Abstract
Fagocytose is een fundamenteel proces waarmee aangeboren immuuncellen overspoelen bacteriën, apoptotische cellen of andere vreemde deeltjes om te doden of neutraliseren ingeslikt materiaal, of het te presenteren als antigenen en start adaptieve immuunreacties. De pH van phagosomes is een kritische parameter reguleren splitsing of fusie met endomembranes en activering van proteolytische enzymen, gebeurtenissen die het mogelijk maken de fagocytische vacuole om te rijpen in een afbrekende organel. Bovendien wordt translocatie van H + nodig voor de productie van hoge niveaus van reactieve zuurstof species (ROS), die essentieel zijn voor efficiënt doden en signalering naar andere gastheer weefsels. Vele intracellulaire pathogenen ondermijnen fagocytische doden door het beperken van phagosomal verzuring, met de nadruk op het belang van de pH in phagosome biologie. Hier beschrijven we een ratiometrische methode voor het meten phagosomal pH in neutrofielen via fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) -gelabeld zymosan als fagocytische targets, en live-cell imaging. De assay is gebaseerd op het fluorescentie-eigenschappen van FITC dat wordt afgeschrikt door zure pH wanneer geëxciteerd bij 490 nm maar niet wanneer geëxciteerd bij 440 nm, waardoor kwantificatie van een pH-afhankelijke verhouding, in plaats van absolute fluorescentie van een kleurstof. Een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van in situ calibratie kleurstof en omschakeling van verhouding echte pH-waarden is ook voorzien. Single-dye ratiometrische werkwijzen worden in het algemeen beschouwd als superieur voor één golflengte of dual-dye pseudo-ratiometrische protocol, omdat zij minder gevoelig voor storingen zoals bleken, focus verandert, laser variaties en onregelmatige labeling, waarbij het gemeten signaal verstoren. Deze werkwijze kan gemakkelijk worden aangepast aan pH in andere fagocytische celsoorten meten en zymosan kan worden vervangen door een andere amine-bevattende deeltjes uit inerte kralen levende micro-organismen. Tenslotte kan deze werkwijze worden aangepast voor toepassing van andere fluorescerende probes die gevoelig zijn voor verschillende pH-bereiken of andere phagosom makenal activiteiten, waardoor het een algemene protocol voor functionele beeldvorming van phagosomes.
Protocol
Ethiek Verklaring: Alle dierlijke manipulaties werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de richtlijnen van de Animal Research Committee van de Universiteit van Genève.
1. Voorbereiding van Fagocytische Doelen
- Voeg 20 mg gedroogd zymosan tot 10 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Vortex en warmte in een kokend waterbad gedurende 10 min. Koel en centrifugeer bij 2000 xg gedurende 5 min.
- Verwijder het supernatant, resuspendeer in 1 ml PBS en ultrasone trillingen gedurende 10 min in een waterbad ultrasoonapparaat. Breng 500 pi van twee 1,5 ml buizen. Centrifugeer bij 11.000 g gedurende 5 min.
- Herhaal het wassen met 500 pi PBS. De gekookte zymosan worden in porties verdeeld, ingevroren en bewaard bij -20 ° C.
- Was zymosan tweemaal in 500 pl vers bereide 0,1 M Na 2 CO 3, pH 9,3 zoals hierboven (stap 1,2).
- Resuspendeer in 490 ul na de laatste wasbeurt. Voeg 10 ul van 10 mg / ml FITC opgelost in dimethyl sulfoxide (DMSO), vortex, dek af met folie en incubeer onder schudden gedurende 4 uur bij KT.
- Ongebonden kleurstof te verwijderen, zoals hierboven beschreven wassen (stap 1,2), eerst met 0,5 ml DMSO + 150 pl PBS, vervolgens 0,5 ml DMSO + 300 pl PBS, vervolgens 0,5 ml DMSO + 450 pl PBS, vervolgens PBS alleen.
- Telling zymosan behulp van een hemocytometer. Voeg 1 pl zymosan tot 500 gl PBS, vortex, voeg 10 ul aan de rand van de hemocytometer kamer, waar het de dekglaasje geplaatst over het centrale rooster. Monteer de hemocytometer op een helder-veld microscoop uitgerust met een 20x doelstelling.
- Focus op de linker bovenhoek met 16 pleinen en tellen alle zymosan deeltjes in dit gebied met behulp van een hand telapparaat. Herhaal dit met de rechter bovenhoek. Bereken de zymosan concentratie met behulp van de volgende vergelijking: Zymosan concentratie = count / 2 x 500 x 10 4 zymosan / ml. Gelabelde zymosan worden in porties verdeeld, ingevroren en bewaard bij -20 ° C.
