Abstract
Fagocytos är en grundläggande process genom vilken medfödda immunceller uppsluka bakterier, apoptotiska celler eller andra främmande partiklar i syfte att döda eller neutralisera den intagna materialet, eller att presentera den som antigener och initiera adaptiva immunsvar. PH för fagosomer är en kritisk parameter som reglerar fission eller fusion med endomembranes och aktivering av proteolytiska enzymer, händelser som tillåter den fagocytiska vakuolen att mogna till en nedbrytande organell. Dessutom krävs translokering av H + för produktion av höga nivåer av reaktiva syreradikaler (ROS), som är väsentliga för effektiv dödande och signalering till andra värdvävnader. Många intracellulära patogener gräva fagocytisk dödande genom att begränsa phagosomal försurning, betonar vikten av pH phagosome biologi. Här beskriver vi en kvotmetrisk metod för att mäta phagosomal pH i neutrofiler använder fluoresceinisotiocyanat (FITC) -märkt zymosan som fagocytisk targets och levande cell imaging. Analysen är baserad på fluorescensegenskaperna hos FITC, som är kylda genom surt pH när den exciteras vid 490 nm men inte när den exciteras vid 440 nm, vilket tillåter kvantifiering av en pH-beroende-förhållande, i stället för absolut fluorescens, av en enda färgämne. En detaljerat protokoll för att utföra in situ färgkalibrering och konvertering av förhållandet till riktiga pH-värden finns också. Single-dye ratiometriska metoder anses allmänt överlägsen enda våglängd eller dubbla färgpseudo ratiometrisk protokoll, eftersom de är mindre känsliga för störningar såsom blekning, fokusera förändringar, laser variationer, och ojämn märkning, som snedvrider den uppmätta signalen. Denna metod kan lätt modifieras för att mäta pH-värdet i andra fagocytiska celltyper, och zymosan kan ersättas av någon annan amininnehållande partikeln, från inerta pärlor att levande mikroorganismer. Slutligen kan detta förfarande anpassas för att utnyttja andra fluorescerande prober som är känsliga för olika pH-områden eller andra phagosomal verksamhet, vilket gör det till en allmän protokoll för funktionell avbildning av fagosomer.
Protocol
Etik uttalande: Alla djur manipulationer utfördes i strikt enlighet med riktlinjerna i den kommitté Animal Research vid universitetet i Genève.
1. Framställning av Fagocytiska mål
- Tillsätt 20 mg av torkad zymosan till 10 ml steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Vortexa och värme i ett kokande vattenbad under 10 minuter. Kyl och centrifugera vid 2000 xg under 5 minuter.
- Avlägsna supernatanten, återsuspendera i 1 ml PBS och sonikeras under 10 min i ett vattenbad sonikator. Överför 500 l till två 1,5 ml rör. Centrifugera vid 11.000 xg under 5 minuter.
- Upprepa tvätta med 500 l PBS. Kokt zymosan kan alikvoteras, fryst och lagrades vid -20 ° C.
- Tvätta zymosan två gånger i 500 l nylagade 0,1 M Na 2 CO 3, pH 9.3 enligt ovan (steg 1,2).
- Resuspendera i 490 ul efter den slutliga tvätten. Tillsätt 10 pl av 10 mg / ml FITC löstes i dimetylsulfoxide (DMSO), virvel, täck med folie, och inkubera med omrörning under 4 h vid RT.
- För att ta bort obundet färgämne, tvätta som ovan (steg 1,2), först med 0,5 ml DMSO + 150 pl PBS, därefter 0,5 ml DMSO + 300 pl PBS, därefter 0,5 ml DMSO + 450 pl PBS, sedan PBS enbart.
- Räkna zymosan med hjälp av en hemocytometer. Tillsätt 1 pl av zymosan till 500 pl PBS, virvel, lägg sedan till 10 pl till kanten av haemocytometer kammaren, där den möter täck placeras över centrala elnätet. Montera hemocytometer på en ljus-fält mikroskop utrustat med en 20X mål.
- Fokusera på det övre vänstra hörnet som innehåller 16 rutor och räkna alla zymosan partiklar inom detta område med hjälp av en hand stämmer räknare. Upprepa med den nedre högra hörnet. Beräkna zymosan koncentration med användning av följande ekvation: Zymosan koncentration = Count / 2 x 500 x 10 4 zymosan / ml. Märkt zymosan kan alikvoteras, frystes och lagrades vid -20 ° C.
