Summary
ערוצים להובלה של מולקולות מים באנזימים להשפיע solvation אתר פעיל וקטליזה. במסמך זה אנו מציגים פרוטוקול להנדסה של מוטיבים אלה נוספים קטליטי המבוססים על מודלים במחשב סיליקון וניסויים. זה ישפר את ההבנה של ההשפעה של דינמיקת ממס על קטליזה אנזימנו.
Introduction
מים מהווים אבן פינה לכימיה של החיים 1. דפוסי מים וsolvation של אתרים פעילים של אנזים להשפיע הן על אנתלפיה והאנטרופיה של יגנד מחייב 1,2 וקטליזה 3 באופנה מורכבת ביותר המשתרעת מעבר להשפעה הידרופובי 2,3. 4 NMR, calorimetry 2 והדמיה מולקולרית של חלבוני solvated שימשו לשפוך אור על התפקיד של מולקולות מים מפורשות במתן כוח מניע לעמותת יגנד 5-8, סגוליות ופעילות 2,9,10. במסמך זה אנו מציגים מתודולוגיה ייחודית להערכה הניסיונית של השפעת התרמודינאמיקה של עקירת ממס על קטליזה אנזים (איור 1). האסטרטגיה המשולבת שלנו מבוססת על שימוש בהדמיות מחשב בתיאום עם הנדסת אנזים וניתוח תרמודינאמיקה (איור 1). זה מאפשר לשופך אור נוסף על ההשפעה של דינמיקת ממס על CATAתמוגה, אשר כיום הוא הבין היטב.
ייצוב אינטראקציות enthalpic, הניתנות על ידי קשרי מימן בתיווך מים באתרים פעילים של אנזים solvated, יכול להתקזז על ידי עונשי entropic 1. עלויות entropic אלה הקשורים לירידה בדרגות חופש המוצג על ידי מולקולות מים מוגבלות בתוך חללי חלבון, בהשוואה למים בכמויות גדולה 5. השחרור של מולקולות מים הורה יכול כך לספק כוח מניע אנטרופי לעמותת יגנד 1 וקטליזה 3. היבט מרכזי של דינמיקת ממס הוא העקירה של מולקולות מים בין הפנים של חלבונים והממס החיצוני 4. השינויים הנלווים באנרגיית הפעלה, אנתלפיה, אנטרופיה ו11 אינם מובן לחלוטין ברמה המולקולרית. על ידי שיבוש מנהרות פרט אחראית להובלת מים באנזימים, את החשיבות של דינמיקת ממס ותרומתה להפעלהאנרגיה יכולה להיות מוערכת (איור 1). יתר על כן, על ידי ביצוע ניסויים הקינטית בסיר אחד בטמפרטורות שונות, הפרמטרים הפעלת תרמודינאמיקה היחסי של כמה מצעים ניתן לחלץ ממספר מופחת של ניסויים (איור 1, מימין). השיטה בין-תחומית שלנו תוקף לאנזימי קרום הנכנס מורכבים cyclase triterpene שיוצרים terpenes polycyclic חשיבות גבוהה לכל חיים 12. הפרוטוקול מאפשר להתאוששות של כמויות חלבון גבוהות קרום של (10-20 מ"ג / ליטר) באמצעות צנטריפוגות סטנדרטית.
למרות שהאנזימים התפתחו במים, את התפקיד של הממס בקידום קטליזה בדרך כלל מוזנח. בנוסף לדינמיקת חלבון 13,14 שצורה מאורגנת מראש אתרים פעילים עם השלמה אלקטרוסטטי למדינת המעבר 15, דינמיקת מים יכולה להיות בעל חשיבות גבוהה לקטליזה אנזים היעילה. על ידי זיוף כמה טכניקות רב תחומיים,מטרה היא להקל על המחקר המורכב ביותר של דינמיקת מים ותרמודינמיקה. מה שהופך את הכלים הללו לנגישים יותר לקהילה המדעית יוביל לפיתוח אסטרטגיות חדשות בהנדסה ועיצוב אנזים חלבון לפעילות וספציפיות שונות.
Protocol
דוגמנות 1. סיליקו מחשב
- הורד מבנה PDB של החלבון של עניין מבנק נתונים חלבון (PDB). הכן את המבנה על ידי הסרת עודפים תת-יחידות ולאחר מכן הוספת אטומי מימן חסר וממס מפורש באמצעות "ניטרול הסלולרי ו- p K חיזוי" ניסוי בYASARA 16. לcyclases triterpene קרום מחויב, מידות מתאימות של תיבת המים 91x67x77 Å. התאם את מדינת protonation של חומצות אמינו catalytically הפעילים באופן ידני.
