Hemodynamisk Karakterisering av gnagermodeller av pulmonal arteriell hypertensjon
Summary
Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a disease of pulmonary arterioles that leads to their obliteration and the development of right ventricular failure. Rodent models of PAH are critical in understanding the pathophysiology of PAH. Here we demonstrate hemodynamic characterization, with right heart catheterization and echocardiography, in the mouse and rat.
Abstract
Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a rare disease of the pulmonary vasculature characterized by endothelial cell apoptosis, smooth muscle proliferation and obliteration of pulmonary arterioles. This in turn results in right ventricular (RV) failure, with significant morbidity and mortality. Rodent models of PAH, in the mouse and the rat, are important for understanding the pathophysiology underlying this rare disease. Notably, different models of PAH may be associated with different degrees of pulmonary hypertension, RV hypertrophy and RV failure. Therefore, a complete hemodynamic characterization of mice and rats with PAH is critical in determining the effects of drugs or genetic modifications on the disease.
Here we demonstrate standard procedures for assessment of right ventricular function and hemodynamics in both rat and mouse PAH models. Echocardiography is useful in determining RV function in rats, although obtaining standard views of the right ventricle is challenging in the awake mouse. Access for right heart catheterization is obtained by the internal jugular vein in closed-chest mice and rats. Pressures can be measured using polyethylene tubing with a fluid pressure transducer or a miniature micromanometer pressure catheter. Pressure-volume loop analysis can be performed in the open chest. After obtaining hemodynamics, the rodent is euthanized. The heart can be dissected to separate the RV free wall from the left ventricle (LV) and septum, allowing an assessment of RV hypertrophy using the Fulton index (RV/(LV+S)). Then samples can be harvested from the heart, lungs and other tissues as needed.
Introduction
Pulmonal arteriell hypertensjon (PAH) er en sykdom i det pulmonare vaskulatur assosiert med inflammatorisk celleinfiltrasjon, glatt muskel proliferasjon og endotelcelle apoptose. Disse endringene føre til utslettelse av lunge arterioler, senere fører til høyre ventrikkel (RV) dysfunksjon og hjertesvikt. For å forstå patofysiologien underliggende PAH og RV svikt i PAH, har en rekke forskjellige modeller, inkludert genetiske og farmakologiske modeller, for å studere denne sykdommen blitt utviklet (gjennomgått andre steder 1,2).
Av disse modellene, de mest populære er hypoksi-indusert (Hx) PAH i musen og monocrotaline (MCT) og SU5416-hypoksi (SuHx) modeller i rotte. I mus Hx modellen blir mus eksponert for 4 uker med hypoksi (enten normobaric eller hypobar, tilsvarende en høyde på 18.000 fot med en FiO2 på 0,10), med resulterende utvikling av mediale proliferasjon økte RV systolic press og utvikling av RV hypertrofi tre. MCT ved en enkelt dose på 60 mg / kg fører til skade på pulmonære endotelceller gjennom en uklar mekanisme som deretter resulterer i utvikling av PAH 4. SU5416 er en inhibitor av vaskulær endotelial vekstfaktor-reseptorer (VEGFR) 1 og 2 blokkering, og behandling med en enkel subkutan injeksjon av 60 mg / kg etterfulgt av eksponering for kronisk hypoksi i 3 uker resulterer i permanent pulmonal hypertensjon med patologiske endringer liknende til det man ser i sykdom hos mennesker, med dannelse av oblitererende vaskulære lesjoner 5. I de siste årene har flere transgene musemodeller for pulmonal hypertensjon blitt utviklet. Disse inkluderer knockout og mutasjoner av bein morfogenetiske protein reseptor 2 (BMPR2), som BMPR2 genmutasjoner finnes i både familiære og idiopatisk former for PAH, heme oxygenase-en knockout og IL-6 overekspresjon (gjennomgått andre steder 1,2).
Disse ulike gnager modeller av PH har ulike nivåer av pulmonal hypertensjon, RV hypertrofi og RV fiasko. Mens hypoksi og ulike transgene musemodeller resultere i mye mildere PAH enn enten rottemodell 1, betyr det at testing av ulike genetiske mutasjoner og deres tilknyttede molekylære signalveier. MCT-modellen resulterer i alvorlig PAH, selv om MCT ser ut til å være giftig for endotelceller i flere vev 4. Den SuHx modellen er preget av vaskulær endres mer lik den man ser ved idiopatisk PAH hos mennesker, selv krever både farmakologisk manipulasjon og hypoksi eksponering. Videre, i alle disse modellene, kan det være en frakobling mellom de histopatologiske endringer, lungetrykk og RV-funksjonen assosiert med utvikling av PAH. Dette er i motsetning til den humane sykdommen, hvor det er vanligvis en proporsjonal sammenheng mellom histopatologiske forandringer, alvorligheten av pulmonær hypertensjon og graden av RV svikt. Dermed er en omfattende karakterisering av disse gnager modeller av PH nødvendig, og innebærer vurdering av RV-funksjon (typisk ved ekkokardiografi), hemodynamics (ved hjertekateterisering) og histopatologi av hjertet og lungene (fra vev høsting).