- Opsonisera den märkta zymosan with en kanin-anti-zymosan antikropp vid 1: 100 utspädning. Vortexa och inkubera under 1 h i en 37 ° C vattenbad. Tvätta med 500 | il PBS som ovan (steg 1,2).
Obs: Sonikering rekommenderas starkt, särskilt efter opsonisering, som zymosan tenderar att bilda klumpar som kan göra analysen svårare senare. Opsonisering med 65% volym / volym rått- eller humanserum kan användas som ett alternativ. - Räkna zymosan med hjälp av en hemocytometer som beskrivs i steg 1,7-1,8, och späd till 100 x 10 6 partiklar / ml. Opsonisering med andra fagocytiska stimulatorer, såsom komplement eller ingen opsonisering, alternativt kan utföras.
2. Live Video Mikroskopi
- Isolera primära mus neutrofiler som beskrivs i detalj på annan plats 38.
- Alternativt kan du använda någon fagocytiska celltyp. Håll neutrofiler på is i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium kompletterat med 5% fetalt kalvserum (volym / volym), 200 U penicillin / streptomycin, vid en koncentration av 10 x 10 6 celler / ml tills klar för användning. Andra celltyper kan seedas 1-4 dagar innan.
- Lägg 2 x 10 5 (20 | al) av neutrofiler till centrum av en 35 mm glas-nedre skålen, sprida droppen genom tillsats av 50 | il medium och inkubera vid 37 ° C under 5 min för att tillåta cellerna att vidhäfta.
- Tillsätt 1 ml av Hanks balanserade saltlösning (HBSS) värmdes till 37 ° C som innehåller den specifika MPO inhibitom 4-aminobensoesyra hydrazid (4-ABH, 10 | iM). Ospecifika MPO-hämmare, såsom natriumazid (5 mM), kan också användas, men har nyligen föreslagit att utöva ytterligare icke-specifika effekter på pH 39.
- Montera skålen på en widefield fluorescensmikroskop utrustat med ett 37 ° C värmesystemet och en 40X olja mål. Inkubera cellerna utan avbildning under 10 min för att tillåta cellerna och utrustning för att ekvilibrera.
- Justera inställningarna mikroskop för att förvärva ett ljust fält överförings bild [phase eller differential interferens kontrast (DIC) om tillgängligt] med 440 nm eller 490 nm excitation och 535 nm emission var 30 sekund.
- Justera exponeringstiden och förvärvsfrekvens enligt mikroskop för att undvika alltför mycket fotoblekning och fototoxicitet och beroende på de experimentella frågor ställs. Börja bildtagning.
- Efter två minuter, tillsätt 10 x 10 6 (50 ^) opsoniserad FITC-zymosan till mitten av skålen. Justera mål: cellförhållanden beroende på vilken typ av fagocytsystemet och mål används.
- Fortsätt avbildning under 30 minuter. Efter 30 min stoppa time-lapse förvärv och starta en timer. Flytta scenen och ta 10 eller fler bilder i olika synfält att avbilda andra fagosomer, alla inom 5 minuter.
3. Kalibrerings- och kontrollexperiment
- Förbered pH kalibreringslösningarna (recept beskrivs i tabell 1) före dagen för experimentet och frysa i 10 ml portioner.Tina kalibreringslösningar och varm till 37 ° C i ett vattenbad. Kontrollera pH med en pH-meter och registrera den faktiska pH-värdet hos lösningar.
- Montera en peristaltisk pump på glaset nedre skålen före bildtagning och uppträda live video mikroskopi som beskrivits ovan (avsnitt 2).
- I slutet av 30 min förvärvsperiod slå på pumpen för att avlägsna lösningen i skålen, tillsätt 1 ml av den första kalibreringslösningen och stoppa pumpen.
- Vänta tills signalen stabiliseras, vanligen 5 min. Upprepa med varje kalibreringslösning.
- Utför minst en kalibrering per experimentell dag, och kalibrera börja med det högsta pH och arbetar sekventiellt till det lägsta, samt utgående från det lägsta pH-värdet och arbetar sekventiellt mot den högsta.
- Som en kontroll, tillsätt 100 pl av 100 pM NADPH-oxidas hämmare difenyl propionium jodid (DPI) utspädd i HBSS till celler i 900 ul HBSS i glaset nedre skålen, ochinkubera i 10 minuter.
- Starta förvärv och lägg zymosan som ovan (steg 2,7). Efter 15 min av fagocytos, tillsätt 10 | il av 10 ^ M V-ATPas-inhibitor concanamycin A (ConcA) utspädda i HBSS och fortsätt avbildning under ytterligare 15 minuter.