- Opsoniseren de gelabelde zymosan with een konijn anti-zymosan antilichaam bij 1: 100 verdunning. Vortex en incubeer 1 uur in een 37 ° C waterbad. Wassen met 500 pi PBS zoals hierboven (stap 1,2).
Opmerking: Sonicatie wordt sterk aanbevolen, vooral na opsonisatie, zoals zymosan neiging klonten die later nog moeilijker kan vormen. Opsonisatie met 65% v / v rat of humaan serum kan worden gebruikt als alternatief. - Count zymosan met behulp van een hemocytometer, zoals beschreven in de stappen 1,7-1,8, en verdun tot 100 x 10 6 deeltjes / ml. Opsonisatie met andere fagocytische stimulatoren, zoals complement of geen opsonisatie, kunnen als alternatief worden uitgevoerd.
2. Live Video Microscopie
- Isoleer primaire muis neutrofielen zoals in detail beschreven elders 38.
- U kunt ook gebruik maken van elke fagocytische celtype. Blijf neutrofielen op ijs in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium aangevuld met 5% foetaal kalfserum (v / v), 200 U penicilline / streptomycin, bij een concentratie van 10 x 10 6 cellen / ml tot aan gebruik. Andere celtypen kunnen 1-4 dagen voor worden gezaaid.
- Voeg 2 x 10 5 (20 pl) van neutrofielen naar het midden van een 35 mm glazen bodem schaal verspreid de druppel door toevoeging van 50 pl medium en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten om de cellen te hechten.
- Voeg 1 ml Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) verwarmd tot 37 ° C met de specifieke MPO remmer 4-aminobenzoëzuur hydrazide (ABH-4, 10 uM). Niet-specifieke MPO remmers, zoals natriumazide (5 mM), kunnen eveneens worden gebruikt, maar zijn onlangs voorgesteld om bijkomende niet-specifieke effecten op pH 39 uitoefenen.
- Monteer de schotel op een groothoek fluorescentiemicroscoop uitgerust met een 37 ° C verwarmingssysteem en een 40x olie doelstelling. Incubeer cellen zonder beeldvormende gedurende 10 minuten om de cellen en apparatuur in evenwicht.
- Pas de microscoop instellingen om een helder-veld transmissie verwerven [PHAse of differentiële interferentie contrast (DIC) indien beschikbaar] bij 440 nm of 490 nm excitatie en 535 nm emissie elke 30 sec.
- Pas belichtingstijd en verkrijging frequentie volgens microscoopsysteem teveel fotobleken en fototoxiciteit en afhankelijk van de experimentele vragen die gesteld voorkomen. Begin beeldacquisitie.
- Na 2 min, voeg 10 x 10 6 (50 ui) FITC-geopsoniseerd zymosan naar het midden van de schaal. Pas target: cel verhoudingen, afhankelijk van het type fagocyt en doel gebruikt.
- Verder beeldvorming voor 30 min. Na 30 minuten stoppen met de time-lapse acquisitie en start een timer. Verplaats het podium en vastleggen 10 of meer foto's in verschillende gebieden van het oog op het andere fagosomen, allemaal binnen 5 min.
3. kalibratie en controle-experimenten
- Bereid de pH ijkoplossingen (recepten worden beschreven in tabel 1) voorafgaand aan de dag van het experiment en vries in 10 ml aliquots.Ontdooi de ijkoplossingen en warm tot 37 ° C in een waterbad. Controleer de pH met een pH-meter en noteer de werkelijke pH van oplossingen.
- Monteer een peristaltische pomp aan de glazen bodem schaal voorafgaand aan het verwerven en uitvoeren van live video-microscopie, zoals hierboven (punt 2) beschreven.
- Aan het eind van de 30 min verwervingsperiode zet de pomp om de oplossing binnen de schaal te verwijderen, voeg 1 ml van de eerste ijkoplossing en stop de pomp.
- Wacht tot het signaal stabiliseert, meestal 5 min. Herhaal dit met elke kalibratie oplossing.
- Voer tenminste één kalibratie experimentele per dag en kalibreren beginnen met de hoogste pH en werken sequentieel de laagst, en vanaf de laagste pH en na elkaar werken naar de hoogste.
- Als controle, voeg 100 ul van 100 uM NADPH oxidase inhibitor difenyl propionium jodide (DPI) verdund in HBSS met cellen in 900 pi HBSS in het glas onderste schaal, enincubeer 10 min.
- Start acquisitie en voeg zymosan zoals hierboven (stap 2.7). Na 15 min van fagocytose, voeg 10 ul van 10 uM V-ATPase inhibitor concanamycin A (ConcA) verdund in HBSS en verder imaging gedurende nog 15 min.