הערה: במידת צורך, אנלוגי מצע בקובץ PDB יכול להיות שונה כדי מצע אמיתי באמצעות "ערוך | החלפה | Atom" הפקודה. - למזער את המבנה על ידי הפקודה "אנרגיה מזעור" באמצעות חבילת שדה כוח AMBER 17. השתמש בגישת רשת חלקיקי אוואלד (PME) 18 כדי להסביר אינטראקציות אלקטרוסטטיות ארוך טווח. הגדר את חתוכים לאינטראקציות אן דר ואלס פילהגדרות סטנדרטיים.
הערה: הפקודה "אנרגיה מזעור" מסירה לחץ קונפורמציה ידי מזעור קצר התלול ירידה, אז חישול מדומה (timestep 2 fsec, מהירויות אטום scaled למטה על ידי 0.9 כל צעד -10) מתבצעת עד להתכנסות (כלומר, שיפור של אנרגיה בפחות מ 0.012 קלוריות / mol לכל אטום ב200 מדרגות).
2. דגם של אתר פעיל solvation וגישה מים
- לאחר חישול המדומה, לרוץ מסלול 20 דינמיקה מולקולרית NSEC (MD) וליצור לפחות 10 תמונות על ידי "קובץ | הסימולציה Snapshot | שמור בשם" הפקודה ואחריו "סימולציה ב". הפעל את ההדמיות במחשב סטנדרטי עם תנאי שפה מחזוריים תחת הרכב הקנונים. לשמור על הטמפרטורה ב298 K באמצעות תרמוסטט Berendsen.
- הכן את התמונות המתקבלות מ2.1 על ידי מחיקה כל מולקולות המים וligands / מצעי סופו של דבר באמצעות4; עריכה | מחק | שאריות "פקודת Superpose כל תמונה בנפרד על PDB-המבנה המקורי על ידי." Superpose | פקודת אובייקט "כדי להבטיח שכל המבנים חולקים את אותה מיקום המרחבי חוסכים כל תמונה שהוכנה בדרך זו כPDB חדש. -file (באמצעות "הקובץ | שמור כ| PDB" הפקודה).
הערה: בוני מודלים מנוסים: כתיבת תסריט כדי להפוך את התהליך הזה על פי תבנית נתונה בקובץ קוד משלים 1. - השתמש בתמונות מוכנות (PDB) מ -2.2 כי כבר מיושר ב3D-החלל כתשומות למערן תוכנת 3.0 19. לניתוח של מספר מוגבל של תמונות, לרוץ מערן במחשב סטנדרטי. השתמש ברדיוס של 0.7 בדיקה של 19 כדי להבטיח איתור מנהרות שהם ספציפיים להובלה של מולקולות מים.
- דמיינו את המנהרות שנוצרו על ידי מערן 3.0 בתוכנת גרפיקה מולקולרית. להדמיה קלה של מנהרות, להשתמש במאקרו מוצג במשלים הקוד Filדואר 2.
3. סיליקו אנזים הנדסה לשינוי דפוסי מים וDynamics המים
- זהה את המנהרות מדורגות הגבוה ביותר על פי "תעודת הזהות" הכותרת הרשומה ב" summary.txt "קובץ פלט שנוצר מהתוכנה מערן 3.0.
- לזהות חומצות אמינו המצפים את המנהרות מדורגות הגבוה ביותר (3.1) ותצוגה שצד שרשרת קטנה והצביעה לעבר הפנים ערוץ על ידי בדיקה ויזואלית (באמצעות המודל המתקבל מ2.4). לזהות החלפות חומצת אמינו בודדות שתחסומנה את המנהרה על ידי הפרעה סטרית מוגברת באמצעות הפקודה "שאריות החלפה". ודא שהמנהרה חסומה על ידי בדיקה ויזואלית, ולאחר מכן על ידי חזרה על שלבי 1.2-3.1 של הפרוטוקול.
4. ביטוי של גנים שעבר מוטציה
- להציג מוטציות בגן הפראי-ידי סוג mutagenesis PCR באמצעות פריימרים שאינם חופפים 20.
- להוסיף DNA פלסמיד המכיל את הגן של עניין לצינורים עם תאים המוסמכים של מתח שיבוט מתאים ודגירה על קרח למשך 30 דקות. לבצע שינוי הלם חום במשך 45 שניות באמבט מים עם הטמפרטורה שנקבעה ל -42 מעלות צלזיוס. הוסף 500 μl של מדיום עשיר טרי (2YT, tryptone L / 16 גרם, 10 גרם תמצית / L שמרים, 5 גר '/ L NaCl) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 200 סל"ד במשך 45 דקות. לבצע בחירה על ידי ציפוי התאים הפכו על צלחות אגר בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה.