4. Analys
- Analys av tidsförlopp filmer och phagosome snapshots.
Obs: Följande instruktioner är specifika för ImageJ. Steg-för-steg-instruktioner kan variera mycket beroende på den programvara som används, men de funktioner som beskrivs i detta avsnitt finns i de flesta professionella bildanalysmjukvara.- Öppna bilder med professionell bildanalysmjukvara. Subtrahera bakgrunden i 490-kanalen genom att rita ett litet torg ROI med kvadraten polygon markeringsverktyget i ett område där det inte finns några celler, och klicka på Plugins> BG Subtraktion från ROI. Sedan ladda upp samma ROI på 440 kanal genom att klicka på Redigera> Val> Återställ Urval och upprepa.
- Gör en 32-bitars förhållandet bild av 490 kanaler dividerat med 440 kanal genom att klicka på Process> Bild Calculator ..., välja lämpliga bilder i Bild1 och Image2 rullgardinsmenyer, sedan välja "Divide" i rullgardinsmenyn Drift och kontroll av 32-bitars (float) resultat kryssrutan.
- Ändra färgkodning uppslagstabell till ett förhållande-kompatibel färgkodning genom att klicka Image> uppslagstabeller> Rainbow RGB. Tröskel förhållandet bilden för att eliminera 0 och oändlighet punkter genom att klicka på Bild> Justera> Tröskel .... Justera rullningslisterna så att zymosan visas i rött och klicka på Verkställ, och se till att ställa in bakgrunds pixlar NaN kryssrutan till är markerad.
- Kombinera detta förhållande stack med den ljusa fält kanal i ett flerkanaligt komposit genom att klicka på Bild> Färga> Merge kanaler, och välja den ljusa fält bild i den grå kanalen rullgardinsmenyn och förhållandet bilden i den gröna kanalen rullgardinsmenyn och val avHåll källbilder kryssrutan. Scan time-lapse filmer eller bilder för att avgöra vilka fagosomer ska analyseras. Den ljusfältskanalen är användbar för detta.
- Rita områden av intresse (ROI) med den ovala polygon markeringsverktyget runt fagosomer, och lägga till dem i ROI manager genom att klicka på Analyze> Verktyg> ROI Manager> Lägg till. Mät deras zymosan intensitetsförhållandet genom att klicka på Mer> Multi-Mät och de-välja En rad per skiva kryssrutan.
- För tidsförlopp filmer, fagosomer spår ett i taget genom att dra en ROI, skriva Ctrl + M för att mäta varje tidpunkt, och flytta ROI när det är nödvändigt för att spåra intensitetsvärden över tiden. Kopiera mätningarna från resultatfönstret till ett kalkylprogram.
Obs: Analys av 15 (5 tidsförlopp per experiment x 3) oberoende experiment är perfekt, men mer eller mindre kan krävas beroende på variabiliteten observerats. Spara ROI alltid rekommenderas. Vissa programpaket tillåter bild registration och dynamisk uppdatering av ROI, underlätta denna del av analysen.
- Omvandling från fluorescens till pH-värden
- Mät 490/440 förhållande för fagosomer i kalibreringstidsförlopp filmer som beskrivs i avsnitt 4.1.
- I ett kalkylblad, plotta förhållandet värden över tiden och beräkna det genomsnittliga förhållandet värden från alla fagosomer inom synfältet (vanligtvis mellan 5-20) från 5 tidpunkter inom mitten av tidsperioden som motsvarar varje pH-kalibrering lösning. (Se också de röda rutorna i fig 5A.)
- Rita dessa genomsnittliga 490/440 förhållandevärden mot den faktiska uppmätta pH. Kombinera minst 3 oberoende kalibreringar i en enda graf. Använd en statistisk eller numerisk paket programvara för att utföra en icke-linjär regression (bästa passform kurvan), vanligtvis en sigmoidal ekvation.
Obs: Till exempel i figur 5B ekvationen som användes var en Boltzmann sigmoidal [Y = Bottom + ((Top-Bottom)/ (1 + EXP ((V50-X) / Slope))], där Y-värdena är 490/440 förhållanden X är pH-värden och Top, Bottom, är V50 och lutning parametrar som beräknas av programvaran. - Använd den erhållna ekvationen för att transformera förhållandevärden på pH.