4. Analyse
- Analyse van de time-lapse filmpjes en phagosome snapshots.
Opmerking: de volgende instructies zijn specifiek voor ImageJ. Stap-voor-stap instructies sterk kunnen variëren, afhankelijk van de software gebruikt, maar in dit hoofdstuk beschreven functies zijn beschikbaar in de meest professionele software voor beeldanalyse.- Open de beelden met professionele software voor beeldanalyse. Aftrekken van de achtergrond in de 490-kanaal door het tekenen van een klein plein ROI met het kwadraat polygoon selectietool in een gebied waar er geen cellen, en te klikken op Plugins> BG aftrekken van ROI. Upload dan dezelfde ROI op de 440 kanaal door te klikken op Bewerken> Selectie> Herstel Selectie en herhaal.
- Maak een 32-bits-verhouding beeld van de 490 kanaal gedeeld door de 440-kanaal door te klikken Process> Afbeelding Calculator ..., de juiste beelden te selecteren in het Image1 en Image2 drop-down menu's, dan kiezen voor 'Divide' in de Operation drop-down menu , en het controleren van het resultaat check-box 32-bit (float).
- Verander de kleurcodering look-up tafel met een verhouding-compatibele kleurcodering door te klikken op Afbeelding> Lookup Tables> Rainbow RGB. Image de verhouding drempel tot 0 en oneindigheid pixels te elimineren door te klikken op Afbeelding> Aanpassen> Drempel .... Stel de schuifbalken zodat zymosan verschijnt in rood en klik op Toepassen, zorg ervoor dat de set achtergrond pixels om NaN is ingeschakeld.
- Combineer deze verhouding stapel met de heldere-veld kanaal in een multi-channel samengestelde door te klikken op Afbeelding> Kleur> Kanalen samenvoegen, en de heldere-veld afbeelding in de grijze kanaal dropdown menu en de verhouding afbeelding in het groene kanaal dropdown menu te selecteren, en selecteren van deHoud bronafbeeldingen check-box. Scan de time-lapse filmpjes of foto's om te bepalen welke phagosomes worden geanalyseerd. De helder-veld channel nuttig voor.
- Trekken regio's van belang (ROI) met de ovale polygoon selectietool rond fagosomen, en voeg ze toe aan de ROI manager door te klikken op Analyseren> Extra> ROI Manager> toevoegen. Meet hun zymosan intensiteitsverhouding door te klikken op Meer> Multi-Measure en de-selecteren van de één rij per slice check-box.
- Voor time-lapse filmpjes, spoor phagosomes een voor een door het tekenen van een ROI, het typen van Ctrl + M op elk tijdstip te meten, en het verplaatsen van de ROI wanneer dat nodig is om de intensiteit waarden in de tijd te volgen. Kopieer de metingen uit het raam resultaten in een spreadsheet-software.
Opmerking: Analyse van 15 (5 tijdsverloop per experiment x 3) onafhankelijke experimenten is ideaal, maar min of meer nodig zijn, afhankelijk van de waargenomen variabiliteit. Opslaan van de ROI wordt altijd aanbevolen. Sommige software pakketten kunt image registratie en dynamische updates van ROI, het vergemakkelijken van dit deel van de analyse.
- Conversie van fluorescentie pH-waarden
- Meet de 490/440 ratio voor phagosomes in de kalibratie time-lapse filmpjes zoals beschreven in paragraaf 4.1.
- In een spreadsheet, trek de ratiowaarden tijd, en bereken de gemiddelde verhouding van alle waarden phagosomes binnen het gezichtsveld (gewoonlijk 5-20) van 5 tijdstippen in het midden van de periode die overeenkomt met elke pH kalibratie oplossing. (Zie ook de rode vakjes in figuur 5A).
- Plot deze gemiddeld 490/440 verhouding waarden tegen de werkelijk gemeten pH. Combineer tenminste 3 onafhankelijke kalibraties in één grafiek. Gebruik statistische of numerieke software een lineaire regressie (best passende curve) uitvoeren, meestal een sigmoïdale vergelijking.
Opmerking: Bijvoorbeeld, in figuur 5B de gebruikte vergelijking is een Boltzmann sigmoïdale [Y = bodem + ((boven-beneden)/ (1 + EXP ((V50-X) / Helling))], waarbij Y waarden zijn de 490/440 ratio's, X zijn de pH-waarden en de Boven, Onder, zijn V50 en de helling parameters berekend door de software. - Met de verkregen vergelijking om verhoudingswaarden transformeren naar pH.