- לאחר אימות רצף ה- DNA של הגן שעבר מוטציה, להפוך את ה- DNA פלסמיד לזן ביטוי באמצעות הלם חום כפי שתואר לעיל. לביטוי של cyclases triterpene קרום מחויב, להשתמש BL21 (DE3).
- התחל 5 O מיליליטר תרבות / N על 37 מעלות צלזיוס של זן הביטוי ב2YT-מדיה בתוספת האנטיביוטיקה המתאימה.
- לחסן בקבוק לנער מבולבל 2 L, המכיל 300 מיליליטר 2YT-מדיה בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה, לOD סופי של .05-.09 (נמדד ב 600 ננומטר). לאחר האינדוקציה בOD של .6-0.8 וביטוי חלבון, להקפיא את התא גלולה ולאחסן ב -80 ° C.
- לcyclases triterpene קרום הנכנס בוקטור pD861, לגרום לעם 0.5 2 מ"מ rhamnose ו -4 שעות של ביטוי על 37 מעלות צלזיוס כדי להשיג תשואות גבוהות של חלבון 21.
5. ממברנה חילוץ באמצעות צנטריפוגה רגילה וטיהור חלבון
- הכן את המאגרים הבאים: חיץ Resuspension (100 פוספט אשלגן מ"מ, pH 7.5 בתוספת לוחות מעכבי פרוטאז), חיץ דטרגנט (1% (V / V) Triton X-100, פוספט אשלגן 50 מ"מ, pH 7.5) ומאגר תגובה (0.2 % Triton X-100, 50 מ"מ פוספט אשלגן, pH 7.5).
- לcyclases הסקוואלין-hopene או אנזימי קרום נכנסים אחרים עם אופטימלי pH נמוך יותר, להחליף את פוספט אשלגן במאגר resuspension עם ציטראט. לאנזימים כגון להשתמש במאגרים הבאים: חיץ דטרגנט (1% Triton X-100, 60 מ"מ ציטראט, pH 6.0) ומאגר תגובה (0.2% Triton-X 100, 60 מ"מ ציטראט, pH 6.0).
הערה: אם-תג משמש לטיהור, להשלים את חיץ resuspension עם 20 מ"מ imidazole (ריכוז סופי).
- לcyclases הסקוואלין-hopene או אנזימי קרום נכנסים אחרים עם אופטימלי pH נמוך יותר, להחליף את פוספט אשלגן במאגר resuspension עם ציטראט. לאנזימים כגון להשתמש במאגרים הבאים: חיץ דטרגנט (1% Triton X-100, 60 מ"מ ציטראט, pH 6.0) ומאגר תגובה (0.2% Triton-X 100, 60 מ"מ ציטראט, pH 6.0).
- לשקול תא גלולה קפוא בכוס זכוכית. Resuspend תאי חיץ resuspension באמצעות homogenizer לריכוז סופי של 0.3 תאים גרם / מיליליטר. Lyse תאי resuspended ידי ultrasonication עם משרעת של 80% ודופק של 1 שניות על ושניות 1 מ. להשתמש בשלושה מחזורים חוזרים של 50 שניות כל אחד.
- הוסף חוצץ חומר ניקוי לריכוז סופי של 0.2% (V / V) חומר ניקוי. לאזן עד הסוף-על-סוף הערבוב על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. לשחזר את חלק חלבון קרום ידי שמירת supernatant אחרי צעד אחד צנטריפוגה ב39,000 XG במשך 50 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
הערה: אם משמשת לטיהורו-התג, להוסיף כ 1.5 מיליליטר Ni-נת"ע agarose תאים / g ודגירה עבור שעה 1. - לבצע טיהור ראשונהצעד אחר או חילוף יונים או-תג טיהור 21. להשלים את מאגרי האיזון וelution עם 0.2% Triton X-100. לרכז את החלבון מטוהר חמש פעמים באמצעות יחידות מסנן צנטריפוגלי עם חתך של 10 kDa.
הערה: הגודל של טריטון X-100 תוצאות מיצלות בריכוז של חומר ניקוי לריכוז סופי של כ 1%. - לסיים טיהור על ידי צעד ליטוש סינון ג'ל באמצעות החלבון המרוכז ומטריצה תואמת עם מגוון חלוקה לחלבונים כדוריים של 2 × 10 × 10 4 -8 6. השתמש במאגר התגובה כחיץ פועל. למדוד את כמות החלבון מטוהר על ידי שימוש בערכת Ultra רדפורד פי הפרוטוקול של היצרן.
6. קינטיקס
- הפוך 5 פתרון טרי מ"מ מניות של מצע במאגר תגובה. להשיג תחליב הומוגנית על ידי ultrasonication במשרעת של 30% במשך 2-5 דקות.
- לאזן thermomixerבטמפרטורת התגובה הרצויה. ודא את הטמפרטורה בתוך מים המכילים בקבוקון זכוכית על ידי מדחום חיצוני.
