A Novel Microsurgical Model for Heterotop, En Bloc brystvæggen, Thymus, og hjertetransplantation i mus

Protocol

Alle operative procedurer blev afsluttet i overensstemmelse med Johns Hopkins University og USA Department of Agriculture og Public Health Service krav. Denne protokol følger Johns Hopkins University Animal Care og brug Udvalg, Institutional Review Board godkendte retningslinjer (protokol nummer M013M490). Afsluttende overlevelse data blev registreret for de kirurgiske procedurer, der er beskrevet nedenfor. Både donor- og modtagerlande dyr modtager forebyggende anæstesi ved hjælp af buprenorphin på 0,1 mg / kg sc en time før kirurgi og i modtagerens dyr buprenorphin er re-administreres på samme dosis efter transplantation og re-doseret efter behov i de første 48 timer efter operationen.

1. Donor Allograft Recovery

Bemærk: Begynd donor del af transplantatet 40 min tidligere end modtageren transplantationen for at minimere modtagerens anæstesi tid og for at lette en samtidig sluttidspunktet eller lidt ørelier sluttidspunkt versus modtageren præparat.

1. Brug standard sterile mikrokirurgiske instrumenter og sterile handsker til proceduren. Vores laboratorieformål autoklave sterilisering af mikrokirurgiske instrumenter.
2. Bedøver donor mus (han) ved hjælp af isofluran induktion fordamper ved 4%. Brug af atraumatiske mekaniske klippere fjerne hår fra livmoderhalsen, thorax og maveregionen. Placer dyret i liggende stilling og fastholde isofluran på 1-2% gennem en næse kegle. Sørg for tilstrækkelig anæstesi under hele proceduren ved jævnligt at evaluere tå knivspids tilbagetrækning refleks.
3. Forud for incision i huden, i vid udstrækning forberede operative ved at anvende povidon-iod antiseptisk efterfulgt af isopropylalkohol anvendelse af en steril vatpind.
4. Begynd med en overfladisk tværgående incision i huden med en saks på tværs af livmoderhalskræft og abdominale hud. Tilslut begge indsnit bilateralt langs de midtaksilære linjer.
5. Brug microsurgical pincetdissekere den cervikale region bilateralt at identificere, ligering og opdele de eksterne halsvener med 6-0 silke sutur og saks. Så hjælp elektrokauterisation opdele sternocleidomastoideus muskler til at afsløre de interne halsvener og fælles halspulsårer, bilateralt. Passere en 6-0 silke sutur under venstre-sidet og højresidig carotis og interne halsvener i bulk mode.
   BEMÆRK: De vil blive bundet og deles senere i trin 1.9.
6. Skarpt opdele strop muskler og tilhørende løs areolar væv, som ligger forreste til luftrøret, med en saks for at frigøre de resterende vedhæftede filer i den cervikale region.
7. Ved hjælp af bipolar elektrokauterisation og skarp dissektion, opdele pectoralis store muskler og kraveben at eksponere subclavia skibe og liger (6-0 silke sutur) og dele proximalt.
8. Næste, blidt, gribe og trække dyrets penis. Langs dorsum penis visualisere den dorsale vene på penis og desinficereregion med isopropylalkohol. Anvendelse af en 30 G nål, injicere 30.000 enheder heparin intravenøst ​​via den dorsale vene og tillade penis til rekyl tilbage til sin oprindelige position. Delvis lækage af heparinopløsningen i det omkringliggende væv kan forekomme.
9. Brug af tidligere placeret bulk-bånd omkring fælles halspulsåren og intern halsvene, ligere og dele de strukturer, bilateralt.
10. Næste brug saks til at lave en tværgående intrabdominal snit. Eviscerate tarmene at blotlægge infrahepatic inferior vena cava og injicere 2 ml kold Euro-Collins kardioplegi opløsningen i infrahepatic inferior vena cava. Sikre korrekt injektion ved at visualisere lever misfarvning og ophør af hjerteslag før videre til næste trin.
    BEMÆRK: Euro-Collins opløsning fremstilles i vores laboratorium, se tabel af specifikke reagenser og instrumenter.
11. Brug af saks adgang til intrathorakale hulrum via en bilateral diaphragmatic snit fra den udsatte maven. Forlæng snittet kranialt gennem interkostalrummene muskler og ribben. Reflect brystvæggen udsætte hjerte, thymus, og store skibe samtidig sikrer bevarelsen af ​​de interne thorax fartøjer langs brystvæggen.
12. Injicere suprahepatic vena cava inferior med 4 ml kold Euro-Collins kardioplegi løsning.
13. Identificere roden af ​​aorta og spore distalt til aorta descendens. Skarpt skære den nedadgående aorta (bevare maksimal længde).
14. Identificer det pulmonale stammen og deler lige proksimalt for sin filial punkt (bevare maksimal længde). Derefter bruge 2 ml kold Euro-Collins kardioplegi løsning, skylle pulmonal stammen og hjerte ved at placere en blød plast tip kateter ind i hulrummet af pulmonal stammen.
15. Ved hjælp af en 6-0 silkesutur, ligeres og opdele vena cava inferior, sammenløbet af lungevener og tilbehør grene af den bilaterale vena cava superior. Så ophøjeog dissekere hjerte kranialt fra de vedhæftede filer langs hovedstammen bronkier og luftrør med omhu for ikke at komme ind i luftvejene. Brug af skarpe og bipolar elektrokauterisation dissekere brystvæggen, thymus og hjerte helt befriende fra donor mus.
16. Endelig trimme allotransplantatet brystvæggen ex vivo til en mindre størrelse, ved hjælp af en saks langs brystbenet og laterale costae, med omhu for ikke at forstyrre de interne thorax skibe (figur 1A). For at minimere blødning efter revaskularisering, brug bipolar electrocauterization langs grænser osteomusculocutaneous brystbenet.
17. Placer allograft i 10 ml kold (4 ^o Celcius) Euro-Collins løsning, hvis modtageren ikke er forberedt til nedfældning. Men hvis modtageren er klar til nedfældning, overføre allotransplantat lige til modtageren operative område.