Opmerking: Bijvoorbeeld, in figuur 5B de vergelijking verkregen voor de ijkcurve in aanwezigheid van natriumazide is 490/440 Ratio = 1,103 + [(2,89-1,103) / (1 + EXP ((6,993 pH) /0.9291)] . Oplossen voor pH geeft de volgende vergelijking: pH = 6,993-,9291 * [LN ((1,178 / (Verhouding-1,103)) - 1))].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De volgende resultaten zijn representatief voor een experiment waarbij de phagosomal pH van primaire muis neutrofielen geïsoleerd uit het beenmerg van wildtype of Hvcn1 - / - muizen werden vergeleken. Voor een succesvolle experiment is het belangrijk om voldoende phagosomes binnen het gezichtsveld te verkrijgen gedurende de gehele duur van de time-lapse film, terwijl het vermijden teveel fagosomen, wat later moeilijker segment in de beeldanalyse wordt. Figuur 1 toont voorbeelden van goede en slechte confluencies. Voor tijdsafhankelijke en snapshot analyses moeten externe zymosan deeltjes worden onderscheiden van phagosomes en van de analyse uitgesloten. Figuur 2 illustreert hoe beeld helder-veld bruikbaar om onderscheid te maken externe zymosan deeltjes phagosomen kunnen worden. Figuur 3 toont voorbeelden van typische phagosome pH time-cursussen in wild-type vergeleken met Hvcn1 - / - Figuur 4 illustreert het effect van het toevoegen van het NADPH oxidase inhibitor DPI, waardoor een snelle verzuring, gevolgd door toevoeging van de V-ATPase inhibitor ConcA, het aanzuren omkeert. Dergelijke experimenten kunnen kritisch te bewijzen dat de pH-gevoelige probes werken bij phagosomes zoals het hoort. Een typische kalibratie tijdsverloop is weergegeven in figuur 5, met een grafische weergave van het bereik van de verhouding tussen de waarden wordt gebruikt om de kalibratiecurve. Figuur 5 bovendien laat zien hoe dye chloreren door de MPO-activiteit kan de intraphagosomal pH-reactie van FITC beïnvloeden, aandacht voor het feit dat sondes verschillend kan reageren dan verwacht binnen de phagoso mal milieu en het belang van in situ kalibratie.
Figuur 1. Geschikte confluentie en target: celverhouding Het linkerpaneel toont een voorbeeld waarbij cellen confluentie te schaars en het doel. Celverhouding te laag is, vermindert de kans dat een fagocytische gebeurtenis zal optreden in het gezichtsveld. Het middelste paneel toont een voorbeeld waarbij cel confluentie te hoog is en de cellen zijn overvol. Onder deze omstandigheden kunnen cellen niet genoeg ruimte te bewegen en vinden hun targets, of kunnen kruipen elkaar maken nog moeilijker later. De rechter paneel toont een ideale cel confluentie en aanvankelijke doelstelling: cel ratio, waar veel cellen en doelstellingen kan gezien en toch duidelijk worden onderscheiden van elke andere. FITC-zymosan wordt getoond in groen en de schaal bar vertegenwoordigt 10 micrometer. /ftp_upload/53402/53402fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Onderscheidende phagosomes en uningested zymosan een afbeelding samengevoegde helder-veld en een 490/440 FITC- zymosan ratio. Het linker paneel toont, terwijl het de heldere-veld het rechter paneel toont alleen. Phagosomes (kleine groene pijlen) kunnen worden onderscheiden van de externe deeltjes, die ofwel niet co-lokaliseren met cellen (korte rode pijl) of waarvan de fluorescentie niet overeenkomt met een donker centrum (lange rode pijl), omgeven door een lichtere ring, karakteristieke van phagosomes in de lichte-beeldveld (groene pijlen). De schaal bars vertegenwoordigt 10 um. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Tijd cursussen, de gemiddelde pH en de verhouding histogrammen van wild-type en Hvcn1 - / -. Neutrofielen phagosomes (A) Typische tijdsverloop van phagosomal pH laat zien dat, terwijl in het wild-type neutrofielen (blauw) de pH-neutraal (stippellijn ) of licht alkalisch (vaste lijn) tijdens de vroege tijdstippen na inname, de phagosomes van Hvcn1 - / - neutrofielen (rood) kan ofwel alkalinize (vaste lijn) of aanzuren (stippellijn). (B) samenstellen kiekjes 30-35 min na toevoeging van doelen kan de gemiddelde bevolking phagosomal pH wordt berekend uit een groot aantal phagosomes (wild-type: n = 5/1898/383 en Hvcn1 - / -: n = 6 / 1433/451 experimenten / fagosomen / cellen, bars zijn ± SEM, NS niet significant). (C) Histogrammen van FITC-zymosan verhoudingen onthullen verschillen in phagosomal pH tussen wild-type en Hvcn1 - / - neutrofielen. (Dit cijfer is gewijzigd van [19], met toestemming.) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Effect van NADPH oxidase inhibitor DPI V-ATPase inhibitor ConcA op phagosomal pH. Pre-incubatie in 10 uM DPI resulteerde in een snelle verzuring van phagosomes kort na inname, die werd omgekeerd door toevoeging van 100 nM ConcA (pijl). (Dit cijfer is gewijzigd van [19], met toestemming.) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. pH kalibratie tijdsverloop en de effecten van remming MPO op de kalibratie van FITC-zymosan. (A) Een typische pH ijkkromme van intraphagosomal FITC-zymosan. Rode dozen geven het bereik van de verhouding tussen de waarden wordt gebruikt om de kalibratiecurve. De werkelijke pH van de gebruikte oplossingen en de tijdstippen waarop de oplossing veranderd zijn aangegeven met pijlen. De curve geeft het gemiddelde van 10 phagosomes binnen één gezichtsveld. (B) Remming van MPO met de niet-specifieke remmer natriumazide (5 mM, MPO Inh) vergroot het dynamisch bereik van intraphagosomal FITC-zymosan pH-afhankelijke responsen. Punten zijn gemiddelden ± SEM (Dit cijfer is gewijzigd van [19], met toestemming.) Klik hier om te bekijken a larger versie van deze figuur.