I denne protokollen beskriver vi de grunnleggende teknikkene som brukes for hemodynamiske karakterisering av PAH-modeller i rotte og mus. Disse generelle teknikker kan brukes på en hvilken som helst undersøkelse av den høyre ventrikkel og pulmonal blodkar og er ikke begrenset til modeller av PAH. Visualisering RV ved ekkokardiografi er relativt enkelt i rotter, men er mer utfordrende i mus på grunn av sin størrelse og kompleks geometri av RV. Dessuten, noen surrogater som brukes for å kvantifisere RV funksjon, for eksempel TAPSE, lungearterien (PA) akselerasjonstiden og PA Doppler bølgeform innskjæring, er ikke godt validert hos mennesker og relatere bare svakt med vurdering av pulmonary hypertensjon og RV funksjon av invasive hemodynamics. Bestemmelse av RV hemodynamics gjøres best med en lukket brystet, for å opprettholde effekten av en negativ intrathoracic trykk under inspirasjon, selv om åpent bryst kateter med en impedans kateter tillater bestemmelse av trykk-volum (PV) sløyfer og en mer detaljert hemodynamisk karakterisering . Som med en hvilken som helst fremgangsmåte, utvikle erfaring med de prosedyrer som er kritisk for eksperimentell suksess.
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocols outlined here describe a comprehensive characterization of hemodynamics and right ventricular function in rodent models of pulmonary hypertension. While right heart catheterization as described here is a terminal procedure, the mortality associated with echocardiography is minimal, which allows for screening and follow-up of disease progression. However, similar to patients with PH having markedly increased mortality with anesthesia17, in our experience, rats with severe PH do not tolerate anesth…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SR is supported by NIH K08HL114643, Gilead Research Scholars in Pulmonary Arterial Hypertension and a Burroughs Wellcome Fund Career Award for Medical Scientists.
Materials
| Vevo 2100 Imaging System (120V) | VisualSonics, inc. | VS-11945 | |
| Vevo 2100 Imaging Station | VisualSonics, inc. | ||
| High-frequency Mechanical Transducers | VisualSonics, inc. | MS250, MS550D, MS400 | |
| Ultrasound Gel Parker | Laboratories Inc. | 01-08 | |
| PowerLab 4/35 | ADInstruments | ML765 | |
| Labchart 8 | ADInstruments | ||
| BP transducer with stopcock and cable | ADInstruments | MLT1199 | |
| BP transducer calibration kit | ADInstruments | MLA1052 | |
| Mikro-Tip Pressure Catheter for mouse | Millar | SPR-1000 | Alternative catheter available from Scisense FT111B (mouse) and FT211B (rat) |
| Mikro-Tip Pressure Catheter for rat | Millar | SPR-513 | Alternative catheter available from Scisense FT111B (mouse) and FT211B (rat) |
| Millar Mikro-Tip ultra-miniature PV loop catheter for mice | Millar | PVR-1035 | Alternative catheter available from Scisense FT112 (mouse) |
| Millar Mikro-Tip ultra miniature PV loop catheter for rats | Millar | SPR-869 | Alternative catheter available from Scisense FT112 (mouse) |
| Millar PV system MPVS-300 | Millar | MPVS-300 | |
| 4-0 Silk Black Braid 100 Yard Spool | Roboz Surgical | SUT-15-2 | |
| 6-0 Silk Black Braid 100 Yard Spool | Roboz Surgical | SUT-14-1 | |
| Iris Scissors, Delicate, Integra Miltex | VWR | 21909-248 | |
| VWR Dissecting Scissors, Sharp/Blunt Tip | VWR | 82027-588 | |
| VWR Delicate Scissors, 4 1/2" | VWR | 82027-582 | |
| Two star Hemostats, Excelta | VWR | 63042-090 | |
| Neutral-buffered formalin | VWR | 89370-094 | |
| Crotaline | Sigma | C2401 | |
| SU5416 | Tocris Biosciences | 3037 | |
| 3.5X-45X Boom Stand Trinocular Zoom Stereo Microscope | AmScope | SM-3BX | |
| PE (Polyethylene Tubing)-10 | Braintree Scientific Inc | PE10 36 FT | |
| PE (Polyethylene Tubing)-50 | Braintree Scientific Inc | PE50 36 FT | |
| PE (Polyethylene Tubing)-60 | Braintree Scientific Inc | PE60 36 FT | |
| Tabletop Isoflurane Anesthesia Unit | Kent Scientific | ACV-1205S | |
| Surgisuite multi-functional surgical platform | Kent Scientific | Surgisuite | |
| Retractor set | Kent Scientific | SURGI-5002 | |
| Anesthesia induction chamber | VetEquip | 941443 | |
| Anesthesia Gas filter canister | Kent Scientific | ACV-2001 | |
| Rodent nose cone | VetEquip | 921431 |
Riferimenti
- Gomez-Arroyo, J., et al. A brief overview of mouse models of pulmonary arterial hypertension: problems and prospects. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, 977-991 (2012).