- לקינטיקה יחיד מצע, לדלל את מצע תחליב ללפחות חמש צלוחיות זכוכית לאותו ריכוז המצע סופי.
- לקינטיקה היחסית בסיר אחד עם מצעים מרובים, להכין לפחות חמש צלוחיות זכוכית זהות על ידי ערבוב כל מצעים בכל בקבוקון. לtriterpenes הידרופובי, להשתמש ריכוזי מצע סופיים בטווח של 10-200 מיקרומטר.
- Preincubate בקבוקוני הזכוכית בthermomixer במשך 10 דקות. להתחיל את התגובה על ידי הוספת האנזים. סך נפח תגובה של 1 מיליליטר מתאים. השתמש במהירות רועדת של לפחות 1,200 סל"ד.
- עצור את התגובות בנקודות זמן שונות על ידי הוספת 500 ethylacetate μl ממוסמר עם 100 מיקרומטר decanol כתקן אינטגרציה.
7. הפקה וניתוח תרמודינמיים
- חלץ את תערובות תגובה על ידיvortexing ורועד ידני בקבוקוני זכוכית מרץ דקות 1. צנטריפוגה בקבוקוני הזכוכית ב9,600 XG בצנטריפוגה בראש טבלה במשך 10 דקות ב RT. מעבירים את השכבה העליונה (שלב אורגני) לשפופרת ריקה. להוסיף 500 μl נוסף של ממס חילוץ לצינורות התגובה ולחזור על תהליך החילוץ.
- ייבש את תערובות תגובת חילוץ עם Na 2 SO 4. וורטקס למשך 5 שניות ולתת את הצינורות לנוח במשך 10 דקות. לבצע צעד צנטריפוגה סופי ב9,600 XG ל1 דקות ב RT באמצעות צנטריפוגות בראש הטבלה. העברת הדגימות שחולצו לגז כרומטוגרפיה בקבוקונים (GC).
- חזור על השלבים תחת 6.1-7.2 לכל גרסת אנזים של עניין, תוך שימוש בלפחות ארבעה ריכוז שונה ראשוני של המצע (לקינטיקה מצע היחידה) וארבע טמפרטורות שונות (לשניהם מצע יחיד וקינטיקה תחרותית).
- לבצע GC-ניתוח כפי שתואר בעבר 3. השתמש בעמודה שאינה קוטבית לניתוח hydrophobמוצרי pentacyclic IC. הגדר את טמפרטורת התנור הראשונית עד 120 מעלות צלזיוס ולהשתמש שיפוע טמפרטורה של 5 מעלות צלזיוס / דקה, תלוי במוצרים והעמודה.
- לשלב את אזורי השיא של המוצר (ים) ולהפוך את אזורי השיא של המוצר אל ריכוזי המוצר המתאימים על ידי ניצול השטח של האינטגרציה סטנדרטית (המקביל ל 100 מיקרומטר). עלילה הריכוז של כל מוצר ([טז]) לעומת זמן התגובה (T). בצע רגרסיה ליניארית של נקודות הנתונים המתאימות להמרה פחות מ -10%. מהירות התגובה הראשונית (V 0) ניתנת על ידי השיפוע של הקו המצויד על פי:
הערה: קינטיקה היחסית בסיר אחד עם מצעים מרובים, V 0 הוא השיעור הראשוני של מצע מסוים תחת השפעה של מצעים אחרים. - לקינטיקה מצע היחידה, V העלילה 0 K לכאורה החתול / ערך K M ניתן על ידי השיפוע של חלק הליניארי של הגרף על פי:
[S] הוא הריכוז של מצע ו[ E] הריכוז של אנזים המשמש בשינוי. K החתול / K M משווה ל קבוע קטליטי מעל קבוע מיכאליס. חזור על הניתוח עבור כל טמפרטורה וכל גרסת אנזים. - לקינטיקה מצע היחידה, לבצע ניתוח תרמודינמיים על פי תיאוריית מצב מעבר 22
k B הוא קבועות, שעות הקבוע בולצמן, T של פלאנק הטמפרטורה בקלווין, ו- R קבוע הגז. לבצע ניתוח רגרסיה ליניארית של העלילה של ln ((k
הערה: כמו כן, ניתוח תחת ריכוז מצע להרוות יכול להתבצע באמצעות k חתול כשיעור קבוע במשוואה 3. - לקינטיקה היחסית בסיר אחד עם מצעים מרובים, להשיג לכאורה ביחס
חתול k / ערכי K M מ -23:
(K חתול / K M) / (k חתול / K M) B = V 0, A / V 0, B * [B] / [] (4)
שלV 0, מתייחס לשיעור הראשוני למצע בתחרות עם מצע ב ' - לקי היחסי בסיר אחדnetics עם מצעים מרובים, לקבל את הפרמטרים תרמודינמיים היחסי של הפעלה עבור B, לעומת כהתייחסות, על ידי רגרסיה ליניארית:
- לחשב את הפרמטרים הפעלה מוחלטים למצע B מאנתלפיה ההפעלה והאנטרופיה של מתחם התייחסות:
Representative Results
החשיבות של דינמיקת מים בקטליזה polycyclization האנזימטית היא מעורבת בניתוח סיליקון והדמיה הבאה של מנהרות זוהו (באמצעות התסריט במשלים קוד קובץ 2). בעקבות סעיף 3 לפרוטוקול, S168 נמצא להיות שאריות "נקודה חמה" חומצת אמינו המצפים אחת המנהרות באנזים cyclase triterpene מacidocaldarius Alicyclobacillus (איור 1, באמצע משמאל). על ידי החדרת S168F המוטציה בסיליקון ו, המנהרה חסומה כפי שניתן לראות על ידי בדיקה ויזואלית (איור 1, למטה משמאל).
