Abstract
Organotypiske kulturer tillader rekonstituering af et 3D-miljø kritisk for celle-celle-kontakt og celle-matrix-interaktioner som efterligner funktionen og fysiologi deres in vivo væv modstykker. Dette eksemplificeres ved organotypiske hud kulturer, som trofast rekapitulerer epidermal differentiering og lagdeling program. Primære humane epidermiskeratinocytter er genetisk manipuleres gennem retrovira, hvor gener kan let overudtrykkes eller slået ned. Disse genetisk modificerede keratinocytter kan derefter anvendes til at regenerere human epidermis i organotypiske hud kulturer giver en kraftig model til at studere genetiske pathways påvirkende epidermisvækstfaktor, differentiering og sygdomsprogression. Protokollerne præsenteres her beskriver fremgangsmåder til fremstilling af devitaliserede menneskelige dermis samt genmanipulere primære humane keratinocytter med henblik på at generere organotypiske hud kulturer. Regenereret menneskehud kan anvendes i downstrEAM applikationer såsom genekspression profilering, immunfarvning, og kromatin immunopræcipitationer efterfulgt af high throughput sekventering. Således vil dannelse af disse genetisk modificerede organotypiske hud kulturer tillade bestemmelse af gener, der er afgørende for opretholdelsen af hud homeostase.
Introduction
De human epidermis er et lagdelt epitel, der forbinder til de underliggende dermis gennem en ekstracellulær matrix kendt som basalmembranen zone.The epidermis ikke blot fungerer som en uigennemtrængelig barriere for at forhindre tab af fugt, men også som en første linje i forsvaret for at beskytte krop fra udenlandske og giftige stoffer 1. Det basale lag, som er den dybeste lag af epidermis, indeholder epidermal stamceller og progenitorceller, der giver anledning til den differentierede afkom, der danner resten af epidermis 2. Som epidermale stamceller differentierer de vandrer opad til dannelse af det første lag af differentierede celler kendt som spinosus lag 3. I spinosus lag, celler tænder ekspressionen af keratiner 1 og 10, som derefter giver styrke til at modstå fysiske stress for de differentierede lag af epidermis. Da de torntappene lagceller yderligere differentiering, de bevæger sig opad i epidermis til form det granulære lag, som er karakteriseret ved dannelsen af keratohyalin og lamellare granulater samt strukturelle proteiner, der er samlet under plasmamembranen. Efterhånden som cellerne går i differentieringsprocessen, proteinerne beneath plasmamembranen er cross forbundet med hinanden, mens de lamellare granulat ekstruderes fra cellerne til dannelse af et lipid rige barriere kaldes stratum corneum 4.
Sygdomme, der involverer ændringer i epidermal vækst og differentiering indvirkning ~ 20% af befolkningen. 5 Således at forstå mekanismerne i denne proces er af stor betydning. Da manifestation af mange af disse sygdomme er betinget af celle-celle- eller celle-matrix kontakt, har organotypiske kulturer, hvor den humane epidermis er rekonstitueret i et 3D-miljø er skabt 6-10. Disse fremgangsmåder involverer typisk anvendelse af primære eller transformerede keratinocytter podet på ekstracellulær matrix, såsom devitaliseret menneskedermis, Matrigel, eller collagen.
For at forstå gen reguleringsmekanismer der er vigtige i epidermal vækst og differentiering, kan keratinocytter genmanipuleres ved retrovirale vektorer til Knockdown eller overudtrykke gener i 2D kultur og derefter rekonstitueret i 3D. Disse fremgangsmåder er blevet anvendt i vid udstrækning til at karakterisere gener involveret i epidermal stamceller og progenitorceller selvfornyelse og differentiering samt progression til neoplasi 11-21. Her en grundig protokol om, hvordan til at ændre genekspression i epidermale organotypiske kulturer gennem brug af retrovira forudsat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den menneskelige hud-protokollen blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra University of California, San Diego Forskning etiske komité. Menneskehud kan fås fra kasserede kirurgiske prøver eller købt fra huden banker (hud bank er opført i Material / Udstyr tabel). Det sted, hvor huden er afledt af eller alder donoren er ikke kritisk for forsøget, så længe basalmembranen zone proteiner (collagen / laminin) i dermis nedbrydes ikke.