Obs: Till exempel, i figur 5B ekvationen erhålls för kalibreringskurvan i närvaro av natriumazid är 490/440-förhållande = 1,103 + [(2,89-1,103) / (1 + exp ((6,993-pH) /0.9291)] . Lösa för pH ger följande ekvation: pH = 6,993 - ,9291 * [LN ((1,178 / (Förhållande-1,103)) - 1))].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Följande är representativa resultat för ett experiment där phagosomal pH av primära mus neutrofiler isolerade från benmärgen av vildtyp eller Hvcn1 - / - möss jämfördes. För ett lyckat experiment, är det viktigt att få tillräckligt med fagosomer inom synfältet under hela den tid som time-lapse film, samtidigt som man undviker alltför många fagosomer, som senare kommer att bli svårare att segmentet under bildanalysen. Figur 1 visar exempel på bra och dåliga confluencies. För tidsberoende och snapshot analyser måste zymosan partiklar externa skiljas från fagosomer och uteslutas från analysen. Figur 2 visar hur ljusfält bild kan vara användbart för att skilja zymosan partiklar externa från fagosomer. Figur 3 visar exempel på typiska phagosome pH tids kurser i vildtypen jämfört med Hvcn1 - / - Figur 4 illustrerar effekten av att tillsätta den NADPH-oxidashämmare DPI, vilket resulterar i en snabb surgöring, följt av tillsats av V-ATPas-inhibitor ConcA, som vänder den försurning. Sådana experiment kan vara avgörande för att bevisa att pH-känsliga prober arbetar inom fagosomer som de ska. En typisk kalibrerings tidsförloppet representeras i figur 5, med rektanglar anger olika kvotvärden används för att konstruera kalibreringskurvan. Figur 5 visar dessutom hur färga klorering genom MPO aktivitet kan påverka intraphagosomal pH-svar av FITC, belyser det faktum att sönder kan reagerar annorlunda än väntat inom phagoso mal miljö och vikten av i kalibrerings situ.
Figur 1. Lämplig konfluens och mål: cellförhållande Den vänstra panelen visar ett exempel där cell confluency är alltför glesa och målet. Cellförhållande är för låg, vilket minskar sannolikheten för att en fagocytisk händelsen kommer att ske i synfältet. Den mellersta panelen visar ett exempel där cell confluency är för hög och celler trängs. Under dessa betingelser kan celler inte tillräckligt med utrymme för att röra sig och hitta sina mål, eller kan krypa över varandra gör analys svårare senare. Den högra panelen visar en ideal cell konfluens och ursprungliga målet: cellförhållande, där många celler och mål kan setts och ändå tydligt skiljas från varandra. FITC-zymosan visas i grönt och skal stapel representerar 10 mikrometer. /ftp_upload/53402/53402fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Utmärkande fagosomer och uningested zymosan. Den vänstra panelen visar en sammanslagen ljusfält bild och en 490/440 FITC-zymosan förhållande, medan den högra panelen visar ljusfält i sig. Fagosomer (små gröna pilar) kan skiljas från externa partiklar, som antingen inte samar lokalisera med celler (kort röd pil) eller vars fluorescens inte matcha upp med en mörk centrum (lång röd pil) omges av en ljusare ring, karaktäristiska av fagosomer i den ljusa fältbild (gröna pilar). Skal staplarna representerar 10 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Tids kurser, genomsnittliga pH och förhållandet histogram av vild-typ och Hvcn1 - / -. Neutrofila fagosomer (A) Typiska tidsförlopp för phagosomal pH visar att medan vildtypen neutrofiler (blå) pH är neutralt (streckad linje ) eller svagt alkalisk (heldragen linje) under tidiga tidpunkter efter intag, de fagosomer i Hvcn1 - / - neutrofiler (röd) kan antingen alkalinize (heldragen linje) eller surgör (streckad linje). (B) Kompilera ögonblicksbilder tas 30-35 min efter tillsats av mål tillåter den genomsnittliga befolkningen phagosomal pH skall räknas från ett stort antal fagosomer (vildtyp: n = 5/1898 / 383 och Hvcn1 - / -: n = 6 / 1433/451 experiment / fagosomer / celler, barer är medel ± SEM, NS ej signifikant). (C) Histogram av FITC-zymosaN-förhållanden avslöjar skillnader i phagosomal pH mellan vildtyp och Hvcn1 - / - neutrofiler. (Denna siffra har modifierats [19], med tillåtelse.) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Effekter av NADPH-oxidas hämmare DPI och V-ATPas-inhibitor ConcA på phagosomal pH. Förinkubation i 10 iM DPI resulterade i en snabb försurning av fagosomer strax efter intag, som vändes genom tillsats av 100 nM ConcA (pil). (Denna siffra har modifierats [19], med tillåtelse.) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. pH-kalibrering tidsförloppet och effekter av MPO inhibition på kalibrering av FITC-zymosan. (A) En typisk pH kalibreringskurva för intraphagosomal FITC-zymosan. Röda rutor indikerar olika kvotvärden används för att konstruera kalibreringskurvan. De faktiska pH-värden hos de använda lösningarna och de tidpunkter vid vilka lösningarna byts indikeras med pilar. Kurvan representerar medelvärdet av 10 fagosomer inom en enskild synfält. (B) Hämning av MPO med den icke-specifika inhibitorn natriumazid (5 mM, MPO Inh) ökar det dynamiska området för intraphagosomal FITC-zymosan pH-beroende svar. Punkter är medelvärden ± SEM (Denna siffra har modifierats [19], med tillåtelse.) Klicka här för att se en larger version av denna figur.
