy üretiminin eksikliği olur büyük olasılıkla boyama protokolü ile bir sorunu gösterir. Ancak, bu tür hücre canlılığı ya da inaktif reaktifler gibi diğer değişkenlerin de hatalı olabilir.
PBMC'lerin konumunu gösteren Ficoll gradyan sonrası dönüş Şekil 1. tasviri.
Doğal Öldürücü T hücreleri tarafından Şekil 2. IFN γ üretimi. Akış şemaları CD56 + CD3 + γδ- hücreleri (5600 olaylarının az) üzerinde yolluk ile elde edilmiştir. (-) Ile uyarılan numunenin IFNy üretimi HIV tespit edilebilirP. falciparum kırmızı kan hücreleri enfekte. Bu sitokin yanıtı artık belirgin bir kronik HIV enfeksiyonu bağlamında olduğunu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bizim protokol en gerçekçi in vitro HIV sıtma ko-enfeksiyon incelemek üzere optimize edilmiştir. İlk olarak, taze insan eritrositler ve serum sıtma paraziti kültürü için gereklidir. Bu sıtma parazitlerinin sağlıklı bir nüfus elde etmek için hayati önem taşımaktadır. Canlı P kullanırken sitokin üretimi daha hızlı ve yoğun olarak parazit lizatları canlı parazitler için ikame edilemez falciparum RBC (PfRBC) 17,18 enfekte. Buna ek olarak, NK hücreleri gibi hücre tipleri aktivasyonu, tüm PfRBCs gerektirir ve parazit lizatları ile verimli bir şekilde çalışmaz. Bunun nedeni, PfRBC ve lökosit arasında doğrudan bir temas için ihtiyaç olabilir veya hücre yüzeyi reseptörleri 18 ile etkileşim parazit kaynaklı ligandların kararsız olmaları nedeniyle olabilir. Sıtma PfRBC kültürleri de iyi deney öncesinde (Protokol 4) senkronize olmalıdır. Senkronize PfRBCs deneysel verilerin tekrarlanabilirlik geliştirmek. Bu protokol, de rağmenscribes ko-kültür için trofozoit aşaması PfRBC kullanımı kolayca halka sahne PfRBC çalışma için modifiye edilebilir.
İnsan lökosit yapay HIV ile enfekte olabilir ve bu yöntem, sıtma-HIV ko-enfeksiyonu araştırma 20 çalışmalarında kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu, kronik HIV enfeksiyonundan sonuçlanan bağışıklık düzensizliği modeli etmez. Bu eş-kültür sistemine biz kronik HIV-1 ile enfekte olmuş insan katılımcı izole PBMC'ler kullanın. Katılımcılar bir çalışma için gerekli olan zaman, dikkatle bu nüfusu seçmek önemlidir. İçerme ve dışlama kriterleri minimum değişkenliği ve maksimum tekrarlanabilirlik sağlamak için hayati öneme sahiptir. Bizim kriterleri, kronik HIV enfeksiyonu net bir tanımını dahil ve eşzamanlı enfeksiyon olan herkes dışlama (> 50 hücre / mm 3 / yıl CD4 + T hücre sayısı düşüş ile,> 1 yıl HIV bulaşmış). Bu elde edilen sonuçlar bu yüzden isnat edilebilir sağlamıştırKronik HIV enfeksiyonunun etkisi ve başka bir enfeksiyona lely. Biz sıtma için doğuştan gelen bağışıklık yanıtları ilgilenen beri Ayrıca, önceki sıtma enfeksiyonu vardı bağışçılar hariç.