1. Fremstilling af devitaliseret Menneskelige Dermis
- Ved modtagelse af menneskehud, placere vævet i vævskultur hætte tø (~ 3-5 min). Afhængig af størrelsen af huden, placere optøet væv i en steril engangs 50 ml konisk rør eller 125 ml flaske. Den typiske størrelse af hud fra huden bank er 0,75 kvadratfod.
- Fylde beholderen 75% fyldt med 4x penicillin og streptomycin (pen / strep) i 1x PBS. Ryst kraftigt i5 min og bortskaffe væsken. Gentag dette trin 3 gange mere.
- Efter den sidste vask overføres vævet til et nyt rør / flaske og tilføje nyt 4x pen / strep / PBS at fylde 75% af beholderen. Inkuber denne blanding i en vævskultur-inkubator ved 37 ° C i 2 uger for at tillade adskillelse af dermis fra epidermis.
- Under sterile forhold, brug pincet til at skrælle væk epidermis fra dermis. Dermis er helt hvidt, mens epidermis vil have farve afhængigt af race af donor (figur 1A). Kassér overhuden ifølge institutionens protokol for håndtering af humant væv.
- Placer dermis i et rør eller flaske og vaske det i 4x pen / strep fortyndet i 1x PBS med kraftig omrystning (5 min vaske til 4 gange). Efter den sidste vask, overføre dermis til et nyt rør / flaske i 4x pen / strep fortyndet i 1x PBS og opbevares ved 4 ° C, indtil den er klar til brug. Dermis kan opbevares ved 4 ° C i op til et år. 2. Genetisk Ændring Primær humane keratinocytter
- Dag 1: Dagen før transfektion frø phoenix celler i en 6-brønds plade med en tæthed på 800.000 celler per brønd i komplet DMEM-medium.
- Dag 2: Dagen for transfektion bruge 3 ug retrovirale vektorer per brønd. Portion 3 ug retroviral vektor i en 1,5 ml rør. Brug en blanding af 100 μl DMEM plus 6 pi transfektionsreagens for hver 3 ug vektor. Bland 6 pi transfektionsreagens med 100 pi DMEM i et 1,5 ml rør. (De retrovirale vektorer, der anvendes, er anført i udstyr / materialer tabel).
- Der inkuberes i 5 minutter og tilsæt 106 pi blandingen i præ-alikvoteret røret med 3 ug retroviral vektor. Blandes og inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter. Hele denne blanding dråbevis Tilføj til hver brønd af phoenix celler.
- Dag 3: Dagen efter transfektion, fjerne mediet fra phoenix celler og tilsæt 2 ml frisk komplet DMEM medier. På den samme dag, frø primære humane keratinocytter i 6-brønds plader ved en densitet på 75.000 celler per brønd. Vedligehold keratinocytter i en keratinocyt serumfrit medium (KCSFM) med antibiotika (pen / strep).
BEMÆRK: Primære humane keratinocytter blev købt. Celler kan købes fra en række forskellige leverandører (opført i Material / Udstyr tabel). - Dag 4: Haroptjenes mediet fra de transfekterede phoenix celler, som nu indeholder viruspartikler. Før medierne gennem et 0,45 um filter ved hjælp af en sprøjte (for at fjerne eventuelle forurenende phoenix celler) og placere 2 ml ind på keratinocytter (forgyldt på 75.000 celler / brønd den foregående dag: se trin 2.3). Tilføj hexadimethrinbromid (5 ug / ml) til medierne til at mediere infektion processen. Virale titere er ~ 1 x 10 7 TU / ml.
- Spin 6-brønds plader i en centrifuge ved 200 xg i 1 time ved stuetemperatur. Efter spin, fjerne medier, der indeholder virus og vaske cellerne en gang med 1x PBS, før du tilføjer KCSFM.
- Dag 5: inficere den samme batch af keratinocytter igen som i trin 2.4.