שיעור התגובה ליצירת מוצרי polycyclic מוצגים על ידי אנזים cyclase triterpene הוא רגיש מאוד לטמפרטורה (איור 2 א). בעקבות הפרוטוקול (סעיף 4-7), נמצא כי לכאורה k חתול / K
מהפרמטרים הקינטית נקבעו באופן ניסיוני, מגרשי תרמודינאמיקת יניארי מופקים על ידי משוואה 3 ועל ידי ביצוע החתך 6-7 של הפרוטוקול לקינטיקה היחידה מצע (איור 2). השינויים גדולים מאוד באנטרופיה ההפעלה ואנתלפיה נצפו עבור גרסאות מחסה מנהרות חסומות מרמזים תפקיד מפתח לדינמיקת מים בקידום מפל polycyclization (איור 2 ג, חישובים הבוסס על איור 2). יתר על כך, גרסאות עם מנהרות מים שינו להציג אנרגיה חופשית גיבס שינתה הפעלה (‡ Δ G = Δ H ‡ - T * Δ S ‡, איור 2 ב-ג). לדוגמא, ב303 K גרסת מנהרת S168F מציגה אנרגיה חופשית גיבס הפעלה של 14 קלוריות / mol לעומת 16 קלוריות / mol לאנזים wild-type.
בעקבות הפרוטוקול בסעיף 7, משוואה 4 מאפשרת לחישוב חתול / ערכי K M k לכאורה למצעים נוספים מניסויים הקינטית בסיר אחד (איור 3 א). יתר על כן, עלילה ליניארית תרמודינמיים (איור 3) ניתן לבנות על ידי הפעלת המסה התחרות בטמפרטורות שונות (משוואה 5). באנלוגיה לקינטיקה מצע היחידה, אנתלפיה היחסית ההפעלה ואנטרופיה למצעים נוספים בהשוואה למתחם התייחסות הן readily נגיש מליירט ושיפוע ליניארי מתאים לנתוני ניסוי. ערכים מוחלטים של פרמטרים תרמודינמיים של הפעלה ניתן להעריך מחיבור אריתמטי על ידי שימוש בנתונים תרמודינמיים הקשורים למתחם ההתייחסות (משוואה 6). שימוש בפרוטוקול במסמך זה, שנוצר תוצאות מראות בבירור כי אנזים קרום גרסאות עם מנהרות מים חסמו להציג פרמטרים תרמודינמיים שונים במהותו של הפעלה למצעים בגדלים שונים (איור 3 ג).
סיכום 1. פרוטוקול איור:. במודלים ממוחשבים סיליקון בתיאום עם עיצוב חלבון ניסיוני וניתוח תרמודינמיים מאפשר להבנה משופרת של ההשפעה של דינמיקת ממס על קטליזה אנזים אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
פרמטרים תרמודינמיים של איור 2. הפעלה של wild-type ומנהרת גרסאות מקינטיקה המצע יחידה. () k לכאורה חתול / ערכי K M מתקבלים מנתוני ניסוי ועל ידי השימוש במשוואות 1 ו -2 ניתוח תרמודינאמיקה (ב) באמצעות תיאוריית מצב מעבר ובכושר ליניארי של נתונים הניסיוניים למשוואה 3. פרמטרים (C) תרמודינמיים של הפעלה מחושבים מהמגרשים ב( B). מצע הסקוואלין prefolded מוצג עם אגרות חוב נוצר / נשבר כקווים מקווקווים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
"1"> 
פרמטרים תרמודינמיים של איור 3. הפעלה של גרסאות wild-type ומנהרה למצעים שונים. () k יחסית חתול / ערכי K M מתקבלים מקינטיקה אחד-סיר באמצעות משוואת 4. (ב) מגרשי תרמודינאמיקה של נתונים קינטית בשונה טמפרטורות באמצעות משוואה 5. (ג) פרמטרים תרמודינמיים מוחלטים של הפעלה מחושבים על ידי משוואה 6 ועל ידי שימוש בהסקוואלין המצע באיור 2 כהתייחסות. אגרות חוב שנוצר / נשברו במצעים מוצגים כקווים מנוקדים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
השלבים הקריטיים ביותר בהשגת נתונים תרמודינאמיקה ניסיוניים באיכות גבוהה עבור גרסאות אנזים קרום ומנהרת wild-type הם: 1) דור של דגם המחשב; 2) חלבונים מטוהרים הומוגנית; 3) מניות מצע תחליב; בקרת טמפרטורה במהלך קינטיקה 4); 5) מיצוי של תערובות תגובה באמצעות תקן פנימי.