HIV ile enfekte olmayan kontrol aynı zamanda veri normalleştirme için izin vermek için her bir numune toplama noktasında, her HIV (+) donör için kullanılır. Bir girişim en azından yaş için kendi HIV (+) donör denetimleri maç için yapılmalıdır fakat tercihen de seks (her ne kadar önceki çalışmamızda 12 biz hücre alt veya kadın ve erkek arasındaki sitokin yanıtları önemli bir fark saptamadık HIV bulaşmamış katılımcı). Prospektif örnekleme her örnekleme zamanı noktası için aynı HIV ile enfekte olmayan kontrol sisteminin tasarlanmasını planlanmış ise faydalıdır. Yanıtlar PfRBCs sağlığı, senkronizasyon, parasitemia düzeyi ve PfRBCs ve olgunluk aşamasına derecelerine ve hematokrit düzeyi de dahil birçok faktörün nedeniyle deneme deney değişebilir. Özendeneyler arasında bu tutarlı gibi birçok tutmak için alınmalıdır. HIV ile enfekte olmayan kontrol normalleştirme bu değişkenler için bir muhasebe sağlar.
Taze hücreler kullanılarak yapay sonuçlardan kaçınmak için her şeyden önemlidir. Donma ve çözülme örnekleri hücre canlılığı 21,22 üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir, sitokin üretimi 23-26 ve hücre yüzey fenotipik 27 işaretleme kalemler.
Monositler özel ilgi konusudur, bu cam protokolü esnasında kullanılmaz önemlidir. Monositler cam ve diğer birçok plastik 28. yapışır. Bizim çalışma hücre popülasyonlarının gelen monosit yapışmasını ve nihai kaldırılmasını aza indirmek için boyunca polipropilen plastik pipetler, transfer pipet, ve tüpler kullanın.
Tahlilinde flow sitometri kurarken, antikorlar herhangi bir kombinasyonu ilgi hücrelere bağlı olarak kullanılabilir. Biz IFNy ve TNF üretiminin özellikle ilgiNK hücreleri, NKT hücreleri ve γδ T hücrelerinden. Bu, bir antikor paneli tanımlar. Farklı bir kombinasyonu kullanılarak, ancak, her bir panel için antikor miktarları optimize etmek için önemlidir. Bu hatalı veri önlemek için hayati önem taşımaktadır. (-) Ve HIV (+), Şekil 2 HIV () Ayrıca, geçerliliğini değişkenliği önlemek ve sağlamak, FMOs her koşul (RBC, PfRBC, orta ve PMA / İyonomisin) ve katılımcı nüfus için plan sitokin düzeylerini değerlendirmek gerekmektedir. In vitro hücre sitokin üretimi Ölçüm genellikle hücrelerin boyamadan önce kültüre edilmiş, özellikle yüksek arka plan seviyelerinde sonuçlanır. Kültür koşulları arka plan düzeylerini etkileyen bu yana, uygun FMOs her bir numune için plan düzeyinde bilgi sağlamak. Hücrelerin Tedarik nedenle tüm yüzey lekeleri ancak hücre içi lekeleri içermeyen bizim FMOs tasarlanmış, sınırlı oldu. Bu çalışılan tüm farklı hücre tipleri ile ilgili sitokin arka plan seviyelerinde spesifik karşılaştırma sağlar.Biz de onların arka plan seviyelerini teyit etmek için yüzey belirteçlerinin her Deneme başına tek leke koştu.