BEMÆRK: Vælg keratinocytterne ved anvendelse af et lægemiddel, hvis der er en selekterbar markør på den retrovirale vektor og udvide til anvendelse i nedstrøms analyse eller applikationer som organotypiske kulturer. - Bygorganotypisk kassette fra almindelige materialer, der findes i laboratoriet eller kassetterne kan brugerdefinerede foretaget gennem en metal fabrikation shop (figur 2A - F). For at gøre disse kassetter fra en 3,5 cm vævskulturplade, bruge en cautery at fjerne en 1,0 cm x 1,0 cm firkant fra centrum af låget af et 3,5 cm skål (figur 2A-B). Gør dette under sterile forhold.
- Fastgør firkantede tappe på bunden af kassetten (låg på 3,5 cm skål) under anvendelse af klare neglelak (figur 2C). Tillad 5 min til neglelak til at tørre og flip kassetten over, så den hviler på de firkantede pinde (Figur 2D). Placer kassetten i en 6 cm skål.
BEMÆRK: Square pløkker kan købes fra en række af kunst og kunsthåndværk butikker.
- Fastgør firkantede tappe på bunden af kassetten (låg på 3,5 cm skål) under anvendelse af klare neglelak (figur 2C). Tillad 5 min til neglelak til at tørre og flip kassetten over, så den hviler på de firkantede pinde (Figur 2D). Placer kassetten i en 6 cm skål.
- Forbered keratinocyt-vækstmedium (KGM) består af 66% DMEM, 22% Hams F12, 100 enheder / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 10% FBS, 2,67 ug / ml adenin, 40 ng / ml hydrocortison, 10 ng / ml koleratoksin, 4,94 ug / ml insulin, 5 ug / ml transferrin, 1,36 ng / ml triiod-L-thyronin, 10 ng / ml EGF, og 10 ug / ml ciprofloxacin-hydrochlorid. Filtrer mediet gennem et 0,22 um filter og opbevares ved 4 ° C, indtil klar til brug.
- Tag dermis ud af 4x pen / strep + PBS-opløsning og vaskes 2 gange i KGM og derefter inkuberes i KGM ved 37 ° C i to dage før brug.
- Skær dermis ved hjælp af en skalpel til 1,5 cm x 1,5 cm store stykker og derefter placere på organotypisk kassette. Placer dermis med toppen af dermis opad. Toppen af dermis vil være den side, der kommer i kontakt med keratinocytterne (figur 1B).
- Placer forskårne dermis på det firkantede hul af organotypiske kassette med oversiden af dermis opad (figur 3A).
- Flip hele organotypisk kassette, der indeholder dermis end med en pincet (figur 3B). Optø den ekstracellulære matrix opløsningen på is. Brug en nål og sprøjte at trække 100 pi ekstracellulær matrix opløsning pr kassette. Der tilsættes 5 dråber til bunden af dermis (blanke side) og omrystes let for at sikre en jævn fordeling i hele dermis (figur 3B).
- Tillad 5 minutter for kommerciel ekstra cellulære matrix løsning til helt at størkne (figur 3C). Efter størkning, brug pincet til at vende kassetten tilbage over. Tilsæt 4 ml KGM til 6 cm skål.
- Placer 0,5-1 millioner genmodificerede keratinocytter på de organotypiske kassetter indeholder dermis (figur 3D).
- Trypsinisér keratinocytter ved at placere 4 ml 0,05% trypsin på 10 cm plader i 5 minutter og stands med 4 ml komplet DMEM-medium.
- Tæl keratinocytter under anvendelse af et hæmocytometer og derefter spin ned ved 200 x g i 5 min. Resuspender 0,5-1 millioner celler (afhængigt af antallet af celler tilgængelig) i 90 μl KGM og placere alle celler på dermis.
BEMÆRK: Det er vigtigt at placere det samme antal celler på dermis inden for samme eksperiment for at sikre, at eventuelle forskelle ses i tykkelsen af den regenererede epidermis ikke skyldes forskelle i starter celletal. Lægge mindre end 0,5 millioner celler på dermis kan føre til dårlig lagdeling og differentiering.
- Skift KGM medier på de organotypiske kulturer hver anden dag. Harvest væv 1-14 dage efter anbringelse af keratinocytter på dermis. Fuld lagdeling og differentiering af epidermis sker normalt efter dag 5.