| 1,1 | (2x) Bas | |||||
| Buffertar | Stock | Slutlig (1x) | För 500 ml (2x) | |||
| KCl | 1 M | 140 mM | 140 ml | |||
| MgCl2 | 1 M | 1 mM | 1 ml | |||
| EGTA | 1 M | 0,2 mM | 0,2 ml | |||
| NaCI | 1 M | 20 mM | 20 ml | |||
| 1,2 | Buffertar | Stock | Slutlig(1x) | Syfte | ||
| MES | 1 M | 20 mM | för pH 5,5-6,5 | |||
| HEPES | 1 M | 20 mM | för pH 7,0-7,5 | |||
| Tris | 1 M | 20 mM | för pH 5,5-6,7 | |||
| NMDG | 1 M | 20 mM | för pH 5,5-6,8 | |||
| 1,3 | Jonoforer | Stock (100% EtOH) | Slutlig (1x) | |||
| Nigericin | 5 mg / ml | 5 ^ g / ml | ||||
| Monensin | 50 mM | 5 pM | ||||
| 1,4 | För 50 ml | |||||
| pH | 2x Base | Buffert Typ | Buffert vol. | Nigericin | Monensin | |
| 5,0 | 25 ml | MES | 1 ml | 50 ^ | 5 pl | |
| 5,5 | 25 ml | MES | 1 ml | 50 ^ | 5 pl | |
| 6,0 | 25 ml | MES | 1 ml | 50 ^ | 5 pl | |
| 6,5 | MES | 1 ml | 50 ^ | 5 pl | ||
| 7,0 | 25 ml | HEPES | 1 ml | 50 ^ | 5 pl | |
| 7,5 | 25 ml | HEPES | 1 ml | 50 ^ | 5 pl | |
| 8,0 | 25 ml | Tris | 1 ml | 50 ^ | 5 pl | |
| 8,5 | 25 ml | Tris | 1 ml | 50 ^ | 5 pl | |
| 9,0 | 25 ml | Tris | 1 ml | 50 ^ | 5 pl | |
| 9,5 | 25 ml | NMDG | 1 ml | 50 ^ | 5 pl | |
| Justera pH medKOH eller HCl | ||||||
Tabell 1. Recept för framställning av kalibreringslösningar. 1,1) Recept för framställning av 500 ml av en 2 x baslösning. 1,2) Recept för framställning av de olika buffertarna som används enligt pH hos kalibreringslösningen. 1,3) Recept för framställning av de jonoforer som används i kalibreringslösningarna. 1,4) Recept för framställning av 50 ml för varje kalibreringslösning med hjälp av bas, buffertar och jonoforer som beskrivs i 1,1-1,3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även om mer tidskrävande än alternativa metoder, såsom spektroskopi och FACS, som sysselsätter en liknande strategi att använda ett pH-känsligt färgämne som är kopplad till mål men mäta den genomsnittliga pH-värdet hos en population av fagosomer, erbjuder mikroskopi flera fördelar. Först är att den interna och externa bunden, men inte internaliseras, kan partiklar lätt urskiljas utan att behöva lägga till andra kemikalier, såsom trypanblått eller antikroppar, att släcka eller märka externa partiklar, respektive. Andra är att följa cellerna i realtid tillåter forskarna att observera flera aspekter av fagocytiska processen samtidigt och så effekter på migration, avkänning och bindande partiklar kan lätt urskiljas här, medan det kan förbises med populationsbaserade metoder. Dessutom synkronisering av initieringen av fagocytos, ofta genom att placera celler vid 4 ° C, som kan störa andra händelser trafficking grund av köldchock 40,41, finns ingett nödvändigt eftersom tiden noll kan skönjas direkt. Det är när uppträder live mikroskopi, detta 4 ° synkroniserings C tekniken rekommenderas inte om att fånga tidsperioder nära inledningen av fagocytos som kondens som bildas på botten av skålen under temperaturförändringen kan blanda med målet immersionsolja och temperaturskillnader mellan de värmande skålen och mikroskop komponenter kan orsaka fokus skiftar. En tredje fördel härrör från det faktum att fagosomer är i sig heterogena på flera parametrar innefattande, men inte begränsade till, pH 42, och vissa effekter på phagosome pH kan vara mer subtil, ändrar fördelningen av phagosomal pH snarare än den genomsnittliga befolkningen, såsom visades i figur 3. Sådana observationer kan ge djupare mekanistiska insikter i regleringen av phagosomal pH.