הדור של דגם המחשב הוא הקל מאוד על ידי השימוש בתוכנה עם ממשק ידידותי למשתמש התומך במגוון רחב של פלטפורמות. לפיכך, פרוטוקול זה מבוסס על חבילת דוגמנות YASARA 16 לעשות את האסטרטגיה שלנו לנגישה גם לדוגמנות אינה מומחים. דגם מחשב לזיהוי מנהרת מים אידיאלי צריך להיות מבוסס על מבנה הגבישי של האנזים של עניין 24. לצורך כך, העושר של מבנים גבישיים זמין במאגר החלבון הוא מאוד מועיל. מניסיוננו, היבט מרכזי בהכנה המוצלחת של TEMצלחות לזיהוי מנהרה היא לשמור מים קריסטלוגרפיים. זה הוא בעל חשיבות שווה להשתמש בתיבת אנזים solvated בעת ביצוע סימולציות דינמיקה מולקולריות, אשר ניתן להפעיל במחשב רגיל. Cyclase triterpene מacidocaldarius Alicyclobacillus הוא יציב במים במהלך סימולציות MD 3. עם זאת, שמירה על חומרי ניקוי קריסטלוגרפיים ו / או שימוש במחק קרום התא הייתה אולי תידרש לאנזימים שעלולים להיות לא יציבים, כדי לאפשר סימולציות MD מורחבות. הוא חזה כי המבנה הגבישי הממוזערים של מטרות מאתגרות ביותר יכול לספק תובנה מכניסטית חשוב באמצעות הפרוטוקול, למרות שזה לא הייתי ללכוד היבטים הדינמיים של ארגון מנהרה.
מערן 19 במצב הבסיסי, עם אחת או במספר מצומצם של תמונות כקלט, ניתן להשתמש באינו מומחים במחשב נייד סטנדרטי. בהתבסס על הניסיון שלנו 3, מנהרות עם רדיוס צוואר בקבוק (כלומר, הרדיוסבנקודה הצרה ביותר) קטן יותר מאשר 1 יכול להיות רלוונטי מאוד למים, במיוחד אם מולקולות מים קריסטלוגרפיים מתגוררות בתוך המנהרה ניבאה (איור 1, באמצע משמאל). מצד השני, רדיוס צוואר בקבוק גדול יותר יכול לרמוז מנהרה לתחבורה של המצע ובמתוך האתר הפעיל 10. התסריט במשלים קוד קובץ 2 יכולים להיות בשימוש על ידי שאינם מומחים להדמיה של מנהרות חזו. ניסויים עתידיים יגלו אם מודלים הומולוגיה יהיו גבוהה מספיק רזולוציה כדי לאפשר מחקר האטומי של רשתות מים ודינמיקה. שופך אור על אופן ביצוע סימולציות דינמיקה מולקולריות, עם ובלי יגנד נוכחי באתר הפעיל, משפיע על התהליך של זיהוי מנהרה יהיה גם בעל חשיבות.
קינטיקה של חלבוני קרום יכולה להוות אתגר עצום 25. הפרוטוקול במסמך זה מבוסס על פרוטוקול חילוץ קרום פשוטכדי לקבל את אנזים הקרום ללא שימוש בציוד יקר, כגון ultracentrifuge. השימוש בסינון ג'ל כצעד ליטוש סופי מסיר חלקיקי קרום שייר פוטנציאליים ומאפשר להגדרת סביבת חומר ניקוי מתאימה 25.