| 1.1 | (2x) Base | |||||
| Buffers | Voorraad | Final (1x) | Voor 500 ml (2x) | |||
| KCl | 1 M | 140 mm | 140 ml | |||
| MgCl2 | 1 M | 1 mM | 1 ml | |||
| EGTA | 1 M | 0,2 mM | 0,2 ml | |||
| NaCl | 1 M | 20 mM | 20 ml | |||
| 1.2 | Buffers | Voorraad | Finale(1x) | Doel | ||
| MES | 1 M | 20 mM | pH 5,5-6,5 | |||
| HEPES | 1 M | 20 mM | pH 7,0-7,5 | |||
| Tris | 1 M | 20 mM | pH 5,5-6,7 | |||
| NMDG | 1 M | 20 mM | pH 5,5-6,8 | |||
| 1.3 | Ionoforen | Voorraad (100% EtOH) | Final (1x) | |||
| Nigericine | 5 mg / ml | 5 ug / ml | ||||
| Monensin | 50 mM | 5 uM | ||||
| 1.4 | 50 ml | |||||
| pH | 2x Base | Buffer Type | Buffer Vol. | Nigericine | Monensin | |
| 5.0 | 25 ml | MES | 1 ml | 50 gl | 5 gl | |
| 5.5 | 25 ml | MES | 1 ml | 50 gl | 5 gl | |
| 6.0 | 25 ml | MES | 1 ml | 50 gl | 5 gl | |
| 6.5 | MES | 1 ml | 50 gl | 5 gl | ||
| 7.0 | 25 ml | HEPES | 1 ml | 50 gl | 5 gl | |
| 7.5 | 25 ml | HEPES | 1 ml | 50 gl | 5 gl | |
| 8.0 | 25 ml | Tris | 1 ml | 50 gl | 5 gl | |
| 8.5 | 25 ml | Tris | 1 ml | 50 gl | 5 gl | |
| 9.0 | 25 ml | Tris | 1 ml | 50 gl | 5 gl | |
| 9.5 | 25 ml | NMDG | 1 ml | 50 gl | 5 gl | |
| Stel de pH metKOH of HCl | ||||||
Tabel 1. Recept voor het bereiden van ijkoplossingen. 1,1) Recept voor het bereiden 500 ml 2x basisoplossing. 1,2) Recept voor het bereiden van de verschillende buffers toegepast volgens de pH van de ijkoplossing. 1,3) Recept voor het bereiden van de ionoforen gebruikt in de ijkoplossingen. 1,4) Recept voor het bereiden 50 ml van elke ijkoplossing met behulp van de basis, buffers en ionoforen in 1,1-1,3 beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel er meer tijd dan andere methoden, zoals spectroscopie en FACS, dat een soortgelijke strategie voor het gebruik van een pH-gevoelige kleurstof gekoppelde doelwitten in dienst maar meet de gemiddelde pH van een populatie phagosomes, microscopie biedt verschillende voordelen. Eerste is dat de interne en externe gebonden, maar niet geïnternaliseerd, kunnen deeltjes gemakkelijk te onderscheiden zijn, zonder dat aan andere chemicaliën, zoals trypaanblauw of antilichamen toe te voegen, respectievelijk blussen of het etiket externe deeltjes. Tweede is dat naar aanleiding van de cellen in real time stelt onderzoekers in staat om meerdere aspecten van de fagocytische proces gelijktijdige en dus gevolgen voor de migratie, sensing en bindende deeltjes kunnen hier worden onderscheiden, terwijl het zou kunnen worden over het hoofd gezien met een bevolking gebaseerde methoden observeren. Bovendien, de synchronisatie van de opening van fagocytose, vaak uitgevoerd door het plaatsen van cellen bij 4 ° C, die kunnen verstoren andere mensenhandel gebeurtenissen als gevolg van koude shock 40,41, geent nodig omdat de tijd nul kan direct worden onderscheiden. Immers, bij het uitvoeren van levend microscopie, dit 4 ° C synchronisatietechniek wordt niet aanbevolen als vastleggen tijdsperioden nabij de opening van fagocytose de condens die zich vormt op de bodem van de schaal tijdens de temperatuurverandering kan mengen met het doel immersieolie en temperatuurverschillen tussen de opwarming gerecht en microscoop componenten kunnen focus verschuift veroorzaken. Een derde voordeel vloeit voort uit het feit dat phagosomes intrinsiek heterogeen verschillende parameters waaronder, maar niet beperkt tot, pH 42, en bepaalde effecten op phagosome pH wellicht subtieler, verandert de verdeling van de phagosomal pH dan de gemiddelde bevolking, is weergegeven in figuur 3. Deze opmerkingen kunnen dieper mechanistische inzichten in de regulatie van phagosomal pH geven.