I den aktuella studien, var FITC valdes som pH-känsligt färgämne av val eftersom det ärbillig, allmänt tillgängliga, och viktigare har ett pKa av 6,5 med ett dynamiskt område som omfattar pH 3 till 9 i sin fria form 37, som matchade den ursprungligen förväntades pH-området för neutralt till svagt alkaliskt, enligt tidigare studier 29,30. Mer nyligen en studie med användning av ett annat pH-sond som kallas Snarf, som har en mer grundläggande pKa på 7,5, oväntat beräknade pH-värden som sträcker sig 1-2 pH-enheter mer basisk för både vildtyp och Hvcn1 - / - neutrofila fagosomer 39. Sålunda är valet av pH-sensorn en viktig parameter att beakta beroende på tillämpningen. I princip kan den metod som presenteras här enkelt anpassas att använda andra pH-känsliga färgämnen, såsom Snarf och 2 ', 7'-bis- (2-karboxietyl) -5- (och-6) -karboxifluorescein (BCECF), vars succinimidyl-esterderivat kan lätt kopplas till amininnehållande partiklar, såsom zymosan. I själva verket behöver sensorer inte begränsas till fluorescerande färgämnen, såsom ratiometric pH-känsliga proteiner, såsom en Sypher 43, kunde transduceras och uttryckta av mikroorganismer. Flera icke-kvotmetriska alternativ finns också, i synnerhet röda versionen av färgämnet pHrodo, som kan användas i samband med grönt fluorescerande protein (GFP)-märkt proteiner eller det pH-känsliga proteinet pHluorin. Men på grund av de potentiellt stora effekter som den hårda intraphagosomal miljön kan ha på färgämnen och proteiner riktade däri, bör dessa sönder vara åtminstone i kombination med pH-okänsliga prober som skall användas vid härledning av en pseudo-förhållande. Såsom exemplifieras i fig 5, kan kalibreringar experiment exponera effekterna av färgämne skador som en minskad eller förvrängd dynamiskt område. En praktisk kommentar, kalibreringsexperiment är inte alltid perfekt och kan vara omöjligt att utföra efter varje experiment. Följaktligen kan förhållandevärden ibland falla ut ur området kalibrering och ge omöjliga värderingar konvertering till pH. Den kan approprIate antingen uttrycka dessa off-skalan värden som "större / mindre än eller lika med" högsta och lägsta kalibrerings pH-värden, eller för att uttrycka alla värden som förhållanden och uppskattning pH-områden att de genomsnittliga förhållanden representerar.