היבט מרכזי בהשגת תוצאות הקינטית לשחזור מהפרוטוקול הוא חלב את פתרון מניות מצע על ידי ultrasonication. vortexing הפשוט של מצעים הידרופובי מדוללים במאגר התגובה נותן תערובות מצע-חומר ניקוי הומוגניות. Pipetting של פתרונות מצע אינו תחליב מוביל לריכוזי irreproducible (אושר על ידי GC כמותי), אשר מונע קביעה מדויקת של שיעורים ראשוניים. לעומת זאת, pipetting של פתרונות מניות תחליב כראוי צריך לגרום לניתוח רגרסיה ליניארית של שיעורים ראשוניים עם R 2 בטווח של .98-.99. היבט חשוב נוסף של מצעים הידרופובי הוא מסיסות המצע הברורהוזמינות בתערובות מצע-חומר הניקוי. למעשה, לא ניתן היה להרוות את cyclase triterpene עם הסקוואלין מצע התייחסות. לk לכאורה חתול סיבה זו / ערכי K M מוצגים במסמך שיכול להכיל תרומות משני מחייבים וכימיה. עם זאת, זה כבר מראה שכימיה הוא שיעור הגבלה לk חתול / K M למפל polycyclization שנערך על ידי cyclases triterpene 3.
זה חשיבות גבוהה כדי לאמת את הטמפרטורה בפועל בתוך בקבוקון זכוכית תגובה עם מדחום חיצוני. ובכל זאת, מתאים ליניארי יכול להיות עני יותר לגרסות עם חתול / ערכי K M k לכאורה קבועים חיוני בטמפרטורות שונות. זה הדגיש לגרסת S168F במסמך זה (איור 2 א) עם אנתלפיה הפעלה קרובה לאפס (איור 2 ו2C). מאוד smalשינויי l טמפרטורה תלויות בk חתול לכאורה / K M, יכולים לגרום לחוסר ודאות באנטרופיה ההפעלה נצפתה Δ S ‡ (כלומר, ליירט בחלקות ליניארי באיור 2). בעיקרון, את האנטרופיה ההפעלה הנצפית יכולה להיות מושפעת גם שפע של אנזימים פעילים לגרסות שונות, שלא יזוהו על ידי מדידת ריכוז החלבון שונה. צפוי כי שגיאות ניסיוניות מופחתות כאשר ערבוב כמה מצעים בסיר אחד. זאת, משום שכל מצעים השונים אינטראקציה עם אותה הכמות של אנזים בנסיבות אלה (משוואת 4). השימוש בממס חילוץ זינק עם התקן פנימי חשוב להסביר את ההבדלים בהפקה ו / או GC-הזרקה.
תיאוריית מצב המעבר שמשה בהצלחה בenzymology 26. מסגרת תיאורטית חשובה זה דה במקורפותח על לתגובות unimolecular בשלב הגז. עם זאת, זה כבר הראה כי אנזימים בעיקר לעבוד על ידי הורדת מחסום אנרגיית ההפעלה הקלסית 26. מקדם התמסורת הניחה להיות במסמך אחד יכול להשפיע על אנתלפיה ההפעלה נמדדה ו / או האנטרופיה. התרומה של מנהור, והשפעות חד-קלאסיות אחרות כגון כשחזר ושלב של מדינת המעבר, בערך יכולים לתרום 1,000 פי לקטליזה 26 מקבילות לכ -4 קלוריות / mol באנרגיה. ניתן לראות כי האנטרופיה ההפעלה מוצגת על ידי אנזים wild-type (16 קלוריות / mol ב328 K, איור 2C) היא הרבה יותר גדולה מהשפעות חד-קלאסיות כגון נגרמות על ידי מקדם שידור לא אחיד. ההשפעה של מקדם ההולכה צריכה להקטין כאשר משווים פרמטרים תרמודינמיים של הפעלה עבור גרסאות סוג והמנהרה פראיות באמצעות הפרוטוקול.
האנרגיה החופשית של גיבס של הפעלה (Δ G ‡) הוא compoטווח - (‡ Δ S * T) SED של שני enthalpic (Δ H ‡) ואנטרופי. ארגון מחדש ממס באנזימים בקטליזה יכול להשפיע גם פרמטרים. הפרוטוקול הנוכחי צפוי להקל על המחקר של תופעות אלה על ידי הרכבת ארגז כלים של כלים חישוביים רלוונטיים וידידותיים למשתמש בסיליקון ועם המסגרת הניסיונית biophysical ההכרחי. השיטה שחזה להיות שימושי ללימוד שפע של תהליכים אנזימטיים, כולל קטליזה על ידי אנזימי קרום נכנסים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| YASARA | YASARA Biosciences | http://www.yasara.org/ | Molecular modeling and simulation program |
| CAVER | CaverSoft | http://caver.cz/ | Tool for analysis of tunnels in proteins, free license for academic use |
| Bradford Ultra | Expedeon | BFU1L, BFU05L | Protein quantitation in solutions containing up to 1% detergent |
| Potter-Elvehjem homogenizer | VWR | 432-0205, 432-0217 | Homogenization of frozen cell pellet |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4693159001 | Protease inhibitor |
| Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC901008 | Centrifugal filter units for the concentration of proteins, MWCO 10 kDa |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | Thermomixer for sample incubation |
References
- Ball, P. Water as an active constituent in cell biology. Chem. Rev. 108 (1), 74-108 (2008).