In de onderhavige studie werd FITC gekozen als de pH-gevoelige kleurstof gekozen omdat hetgoedkoop, overal verkrijgbaar, en belangrijker nog een pKa van 6,5 met een dynamisch bereik omvat pH 3 tot 9 in zijn vrije vorm 37, waarbij de aanvankelijk verwachte pH-traject van neutraal tot licht alkalisch afgestemd Volgens eerdere studies 29,30. Meer recent een studie waarbij een andere pH-sonde genaamd SNARF, dat een meer fundamentele pKa van 7,5, onverwacht geschat pH-waarden, variërend 1-2 pH-eenheden meer basisch voor zowel wild-type en Hvcn1 heeft - / - neutrofielen phagosomes 39. Zo is de keuze van de pH-sensor is een belangrijke parameter om te overwegen afhankelijk van de toepassing. In principe kan de hier voorgestelde methode gemakkelijk worden aangepast aan andere pH-gevoelige kleurstoffen, zoals SNARF en 2 ', 7'-bis- dienst (2-carboxyethyl) -5- (en-6) -carboxyfluorescein (BCECF), waarvan succinimidyl-esterderivaten gemakkelijk gekoppeld aan amine-bevattende deeltjes, zoals zymosan. Inderdaad hoeven sensoren niet beperkt tot fluorescerende kleurstoffen, zoals ratiometric pH gevoelige eiwitten, dergelijke Sypher 43, kan worden getransduceerd en door micro-organismen tot expressie gebracht. Verschillende niet-ratiometrische alternatieven bestaan ook, zoals de rode versie van de kleurstof pHrodo, die kunnen worden gebruikt in samenhang met groen fluorescerend eiwit (GFP) gemerkte eiwitten of pH-gevoelige eiwit pHluorin. Vanwege het potentieel grote effecten van de harde intraphagosomal milieu kunnen hebben voor kleurstoffen en eiwitten daarin gericht moeten deze probes worden gecombineerd met ten minste pH ongevoelig probes worden gebruikt bij het afleiden van een pseudo-verhouding. Zoals geïllustreerd in figuur 5, kan kalibraties experimenten de effecten kleurstof schade verminderde of vervormd dynamisch bereik bloot. Op een praktische opmerking, kalibratie experimenten zijn niet altijd perfect en kan niet haalbaar om te presteren na elk experiment. Bijgevolg kan verhoudingswaarden incidenteel buiten het bereik van de kalibratie vallen en onmogelijke waarden geven bij conversie pH. Het kan KREDIETENIATE ofwel uiten deze off-scale waarden als "meer / minder dan of gelijk aan" maximale en minimale kalibratie pH-waarden, of alle waarden als verhoudingen en de raming pH uiten varieert dat de gemiddelde ratio's vertegenwoordigen.