Som framgår av DPI och ConcA styr, ROS produktion och V-ATPas-aktivitet är viktiga faktorer som avgör phagosomal pH. Faktum är att i många situationer, kan förändringar i nivåer av ROS produktion bakom skillnader i phagosomal pH, i synnerhet i neutrofiler, och mätning av phagosomal ROS produktion och pH går ofta hand i hand. Ett varningens ord är att båda läkemedlen lånar inblick i aktiviteten hos de enzymer som de hämmar men inte deras plats i cellen. Båda enzymerna är multi-subenhet komplex vars individuella komponenter måste trafik till fagosomer 4, och deras brist på aktivitet på fagosomer kan bli följden av människohandel eller monterings defekter snarare än direkta effekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zymosan A powder | Sigma-Aldrich | Z4250 | Various providers exist |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F7250 | Various providers exist |
| Anti-zymosan antibody (Zymosan A Bioparticles opsonizing reagent) | Life Technologies | Z2850 | Sigma-Aldrich O6637 is an equivalent product. Alternatively 25% serum can be used as an opsonizing reagent. |
| 4-Aminobenzoic hydrazide (4-ABH) | Santa Cruz | sc-204107 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Diphenyleneiodonium chloride (DPI) | Sigma-Aldrich | D2926 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Concanamycin A (ConcA) | Sigma-Aldrich | 27689 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Monensin | Enzo | ALX-380-026-G001 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14200-075 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Hank's balance salt solution | Life Technologies | 14025092 | Ringer's balanced salt solution or other clear physiological buffers may be substituted. |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S7795 | Various providers exist |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | Various providers exist |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | Various providers exist |
| N-Methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | Various providers exist |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | 3777 | Various providers exist |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | T1503 | Various providers exist |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | Various providers exist |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Various providers exist |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | Various providers exist |
| Absolute Ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 2860 | Various providers exist |
| Glass-bottom 35 mm petri dishes (Fluorodish) | World Precision Instruments | FD35-100 | Ibidi µ-clear dishes or coverslips with appropriate imaging chambers may be sustituted |
| Sonicating water bath | O. Kleiner AG | A sonicator may be used instead, various instrument providers exist | |
| Heamocytometer | Marienfeld GmbH | Various instrument providers exist | |
| Widefield live imaging microscope | Carl Zeiss AG | Various instrument providers exist, but the microscope must be able to image 440/535 and 490/535 excitation/emission respective. Spinning disk confocal set-ups with brightfield capabilities may substituted, but zymosan tend to go out of focus more often. | |
| Peristaltic pump (Dynamax RP-1) | Rainin | Various instrument providers exist | |
| pH meter | Schott Gerate GmbH | Various instrument providers exist | |
| Manual Counter | Milian SA | Various instrument providers exist |
References
- Yeung, T., Grinstein, S. Lipid signaling and the modulation of surface charge during phagocytosis. Immunol Rev. 219, 17-36 (2007).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
- Fairn, G. D., Grinstein, S. How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes. Trends Immunol. 33 (8), 397-405 (2012).
- Nunes, P., Demaurex, N., Dinauer, M. C. Regulation of the NADPH oxidase and associated ion fluxes during phagocytosis. Traffic. 14 (11), 1118-1131 (2013).
- Binder, B., Holzhutter, H. G. A hypothetical model of cargo-selective rab recruitment during organelle maturation. Cell Biochem Biophys. 63 (1), 59-71 (2012).
- Hurtado-Lorenzo, A., et al. V-ATPase interacts with ARNO and Arf6 in early endosomes and regulates the protein degradative pathway. Nat Cell Biol. 8 (2), 124-136 (2006).
- Weisz, O. A.
- Huynh, K. K., Grinstein, S. Regulation of vacuolar pH and its modulation by some microbial species. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (3), 452-462 (2007).
- De Vito, P. The sodium/hydrogen exchanger: a possible mediator of immunity. Cell Immunol. 240 (2), 69-85 (2006).
- Moreland, J. G., Davis, A. P., Bailey, G., Nauseef, W. M., Lamb, F. S. Anion channels, including ClC-3, are required for normal neutrophil oxidative function, phagocytosis, and transendothelial migration. J Biol Chem. 281 (18), 12277-12288 (2006).
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome. Antioxid Redox Signal. 18 (6), 642-660 (2013).
- Seredenina, T., Demaurex, N., Krause, K. H. Voltage-Gated Proton Channels as Novel Drug Targets: From NADPH Oxidase Regulation to Sperm Biology. Antioxid Redox Signal. , (2014).
- Kotsias, F., Hoffmann, E., Amigorena, S., Savina, A. Reactive oxygen species production in the phagosome: impact on antigen presentation in dendritic cells. Antioxid Redox Signal. 18 (6), 714-729 (2013).
- Grimm, M. J., et al. Monocyte- and macrophage-targeted NADPH oxidase mediates antifungal host defense and regulation of acute inflammation in mice. J Immunol. 190 (8), 4175-4184 (2013).
- West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
- Bloomfield, G., Pears, C. Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium. J Cell Sci.. 116 (Pt 16), 3387-3397 (2003).
- Ramsey, I. S., Moran, M. M., Chong, J. A., Clapham, D. E. A voltage-gated proton-selective channel lacking the pore domain. Nature. 440 (7088), 1213-1216 (2006).
- El Chemaly, A., Demaurex, N. Do Hv1 proton channels regulate the ionic and redox homeostasis of phagosomes? Mol Cell Endocrinol. 353 (1-2), 82-87 (2012).