Açıklanan protokol ilgi hücrelere bağlı olarak saat veya gün içinde yanıt incelemek için kullanılabilecek bir çok yönlü bir biridir. Doğuştan gelen lemfositler optimal PfRBC sebep olduğu sitokin üretimi sağlamak için, 2 ya da 3 gün sonra çıkış akış sitometrisi ölçüldü. Monositler bakarken, daha önceki zaman noktaları (1 veya 2 gün) önerilir. Bu sistem, çıkarılan RNA olarak değerlendirilmesi gereken çok sayıda hücre türleri ve hücre yanıtlarının akışı ile ayırt edilmesi sitometrisi salgılama tepkileri hücre süpernatantlan içinde ölçülecek ve sentezleme profilleri ile karşılaştırın. Bundan başka, antikorların kullanımı belirli reseptörleri bloke eden ya da sitokinler daha mekanizmaları incelemek için, bu sistemde de kullanılabilir nötralize etmek. Başarıyla PfRBC kaynaklı IFNy yanıtları 12, IL-18 reseptörünü bulaştırmak için, IL-18 reseptör blokajını kullandık. Bu sistem, bir realist temsilHIV enfeksiyonu bağlamında sıtmaya karşı doğal immün yanıtların sayısını belirlemek için hangi ic yöntemi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alanine | Sigma | A7377 | |
| antibodies (see other table) | |||
| BD Cytofix/Cytoperm with BD GolgiPlug | BD | 555028 | includes brefeldin A, cytofix/cytoperm buffer and perm/wash buffer |
| BD Vacutainer ACD Solution A | BD | 364506 | |
| BD Vacutainer Sodium Heparin | BD | 17-1440-02 | |
| DPBS (no calcium, no magnesium) | Corning | 21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F1051 | heat inactivate before use |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| gentamycin (10 mg/ml) | Gibco | 15710-064 | |
| Hema3 Staining Set | Fisher | 122-911 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| hypoxanthine | Sigma | H9636 | |
| Ionomycin | Sigma | I3909 | |
| MEM non-essential amino acids (10 mM) | Gibco | 11140 | |
| PMA | Sigma | P8139 | |
| RPMI-1640 powder | Life-Technologies | 31800-022 | |
| RPMI-1640 with L-glutamine and HEPES | Thermo Scientific | SH30255.01 | |
| sodium bicarbonate (powder, cell culture) | Sigma | S5761 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360 | |
| Tris (Trizma base) | Sigma | T6066 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| Trypan Blue (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| BD CompBead | BD | 552843, 552845 | depends on antibodies used |
| Parasite Gas Mixture | By special order | 3% CO2, 1% O2, balance N2 | |
| Equipment | |||
| 0.2 μm filter unit | |||
| Glass slides | |||
| T25 flasks | |||
| T75 flasks | |||
| 50 ml tubes | |||
| 24 well culture plates | |||
| unplugged Pasteur pipettes | |||
| plugged Pasteur pipettes | |||
| sterile transfer pipettes | |||
| hemocytometer | |||
| flow cytometer (3 laser) | |||
| Antibodies used for flow cytometry | |||
| Anti-TNF | eBiosciences | 551487 | FITC (fluorophore) 2 μl |
| Anti-IFNγ | Biolegend | 506507 | PE (fluorophore) 20 μl |
| Anti-CD8 | Biolegend | 300914 | PE-Cy7 (fluorophore) 1 μl |
| Anti-CD14 | Biolegend; BD Biosciences | 325624; 551487 | Biotin (fluorophore) 0.5 μl Streptavin PE-TR (fluorophore) 0.1 μl |
| Anti-CD56 | Biolegend | 318322 | PerCP/Cy5.5 (fluorophore) 5 μl |
| Anti-γδ | Biolegend | 331212 | APC (fluorophore) 5 μl |
| Anti-CD3 | Biolegend | 300426 | APC-Cy7 (fluorophore) 5 μl |
| Anti-CD4 | Biolegend | 317424 | Pacific Blue (fluorophore) 1 μl |
References
- Graham, A. L., Cattadori, I. M., Lloyd-Smith, J. O., Ferrari, M. J., Bjørnstad, O. N. Transmission consequences of coinfection: cytokines writ large. Trends in parasitology. 23 (6), 284-291 (2007).
- French, N., et al. Increasing rates of malarial fever with deteriorating immune status in HIV-1-infected Ugandan adults. AIDS (London, England). 15 (7), 899-906 (2001).
- Hoffman, I. F., et al. The effect of Plasmodium falciparum malaria on HIV-1 RNA blood plasma concentration. AIDS (London, England). 13 (4), 487-494 (1999).
- Kamya, M. R., et al. Effect of HIV-1 infection on antimalarial treatment outcomes in Uganda: a population-based study. The Journal of infectious diseases. 193 (1), 9-15 (2006).
- Kublin, J. G., et al. Effect of Plasmodium falciparum malaria on concentration of HIV-1-RNA in the blood of adults in rural Malawi: a prospective cohort study. Lancet. 365 (9455), 233-240 (2005).
- Mermin, J., et al. Effect of co-trimoxazole prophylaxis, antiretroviral therapy, and insecticide-treated bednets on the frequency of malaria in HIV-1-infected adults in Uganda: a prospective cohort study. Lancet. 367 (9518), 1256-1261 (2006).