2. Modtager Forberedelse

Bemærk: For at minimere modtager anæstesi tid,begynder modtageren forberedelse på et separat operativ station cirka 40 minutter før afslutningen af ​​donor allograft høst.

1. Brug en separat sæt af standard sterile mikrokirurgiske instrumenter og sterile handsker til proceduren.
2. Bedøver modtageren mus (mand eller kvinde) ved hjælp af isofluran induktion fordamper ved 4%. Brug atraumatiske mekaniske klippere fjerne hår fra højre livmoderhalskræft og thorax region.
3. Placer musen i liggende stilling og vinkel højre overekstremitet lidt nedadtil danner en 110 graders vinkel mellem hovedet og højre overekstremitet. Opretholde anæstesi på 1-2% isofluran gennem en næsekegle.
4. Placer råolie oftalmologiske salve på musen øjne ved hjælp af en vatpind. Forud for incision i huden, i vid udstrækning forberede operationsstedet ved hjælp af povidon-iod antiseptisk efterfulgt af isopropylalkohol.
5. Med en saks, lave en incision i huden fra midterlinjen langs højre ringere border af underkæben og udvide snittet infero-lateralt til højre thorakale region. Brug stump dissektion med mikrovaskulære pincet, mobilisere den eksterne halsvene ved omkredsen fri skibet fra blødt væv og adventitia. Opdel alle brancher der bruger elektrokauterisation, og fjern højre lap af submandibulære kirtel hjælp skarp dissektion og elektrokauterisation til gratis plads til allotransplantatet.
6. Sikre tilstrækkelig længde af den ydre halsvene for at krænge over en manchet, og liger den eksterne halsvene ved anvendelse af en 6-0 silkesutur. Sæt venen gennem hulrummet i en forskåret polyimid manchet og bruge en bulldog mikrovaskulær klemme til at fastgøre skibet-manchetten komplekset på plads. Derefter bruge en saks, proximalt opdele den eksterne halsvene, Evert over manchetten, og fastgør med en 10-0 nylon sutur. (Figur 1B)
7. Opdele den rigtige sternocleidomastoideus med bipolar elektrokauterisation at eksponere den fælles halspulsåre. Omkredsen mobilize arterien kraniale til den mest distale punkt inden den cervikale region. Dette opnås ved stump dissektion af beholderen med pincet for at fjerne blødt væv og omgivende adventitia.
8. Anvendelse af 6-0 silkesutur, ligeres og dividere den fælles halspulsåre. Passerer arterien gennem hulrummet i en forskåret polyimid manchet og løse det på plads med en bulldog mikrovaskulær klemme så tæt på thorax indløb som muligt. Opdel skibet distalt, forsigtigt spile skibet ved hjælp af en microsurgical dilatator, Evert over manchetten, og fastgør med en 10-0 nylon sutur. (Figur 1B)
   BEMÆRK: Den specifikke microsurgical dilatator er beskrevet i tabellen over specifikke reagenser og instrumenter.