BEMÆRK: Brug amfotropiske phoenix celler dyrket i komplet DMEM-medium [DMEM + 10% føtalt bovint serum (FBS) + pen / strep] til fremstilling af virus til at inficere primære humane keratinocytter. Viral pakning gener, der koder proteiner, såsom gag-pol og kuvert er stabilt integreret i genomet phoenix celle, som giver mulighed for virusproduktion når transficeret med en retroviral vektor. Phoenix celler kan transficeres med høj effektivitet giver mulighed for høj virustiter produktion. Virus fremstillet fra dette pakkelinie kan også inficere en lang række pattedyrceller, herunder menneske.
3. Opsætning Organotypiske Skin Cultures
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det første trin i at generere organotypisk menneskehud er at fjerne epidermis fra dermis. To ugers inkubation af huden ved 37 ° C i 4 x pen / strep / PBS skulle muliggøre separation af dermis fra epidermis (figur 1A). Hvis adskille epidermis og dermis er svært derefter placere vævet ved 37 ° C i 4x pen / strep / PBS for en anden uge og derefter prøve peeling igen ved hjælp af pincet.
En af nøglerne til at regenerere human epidermis på devitaliserede dermis er at sikre, at keratinocytterne er placeret på den rigtige side af dermis. Dermis har en top og en bund. Toppen af dermis er den side, der kommer i kontakt med keratinocytterne i vivo såvel som i organotypiske kulturer. Toppen af dermis kan skelnes fra bunden af dermis på grund af glansen af bunden (figur 1B). Hvis keratinocytter placeres direkte på bundenside (blank) af dermis, vil epidermis ikke differentiere eller stratificere ordentligt. Således er det afgørende at have toppen af dermis (ikke-blanke) opad i organotypisk kassette. Dermis kan placeres direkte på en organotypisk kassette (figur 2A - F). Kassetter fremstillet af vævskulturplader bør UV steriliseres, mens metal fremstillet kassetter kan autoklaveres før dermis lægges på. De genetisk modificerede keratinocytter kan derefter placeres på dermis. Keratinocytterne oprindeligt nedsænket i flydende da de blev anbragt på dermis resuspenderet i KGM. Efter 24 timer KGM vil være diffunderet gennem dermis som tillader keratinocytterne at blive udsat for luft-væske-grænsefladen, som forårsager lagdeling og differentiering i epidermis 7 (figur 3).
RNA kan protein, DNA / kromatin, samt vævssnit høstes fra de organotypiske skin kulturer, som alle kan bruges til en lang række applikationer. downstream RNA kan anvendes til at bestemme genekspression forskelle mellem kontrol og knockdown / overekspression væv anvendelse af RT-QPCR, microarrays, eller RNA-Seq. DNA / kromatin kan anvendes til DNA- eller chip-Seq applikationer. Den regenererede hud kan monteres i OCT og frosne sektioner kan anvendes til immunofarvning eller hematoxylin og eosin-farvning til at vurdere vævsmorfologi, proteinekspression / lokalisering i kontrol og forsøgsgrupper.
Et eksempel på dette er vist i figur 4 med hematoxylin og eosin-farvning af en typisk organotypisk kultur hud. Bemærk, at alle fire distinkte lag af epidermis er udformet med lag ekspression af differentiering relaterede proteiner (figur 4) 11,12,14,15. Dette system kan anvendes til at bestemme virkningerne af overekspression eller knockdown af forskellige gener på epidermis. Figur 5 viser regenereret overhudsvæv der udtrykker kontrol, LACZ samt væv overudtrykkes for SNAI2. Overekspression af SNAI2 førte til en hæmning af epidermal differentiation som bemærket af manglen på keratin 1 (K1) farvning samt tab af udtryk for differentiering induceret strukturelle gener såsom TGM1 og SPRR1A (figur 5A - C) 13,22. Den epidermistykkelsen vist i figur 4 og figur 5 kan variere inden for samme prøve som følge af flere celler akkumuleres i midten af dermis versus periferien, når cellerne blev oprindeligt anbragt på dermis. Således de midterste sektioner tendens til at have tykkere epidermis mens periferien tendens til at have tyndere. Til direkte sammenligning mellem forskellige prøver de samme områder i et afsnit skal sammenlignes. Farvningen for markører, bør imidlertid forblive konsistent.