- El Chemaly, A., Nunes, P., Jimaja, W., Castelbou, C., Demaurex, N. Hv1 proton channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophage phagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit the delivery of vacuolar ATPases. J Leukoc Biol. , (2014).
- Decoursey, T. E.
- Ramsey, I. S., Ruchti, E., Kaczmarek, J. S., Clapham, D. E. Hv1 proton channels are required for high-level NADPH oxidase-dependent superoxide production during the phagocyte respiratory burst. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (18), 7642-7647 (2009).
- Sturgill-Koszycki, S., et al. Lack of acidification in Mycobacterium phagosomes produced by exclusion of the vesicular proton-ATPase. Science. 263 (5147), 678-681 (1994).
- Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Virulent and avirulent strains of Francisella tularensis prevent acidification and maturation of their phagosomes and escape into the cytoplasm in human macrophages. Infect Immun. 72 (6), 3204-3217 (2004).
- Alpuche-Aranda, C. M., Swanson, J. A., Loomis, W. P., Miller, S. I. Salmonella typhimurium activates virulence gene transcription within acidified macrophage phagosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (21), 10079-10083 (1992).
- Lukacs, G. L., Rotstein, O. D., Grinstein, S. Determinants of the phagosomal pH in macrophages. In situ assessment of vacuolar H(+)-ATPase activity, counterion conductance, and H+ 'leak'. J Biol Chem. 266 (36), 24540-24548 (1991).
- Watanabe, K., Kagaya, K., Yamada, T., Fukazawa, Y. Mechanism for candidacidal activity in macrophages activated by recombinant gamma interferon. Infect Immun. 59 (2), 521-528 (1991).
- Ip, W. K., et al. Phagocytosis and phagosome acidification are required for pathogen processing and MyD88-dependent responses to Staphylococcus aureus. J Immunol. 184 (12), 7071-7081 (2010).
- Clarke, M., Maddera, L. Phagocyte meets prey: uptake, internalization, and killing of bacteria by Dictyostelium amoebae. Eur J Cell Biol. 85 (9-10), 1001-1010 (2006).
- Jankowski, A., Scott, C. C., Grinstein, S.
- Segal, A. W., Geisow, M., Garcia, R., Harper, A., Miller, R. The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH. Nature. 290 (5805), 406-409 (1981).
- Savina, A., et al. NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells. Cell. 126 (1), 205-218 (2006).
- Rybicka, J. M., Balce, D. R., Chaudhuri, S., Allan, E. R., Yates, R. M. Phagosomal proteolysis in dendritic cells is modulated by NADPH oxidase in a pH-independent manner. EMBO J. 31 (4), 932-944 (2012).
- Mantegazza, A. R., et al. NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells. Blood. 112 (12), 4712-4722 (2008).
- Balce, D. R., Allan, E. R., McKenna, N., Yates, R. M. gamma-Interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT) maintains phagosomal proteolysis in alternatively activated macrophages. J Biol Chem. 289 (46), 31891-31904 (2014).
- Sanjurjo, L., et al. The scavenger protein apoptosis inhibitor of macrophages (AIM) potentiates the antimicrobial response against Mycobacterium tuberculosis by enhancing autophagy. PLoS One. 8 (11), e79670 (2013).
- Yuan, Z., Zhi, L., Li-Juan, Z., Hong-Tao, X. The Utility of Chloroquine in Cancer Therapy. Curr Med Res Opin. , 1-12 (2015).
- Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).
- El Chemaly, A., et al. VSOP/Hv1 proton channels sustain calcium entry, neutrophil migration, and superoxide production by limiting cell depolarization and acidification. J Exp Med. 207 (1), 129-139 (2010).
- Levine, A. P., Duchen, M. R., Segal, A. W. The HVCN1 channel conducts protons into the phagocytic vacuole of neutrophils to produce a physiologically alkaline pH. bioRxiv. , (2014).
- Al-Fageeh, M. B., Smales, C. M. Control and regulation of the cellular responses to cold shock: the responses in yeast and mammalian systems. Biochem J. 397 (2), 247-259 (2006).
- Yui, N., et al. Basolateral targeting and microtubule-dependent transcytosis of the aquaporin-2 water channel. Am J Physiol Cell Physiol. 304 (1), C38-C48 (2013).
- Griffiths, G. On phagosome individuality and membrane signalling networks. Trends Cell Biol. 14 (7), 343-351 (2004).
- Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).