Zoals benadrukt door DPI en ConcA controleert, ROS productie en V-ATPase activiteit zijn belangrijke factoren die phagosomal pH te bepalen. Sterker nog, in veel situaties, veranderingen in de niveaus van ROS productie kan verschillen in phagosomal pH ten grondslag liggen, met name in neutrofielen, en meting van phagosomal ROS productie en pH gaan vaak hand in hand. Een waarschuwing is dat beide geneesmiddelen geven inzicht in de activiteit van de enzymen remmen zij maar niet hun locatie binnen de cel. Beide enzymen zijn multi-subunit complexen waarvan de afzonderlijke componenten moeten verkeer naar fagosomen 4, en hun gebrek aan activiteit op phagosomes gevolg kunnen zijn van mensenhandel of montage fouten in plaats van directe effecten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zymosan A powder | Sigma-Aldrich | Z4250 | Various providers exist |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F7250 | Various providers exist |
| Anti-zymosan antibody (Zymosan A Bioparticles opsonizing reagent) | Life Technologies | Z2850 | Sigma-Aldrich O6637 is an equivalent product. Alternatively 25% serum can be used as an opsonizing reagent. |
| 4-Aminobenzoic hydrazide (4-ABH) | Santa Cruz | sc-204107 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Diphenyleneiodonium chloride (DPI) | Sigma-Aldrich | D2926 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Concanamycin A (ConcA) | Sigma-Aldrich | 27689 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Monensin | Enzo | ALX-380-026-G001 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14200-075 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Hank's balance salt solution | Life Technologies | 14025092 | Ringer's balanced salt solution or other clear physiological buffers may be substituted. |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S7795 | Various providers exist |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | Various providers exist |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | Various providers exist |
| N-Methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | Various providers exist |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | 3777 | Various providers exist |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | T1503 | Various providers exist |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | Various providers exist |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Various providers exist |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | Various providers exist |
| Absolute Ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 2860 | Various providers exist |
| Glass-bottom 35 mm petri dishes (Fluorodish) | World Precision Instruments | FD35-100 | Ibidi µ-clear dishes or coverslips with appropriate imaging chambers may be sustituted |
| Sonicating water bath | O. Kleiner AG | A sonicator may be used instead, various instrument providers exist | |
| Heamocytometer | Marienfeld GmbH | Various instrument providers exist | |
| Widefield live imaging microscope | Carl Zeiss AG | Various instrument providers exist, but the microscope must be able to image 440/535 and 490/535 excitation/emission respective. Spinning disk confocal set-ups with brightfield capabilities may substituted, but zymosan tend to go out of focus more often. | |
| Peristaltic pump (Dynamax RP-1) | Rainin | Various instrument providers exist | |
| pH meter | Schott Gerate GmbH | Various instrument providers exist | |
| Manual Counter | Milian SA | Various instrument providers exist |
References
- Yeung, T., Grinstein, S. Lipid signaling and the modulation of surface charge during phagocytosis. Immunol Rev. 219, 17-36 (2007).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
- Fairn, G. D., Grinstein, S. How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes. Trends Immunol. 33 (8), 397-405 (2012).
- Nunes, P., Demaurex, N., Dinauer, M. C. Regulation of the NADPH oxidase and associated ion fluxes during phagocytosis. Traffic. 14 (11), 1118-1131 (2013).
- Binder, B., Holzhutter, H. G. A hypothetical model of cargo-selective rab recruitment during organelle maturation. Cell Biochem Biophys. 63 (1), 59-71 (2012).
- Hurtado-Lorenzo, A., et al. V-ATPase interacts with ARNO and Arf6 in early endosomes and regulates the protein degradative pathway. Nat Cell Biol. 8 (2), 124-136 (2006).
- Weisz, O. A.
- Huynh, K. K., Grinstein, S. Regulation of vacuolar pH and its modulation by some microbial species. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (3), 452-462 (2007).
- De Vito, P. The sodium/hydrogen exchanger: a possible mediator of immunity. Cell Immunol. 240 (2), 69-85 (2006).
- Moreland, J. G., Davis, A. P., Bailey, G., Nauseef, W. M., Lamb, F. S. Anion channels, including ClC-3, are required for normal neutrophil oxidative function, phagocytosis, and transendothelial migration. J Biol Chem. 281 (18), 12277-12288 (2006).
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome. Antioxid Redox Signal. 18 (6), 642-660 (2013).
- Seredenina, T., Demaurex, N., Krause, K. H. Voltage-Gated Proton Channels as Novel Drug Targets: From NADPH Oxidase Regulation to Sperm Biology. Antioxid Redox Signal. , (2014).
- Kotsias, F., Hoffmann, E., Amigorena, S., Savina, A. Reactive oxygen species production in the phagosome: impact on antigen presentation in dendritic cells. Antioxid Redox Signal. 18 (6), 714-729 (2013).
- Grimm, M. J., et al. Monocyte- and macrophage-targeted NADPH oxidase mediates antifungal host defense and regulation of acute inflammation in mice. J Immunol. 190 (8), 4175-4184 (2013).
- West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
- Bloomfield, G., Pears, C. Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium. J Cell Sci.. 116 (Pt 16), 3387-3397 (2003).
- Ramsey, I. S., Moran, M. M., Chong, J. A., Clapham, D. E. A voltage-gated proton-selective channel lacking the pore domain. Nature. 440 (7088), 1213-1216 (2006).