"Figur 1" src = "/ files / ftp_upload / 53280 / 53280fig1.jpg" />
Figur 1. Fremstilling af dermis fra menneskehud. (A) Efter inkubering af menneskehud ved 37 ° C i 2 uger, kan dermis adskilles fra epidermis. Pincet bruges til at skrælle epidermis (brun farvede) fra dermis (hvid). (B) Den øverste del af dermis kan skelnes fra bunden af glansen af vævet. Toppen af dermis (den side, der vil naturligvis over epidermis in vivo, eller hvor keratinocytterne vil blive podet) er ikke-blank. Bunden af dermis er blank. Vævet er lyserød skyldes inkubation i KGM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Generering af organotypiske kassetter. (A) Brug en kautering at fjerne en 1,0 cm x 1,0 cm firkant fra centrum af låget af et 3,5 cm skål. (B) Slet pladsen fra centrum af 3,5 cm skål. (C) Brug klar neglelak til at klæbe firkantede pinde. Tillad 5 min til neglelak til at tørre. (D) Flip låget over, så den hviler på de firkantede pinde. Kassetten er nu klar til at blive brugt. (E) Billede af en metal fremstillet organotypisk kassette med dens dimensioner. (F) Billede af en metal fabrikeret kassette vendt på hovedet for at vise støtte pinde. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Frembringelse af organotypic hud kulturer. (A) Placér dermis med toppen af dermis (ikke-blanke side) vender op på organotypisk kassette. (B) Flip kassetten igen og tilføje Matrigel til den blanke side af dermis. (C) Tillad 5 min til Matrigel at størkne og derefter vende kassetten tilbage over. (D) Der tilsættes genetisk modificerede keratinocytter til dermis (0,5-1 millioner celler resuspenderes i 90 pi KGM). Høst vævet 1-14 dage efter såning af keratinocytter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Hematoxylin og eosin-farvning af organotypiske hud kulturer. Regenereret menneskehud indeholder både epidermis og dermis. Den EpiDermer er fuldt lagdelt og differentieret med 4 forskellige lag. Disse lag omfatter udifferentierede basale lag og de 3 differentierede lag, herunder stratum spinosum, granulosum og corneum. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Immunfluorescensfarvning og genekspression analyse af genetisk modificerede human epidermis. (A) Overekspression af SNAI2 hæmmer epidermal differentiation. Farvning for differentiering protein keratin 1 (K1) er vist i grønt og kerner er markeret med blåt (Hoechst). (B) RT-QPCR analyse på mRNA niveauerne af SNAI2 i kontrol LACZ og SNAI2 overudtrykkende væv. Fejllinjer = SD, n = 3. (C) RT-QPCR analyse af mRNAniveauer af differentiering udskrifter KRT1, TGM1 og SPRR1A i kontrol LACZ og SNAI2 overudtrykkende væv. Fejllinjer = standardafvigelse, n = 3. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genetisk manipulation i menneskehud organotypiske kulturer giver mange fordele til almindeligt undersøgt 2D dyrkede celler samt musemodeller. 2D kulturer mangler de tredimensionelle celle-celle- og celle-ekstracellulær matrix-interaktioner, der findes i intakte væv og organer. Nylige undersøgelser har også fundet enorme forskelle mellem 2D og 3D dyrkede hud kræftceller med 3D dyrkede celler, der viser meget mere genekspression ligheder til primære humane hudtumorer 16. Humane organotypiske hud kulturer har også flere fordele i forhold musemodeller. Musemodeller er tidskrævende og dyrt at generere såvel som adskillige bemærkelsesværdige forskelle mellem human og muse huden. Disse omfatter forskellige væv omsætningshastigheder samt tykkelsen af epidermis mellem murine og humane epidermis 8. Med nye teknologier, der dukker såsom CRISPR-CAS, kan specifikke gener ændres / muteret til modellere menneskelige hudsygdomme hjælp organotypisk hud Cultures 23. Endvidere kan gener leveres eller slået ned i disse celler gennem en bred vifte af metoder udover retroviral genoverførsel er beskrevet her. Så længe der er robust levering gennem høj transduktionseffektivitet eller lægemiddel-selektion kan fremgangsmåden anvendes. Disse levering metoder omfatter nucleofection af siRNA'er, lentiviral, adenoassociated virus og adeno virus 11,12,24-26.