- Ryan, J. J., Marsboom, G., Archer, S. L. Rodent models of group 1 pulmonary hypertension. Handbook of experimental pharmacology. 218, 105-149 (2013).
- Voelkel, N. F., Tuder, R. M. Hypoxia-induced pulmonary vascular remodeling: a model for what human disease. J Clin Invest. 106, 733-738 (2000).
- Gomez-Arroyo, J. G., et al. The monocrotaline model of pulmonary hypertension in perspective. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, 363-369 (2012).
- Abe, K., et al. Formation of plexiform lesions in experimental severe pulmonary arterial hypertension. Circulation. 121, 2747-2754 (2010).
- Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Batkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc. 3, 1422-1434 (2008).
- Brittain, E., Penner, N. L., West, J., Hemnes, A. Echocardiographic Assessment of the Right Heart in Mice. J. Vis. Exp. (81), e50912 (2013).
- Abraham, D. M., Mao, L. Cardiac Pressure-Volume Loop Analyses Using Conductance Catheters in Mice. J Vis Exp. , (2015).
- Vergadi, E., et al. Early macrophage recruitment and alternative activation are critical for the later development of hypoxia-induced pulmonary hypertension. Circulation. 123, 1986-1995 (2011).
- Mam, V., et al. Impaired vasoconstriction and nitric oxide-mediated relaxation in pulmonary arteries of hypoxia- and monocrotaline-induced pulmonary hypertensive rats. J Pharmacol Exp Ther. 332, 455-462 (2010).
- Wang, Z., Schreier, D. A., Hacker, T. A., Chesler, N. C. Progressive right ventricular functional and structural changes in a mouse model of pulmonary arterial hypertension. Physiol Rep. 1, 00184 (2013).
- Thibault, H. B., et al. Noninvasive assessment of murine pulmonary arterial pressure: validation and application to models of pulmonary hypertension. Circ Cardiovasc Imaging. 3, 157-163 (2010).
- Abe, K., et al. Long-term treatment with a Rho-kinase inhibitor improves monocrotaline-induced fatal pulmonary hypertension in rats. Circ Res. 94, 385-393 (2004).
- Ma, W., et al. hypoxia chamer info–Calpain mediates pulmonary vascular remodeling in rodent models of pulmonary hypertension, and its inhibition attenuates pathologic features of disease. J Clin Invest. 121, 4548-4566 (2011).
- de Man, F. S., et al. Bisoprolol delays progression towards right heart failure in experimental pulmonary hypertension. Circ Heart Fail. 5, 97-105 (2012).
- de Man, F. S., et al. Dysregulated renin-angiotensin-aldosterone system contributes to pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Crit Care Med. 186, 780-789 (2012).
- Pritts, C. D., Pearl, R. G. Anesthesia for patients with pulmonary hypertension. Curr Opin Anaesthesiol. 23, 411-416 (2010).
- Paulin, R., et al. A miR-208-Mef2 Axis Drives the Decompensation of Right Ventricular Function in Pulmonary Hypertension. Circ Res. 116, 56-69 (2015).
- Brittain, E., Penner, N. L., West, J., Hemnes, A. Echocardiographic assessment of the right heart in mice. J Vis Exp. , (2013).
- Cheng, H. W., et al. Assessment of right ventricular structure and function in mouse model of pulmonary artery constriction by transthoracic echocardiography. J Vis Exp. , e51041 (2014).