- El Chemaly, A., Demaurex, N. Do Hv1 proton channels regulate the ionic and redox homeostasis of phagosomes? Mol Cell Endocrinol. 353 (1-2), 82-87 (2012).
- El Chemaly, A., Nunes, P., Jimaja, W., Castelbou, C., Demaurex, N. Hv1 proton channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophage phagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit the delivery of vacuolar ATPases. J Leukoc Biol. , (2014).
- Decoursey, T. E.
- Ramsey, I. S., Ruchti, E., Kaczmarek, J. S., Clapham, D. E. Hv1 proton channels are required for high-level NADPH oxidase-dependent superoxide production during the phagocyte respiratory burst. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (18), 7642-7647 (2009).
- Sturgill-Koszycki, S., et al. Lack of acidification in Mycobacterium phagosomes produced by exclusion of the vesicular proton-ATPase. Science. 263 (5147), 678-681 (1994).
- Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Virulent and avirulent strains of Francisella tularensis prevent acidification and maturation of their phagosomes and escape into the cytoplasm in human macrophages. Infect Immun. 72 (6), 3204-3217 (2004).
- Alpuche-Aranda, C. M., Swanson, J. A., Loomis, W. P., Miller, S. I. Salmonella typhimurium activates virulence gene transcription within acidified macrophage phagosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (21), 10079-10083 (1992).
- Lukacs, G. L., Rotstein, O. D., Grinstein, S. Determinants of the phagosomal pH in macrophages. In situ assessment of vacuolar H(+)-ATPase activity, counterion conductance, and H+ 'leak'. J Biol Chem. 266 (36), 24540-24548 (1991).
- Watanabe, K., Kagaya, K., Yamada, T., Fukazawa, Y. Mechanism for candidacidal activity in macrophages activated by recombinant gamma interferon. Infect Immun. 59 (2), 521-528 (1991).
- Ip, W. K., et al. Phagocytosis and phagosome acidification are required for pathogen processing and MyD88-dependent responses to Staphylococcus aureus. J Immunol. 184 (12), 7071-7081 (2010).
- Clarke, M., Maddera, L. Phagocyte meets prey: uptake, internalization, and killing of bacteria by Dictyostelium amoebae. Eur J Cell Biol. 85 (9-10), 1001-1010 (2006).
- Jankowski, A., Scott, C. C., Grinstein, S.
- Segal, A. W., Geisow, M., Garcia, R., Harper, A., Miller, R. The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH. Nature. 290 (5805), 406-409 (1981).
- Savina, A., et al. NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells. Cell. 126 (1), 205-218 (2006).
- Rybicka, J. M., Balce, D. R., Chaudhuri, S., Allan, E. R., Yates, R. M. Phagosomal proteolysis in dendritic cells is modulated by NADPH oxidase in a pH-independent manner. EMBO J. 31 (4), 932-944 (2012).
- Mantegazza, A. R., et al. NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells. Blood. 112 (12), 4712-4722 (2008).
- Balce, D. R., Allan, E. R., McKenna, N., Yates, R. M. gamma-Interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT) maintains phagosomal proteolysis in alternatively activated macrophages. J Biol Chem. 289 (46), 31891-31904 (2014).
- Sanjurjo, L., et al. The scavenger protein apoptosis inhibitor of macrophages (AIM) potentiates the antimicrobial response against Mycobacterium tuberculosis by enhancing autophagy. PLoS One. 8 (11), e79670 (2013).
- Yuan, Z., Zhi, L., Li-Juan, Z., Hong-Tao, X. The Utility of Chloroquine in Cancer Therapy. Curr Med Res Opin. , 1-12 (2015).
- Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).
- El Chemaly, A., et al. VSOP/Hv1 proton channels sustain calcium entry, neutrophil migration, and superoxide production by limiting cell depolarization and acidification. J Exp Med. 207 (1), 129-139 (2010).
- Levine, A. P., Duchen, M. R., Segal, A. W. The HVCN1 channel conducts protons into the phagocytic vacuole of neutrophils to produce a physiologically alkaline pH. bioRxiv. , (2014).
- Al-Fageeh, M. B., Smales, C. M. Control and regulation of the cellular responses to cold shock: the responses in yeast and mammalian systems. Biochem J. 397 (2), 247-259 (2006).
- Yui, N., et al. Basolateral targeting and microtubule-dependent transcytosis of the aquaporin-2 water channel. Am J Physiol Cell Physiol. 304 (1), C38-C48 (2013).
- Griffiths, G. On phagosome individuality and membrane signalling networks. Trends Cell Biol. 14 (7), 343-351 (2004).
- Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).