De organotypisk kulturer hud kan modificeres ved tilsætning af forskellige celletyper til systemet. For eksempel kan normale eller genetisk ændrede humane fibroblaster, hvormed de devitaliserede dermis at studere mesenchymale og epithelial krydstale. Immunceller kan også sættes til dermis at undersøge inflammatoriske respons på forstyrrelser i huden. En begrænsning ved systemet er, at afskalning proces, der forekommer in vivo ikke forekommer i organotypiske kulturer. Dette forhindrer anvendelsen af disse kulturer for langsigtet og mest analysesker i 1-14 dage efter udsåning af epidermale celler. Ved længere sigt analyser, kan de organotypiske kulturer podet på ryggen af immun kompromitteret mus 17,27.
Huden organotypisk kultur præsenteres her er enestående, fordi den udnytter intakte devitaliserede menneskelige dermis, som er det naturlige substrat af epidermis in vivo, mens de fleste andre systemer bruger collagen eller Matrigel som substratet 28. Opsætning af organotypiske hud kulturer ved hjælp af substrater såsom Matrigel resultater i tyndere og mindre robust lagdeling af epidermis i vores erfaringer. Dermis indeholder basalmembran zone proteiner, herunder laminin og kollagen, som gør det muligt for epidermale celler at vedhæfte, formere sig, differentiere og stratificere 29. Anvendelse af dermis muliggør generering af epidermis, som efterligner deres in vivo modstykke. Således kan organotypiske hud kulturer være yderst værdifuldt i toksikologiske og farmakologiske studies i de tilfælde, hvor dyreforsøg ikke er tilladt (kosmetikindustrien) 30.
Brug af devitaliserede dermis også kommer med sin egen ulemper eftersom tykkelsen af dermis mellem forskellige donorer eller endda inden for samme donor kan variere. Epidermale celler dyrket på tykke dermis tendens til ikke at proliferere og generere så tyk som epidermis celler dyrket på tyndere dermis. Således er det afgørende at vælge lignende tykkelse dermis ved oprettelsen af forsøgene sammenligner flere prøver. En anden kritisk parameter er at pode det samme antal epidermisceller, når man sammenligner forskellige grupper, således at eventuelle forskelle ses ikke på grund af forskellene i oprindelige antal celler podet.
Som konklusion kan det organotypisk kultur huden tjene som en avanceret og effektiv in vitro model til validering molekylære veje i en mere fysiologisk kontekst, som i sidste ende vil fremskynde forståelsen af genregulatorisk mechannismer, der er vigtige i epidermal vækst og differentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde var supportedby American Cancer Society Research Scholars Grant (RSG-12-148-01-DDC) og CIRM Basic Biologi Award (RB4-05779).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human skin | New York Firefighters Skin Bank | http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html | |
| PEN/STREP | GIBCO | 15140-122 | |
| amphotropic phoenix cell lines | ATCC | CRL-3213 | |
| FUGENE 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Keratinocyte Media (KCSFM) | Life Technologies | 17005042 | |
| DMEM | GIBCO | 11995 | |
| Ham's F12 | Cambrex | 12-615F | |
| FBS | GIBCO | 10437-028 | |
| Adenine | Sigma | A-9795 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C-8052 | |
| Hydrocortisone | Calbiochem | 3896 | |
| Insulin | Sigma | I-1882 | |
| EGF | Invitrogen | 13247-051 | |
| Transferrin | Sigma | T-0665 | |
| Ciprofloxacin Hydrochloride | Serologicals | 89-001-1 | |
| cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Keratin 1 antibody | Biolegend | PRB-149P | |
| square pegs | Arts and crafts stores | ||
| human neonatal keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 | |
| human neonatal keratinocytes | Cell Applications | 102K-05n | |
| MSCV retroviral vector | Clontech | 634401 | |
| LZRS retroviral vector | Addgene | ||
| pSuper.Retro.Puro Retroviral vector | Oligoengine | VEC-PRT-0002 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma | H9268-5G |
References
- Tadeu, A. M., Horsley, V. Epithelial stem cells in adult skin. Current topics in developmental biology. 107, 107-131 (2014).