- Snyder, P. W., et al. Mechanism of the hydrophobic effect in the biomolecular recognition of arylsulfonamides by carbonic anhydrase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (44), 17889-17894 (2011).
- Syren, P. O., Hammer, S. C., Claasen, B., Hauer, B. Entropy is Key to the Formation of Pentacyclic Terpenoids by Enzyme-Catalyzed Polycyclization. Angew. Chem., Int. Ed. 53 (19), 4845-4849 (2014).
- Persson, F., Halle, B. Transient Access to the Protein Interior: Simulation versus NMR. J. Am. Chem. Soc. 135 (23), 8735-8748 (2013).
- Abel, R., Young, T., Farid, R., Berne, B. J., Friesner, R. A. Role of the Active-Site Solvent in the Thermodynamics of Factor Xa Ligand Binding. J. Am. Chem. Soc. 130 (9), 2817-2831 (2008).
- Michel, J., Tirado-Rives, J., Jorgensen, W. L. Energetics of Displacing Water Molecules from Protein Binding Sites: Consequences for Ligand Optimization. J. Am. Chem. Soc. 131 (42), 15403-15411 (2009).
- Pearlstein, R. A., Sherman, W., Abel, R. Contributions of water transfer energy to protein-ligand association and dissociation barriers: Watermap analysis of a series of p38α MAP kinase inhibitors. Proteins: Struct., Funct., Bioinf. 81 (9), 1509-1526 (2013).
- Young, T., Abel, R., Kim, B., Berne, B. J., Friesner, R. A. Motifs for molecular recognition exploiting hydrophobic enclosure in protein-ligand binding. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (3), 808-813 (2007).
- Matsuoka, S., et al. Water-Mediated Recognition of Simple Alkyl Chains by Heart-Type Fatty-Acid-Binding Protein. Angew. Chem., Int. Ed. 54 (5), 1508-1511 (2014).
- Pavlova, M., et al. Redesigning dehalogenase access tunnels as a strategy for degrading an anthropogenic substrate. Nat. Chem. Biol. 5 (10), 727-733 (2009).
- Breiten, B., et al. Water Networks Contribute to Enthalpy/Entropy Compensation in Protein-Ligand Binding. J. Am. Chem. Soc. 135 (41), 15579-15584 (2013).
- Oldfield, E., Lin, F. Y.
- Henzler-Wildman, K. A., et al. A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis. Nature. 450 (7171), 913-916 (2007).
- Tzeng, S. R., Kalodimos, C. G. Protein activity regulation by conformational entropy. Nature. 488 (7410), 236-240 (2012).
- Warshel, A. Electrostatic origin of the catalytic power of enzymes and the role of preorganized active sites. J. Biol. Chem. 273, 27035-27038 (1998).
- Krieger, E., Darden, T., Nabuurs, S. B., Finkelstein, A., Vriend, G. Making optimal use of empirical energy functions: Force-field parameterization in crystal space. Proteins: Struct., Funct., Bioinf. 57 (4), 678-683 (2004).
- Duan, Y., et al. A point-charge force field for molecular mechanics simulations of proteins based on condensed-phase quantum mechanical calculations. J. Comput. Chem. 24 (16), 1999-2012 (2003).
- Essmann, U., et al. A smooth particle mesh Ewald method. J. Chem. Phys. 103, 8577-8593 (1995).
- Chovancova, E., et al. CAVER 3.0: a tool for the analysis of transport pathways in dynamic protein structures. PLoS Comput. Biol. 8 (10), e1002708 (2012).
- Zheng, L., Baumann, U., Reymond, J. L. An efficient one-step site-directed and site-saturation mutagenesis protocol. Nucleic Acids Res. 32 (14), e115/1-e115/5 (2004).
- Kürten, C., Uhlen, M., Syren, P. O. Overexpression of functional human oxidosqualene cyclase in Escherichia coli. Protein Express. Purif. , (2015).
- Eyring, H., Stearn, A. E. The application of the theory of absolute reaction rates to proteins. Chem. Rev. 24 (2), 253-270 (1939).
- Fersht, A. Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein. , W.H. Freeman. (1999).
- Wendt, K. U., Poralla, K., Schulz, G. E. Structure and function of a squalene cyclase. Science. 277 (5333), 1811-1815 (1997).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim. Biophys. Acta, Biomembr. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Garcia-Viloca, M., Gao, J., Karplus, M., Truhlar, D. G. How enzymes work: analysis by modern rate theory and computer simulations. Science. 303 (5655), 186-195 (2004).