- Patnaik, P., et al. Effects of HIV-1 serostatus, HIV-1 RNA concentration, and CD4 cell count on the incidence of malaria infection in a cohort of adults in rural Malawi. The Journal of infectious diseases. 192 (6), 984-991 (2005).
- Whitworth, J., et al. Effect of HIV-1 and increasing immunosuppression on malaria parasitaemia and clinical episodes in adults in rural Uganda: a cohort study. Lancet. 356 (9235), 1051-1056 (2000).
- Xiao, L., Owen, S. M., Rudolph, D. L., Lal, R. B., Lal, A. A. Plasmodium falciparum antigen-induced human immunodeficiency virus type 1 replication is mediated through induction of tumor necrosis factor-alpha. The Journal of infectious diseases. 177 (2), 437-445 (1998).
- Francesconi, P., et al. HIV, malaria parasites, and acute febrile episodes in Ugandan adults: a case-control study. AIDS (London, England). 15 (18), 2445-2450 (2001).
- Finney, C. A. M., et al. HIV infection deregulates Tim-3 expression on innate cells: combination antiretroviral therapy results in partial restoration. Journal of acquired immune deficiency syndromes. 63 (2), 161-167 (2013).
- Finney, C. A. M., et al. HIV infection deregulates innate immunity to malaria despite combination antiretroviral therapy. AIDS (London, England). 27 (3), 325-335 (2013).
- Ljungstrom, I., et al. Methods in Malaria Research. , 4th edition, MR4/ATCC. Available from: http://www.mr4.org/Publications/MethodsinMalariaResearch.aspx (2013).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M.
- Universal SYBR green quantitative PCR protocol [Internet]. , Available from: http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/sybr-green-qpcr.html (2014).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-DDCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Hensmann, M., Kwiatkowski, D. Cellular basis of early cytokine response to Plasmodium falciparum. Infection and immunity. 69 (4), 2364-2371 (2001).
- Artavanis-Tsakonas, K., Riley, E. M. Innate immune response to malaria: rapid induction of IFN-gamma from human NK cells by live Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. J Immunol. 169 (6), 2956-2963 (2002).
- Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. The Journal of parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).
- Ludlow, L. E., et al. HIV-1 inhibits phagocytosis and inflammatory cytokine responses of human monocyte-derived macrophages to P. falciparum infected erythrocytes. PloS one. 7 (2), e32102 (2012).
- Weinberg, A., et al. Viability and functional activity of cryopreserved mononuclear cells. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7 (4), 714-716 (2000).
- Fowke, K. R., Behnke, J., Hanson, C., Shea, K., Cosentino, L. M. Apoptosis: a method for evaluating the cryopreservation of whole blood and peripheral blood mononuclear cells. Journal of immunological. 244 (1-2), 139-144 (2000).
- Jeurink, P. V., Vissers, Y. M., Rappard, B., Savelkoul, H. F. J. T cell responses in fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells: kinetics of cell viability, cellular subsets, proliferation, and cytokine production. Cryobiology. 57 (2), 91-103 (2008).
- Kvarnström, M., Jenmalm, M. C., Ekerfelt, C. Effect of cryopreservation on expression of Th1 and Th2 cytokines in blood mononuclear cells from patients with different cytokine profiles, analysed with three common assays: an overall decrease of interleukin-4. Cryobiology. 49 (2), 157-168 (2004).
- Venkataraman, M. Effects of cryopreservation of immune responses. XI. Heightened secretion of tumor necrosis factor-alpha by frozen human peripheral blood mononuclear cells. Cryobiology. 34 (3), 276-283 (1997).
- Venkataraman, M. Effects of cryopreservation on immune responses. X. Decrease in interleukin-12 production by frozen human peripheral blood mononuclear cells is mediated by the endogenously hypersecreted interleukin-10. Cryobiology. 33 (5), 581-588 (1996).
- Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7 (3), 352-359 (2000).
- Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. Journal of leukocyte biology. 56 (3), 236-240 (1994).