- Sen, G. L. Remembering one's identity: the epigenetic basis of stem cell fate decisions. FASEB J. 25, 2123-2128 (2011).
- Segre, J. A. Epidermal barrier formation and recovery in skin disorders. J Clin Invest. 116, 1150-1158 (2006).
- Eckert, R. L., Sturniolo, M. T., Broome, A. M., Ruse, M., Rorke, E. A.
- Lopez-Pajares, V., Yan, K., Zarnegar, B. J., Jameson, K. L., Khavari, P. A. Genetic pathways in disorders of epidermal differentiation. Trends Genet. 29, 31-40 (2013).
- Fuchs, E.
- Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5665-5668 (1979).
- Khavari, P. A.
- Parenteau, N. L., Bilbo, P., Nolte, C. J., Mason, V. S., Rosenberg, M. The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function. Cytotechnology. 9, 163-171 (1992).
- Oh, J. W., Hsi, T. C., Guerrero-Juarez, C. F., Ramos, R., Plikus, M. V.
- Sen, G. L., et al. ZNF750 Is a p63 Target Gene that Induces KLF4 to Drive Terminal Epidermal Differentiation. Dev Cell. 22, 669-677 (2012).
- Sen, G. L., Webster, D. E., Barragan, D. I., Chang, H. Y., Khavari, P. A. Control of differentiation in a self-renewing mammalian tissue by the histone demethylase JMJD3. Genes Dev. 22, 1865-1870 (2008).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Zhang, K., Sen, G. L. SNAI2 controls the undifferentiated state of human epidermal progenitor cells. Stem Cells. 32, 3209-3218 (2014).
- Truong, A. B., Kretz, M., Ridky, T. W., Kimmel, R., Khavari, P. A. p63 regulates proliferation and differentiation of developmentally mature keratinocytes. Genes Dev. 20, 3185-3197 (2006).
- Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493, 231-235 (2013).
- Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia. Nat Med. 16, 1450-1455 (2010).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Sen, G. L. Progenitor function in self-renewing human epidermis is maintained by the exosome. Cell Stem Cell. 11, 127-135 (2012).
- Kretz, M., et al. Suppression of progenitor differentiation requires the long noncoding RNA ANCR. Genes Dev. 26, 338-343 (2012).
- Mulder, K. W., et al. Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation. Nat Cell Biol. 14, 753-763 (2012).
- Boxer, L. D., Barajas, B., Tao, S., Zhang, J., Khavari, P. A. ZNF750 interacts with KLF4 and RCOR1, KDM1A, and CTBP1/2 chromatin regulators to repress epidermal progenitor genes and induce differentiation genes. Genes Dev. 28, 2013-2026 (2014).
- Jameson, K. L., et al. IQGAP1 scaffold-kinase interaction blockade selectively targets RAS-MAP kinase-driven tumors. Nat Med. 19, 626-630 (2013).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Sen, G. L. Transcriptional profiling of SNAI2 regulated genes in primary human keratinocytes. Genomics data. 4, 43-46 (2015).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Doebis, C., et al. Efficient in vitro transduction of epithelial cells and keratinocytes with improved adenoviral gene transfer for the application in skin tissue engineering. Transpl immunol. 9, 323-329 (2002).
- Melo, S. P., et al. Somatic correction of junctional epidermolysis bullosa by a highly recombinogenic AAV variant. Mol Ther. 22, 725-733 (2014).
- Nanba, D., Matsushita, N., Toki, F., Higashiyama, S. Efficient expansion of human keratinocyte stem/progenitor cells carrying a transgene with lentiviral vector. Stem cell res ther. 4, 127 (2013).
- Sen, G. L., Reuter, J. A., Webster, D. E., Zhu, L., Khavari, P. A. DNMT1 maintains progenitor function in self-renewing somatic tissue. Nature. 463, 563-567 (2010).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 647-664 (2014).
- Krejci, N. C., Cuono, C. B., Langdon, R. C., McGuire, J. In vitro reconstitution of skin: fibroblasts facilitate keratinocyte growth and differentiation on acellular reticular dermis. J Invest Dermatol. 97, 843-848 (1991).
- Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Adv Drug Deliv Rev. 69-70, 81-102 (2014).