3. Allograft Indsatser

1. Opretholde standard sterile instrumenter og sterile handsker at placere allograft inden modtageren cervikale region i en på hovedet og skrå position.
2. Næste placere donor faldende AORtic lumen over arterielle manchet konstruktion af modtageren og ordne det på plads med en 10-0 nylon sutur (figur 1C og 1D).
3. Mode samme anastomose som i trin 3.2 mellem donor lungepulsåren og udkrængede eksterne halsvene-manchet konstruktion Modtagerens mus (figur 1C og 1D).
4. Fjern først venøs mikrovaskulære klemme (ekstern halsvene klemme) og slip den arterielle klemme (fælles halspulsåren klemme). Under arteriel reperfusion, inspicere hele den allotransplantatet at imødegå enhver blødning. Hvis blødning visualiseres, genanvende den arterielle klemme for at minimere blodtab og afbøde kilden til blødning bruge bipolar elektrokauterisation.
5. Undersøg implantatet og sikre hæmostase. Slip og helt fjerne den arterielle mikrovaskulære klemme. Overhold hjertet at vise tegn på reperfusion, som vil være øjeblikkeligt synlige med hurtig volumen udvidelse af hjertekamrene, og vente på bspise for at begynde inden for 0,5-1 min. Brug varmt saltvand (35 ° C) for at fugte hjertet.
6. Drapere brystvæggen i en anatomisk position for ikke at fremkalde nogen kinkning eller spændinger på anastomose. Luk huden på operationssåret bruger 6-0 kontinuerlige nylonsuturer (figur 1E).

4. Postoperativ pleje

1. Administrere en 0,3 ml normal intraperitoneal fluid bolus saltvand umiddelbart postoperativt for væskeerstatning.
2. Så subkutant injicere buprenorphin (0,1 mg / kg) og enrofloxacin (5 mg / kg) til smerte og infektion forebyggelse hhv.
3. Placer dyret under en varmelampe indtil vågne fra anæstesi og vende tilbage til brystleje. Under opsving, inspicere halsen at visualisere fibrillerende hjertebanken af ​​allotransplantatet sikre tilstrækkelig allograft perfusion.
4. Når vågen og i liggende stilling, tilbage musen til en separat bur (uden selskab med andre mus), Hvor det kan modtage mad og vand ad libitum. På grund af enhver midlertidig mindre restriktive bevægelse af højre øvre lemmer, efterlade en gelatine fødekilde på gulvet i buret.
5. Overhold modtageren musen i 1 time postoperativt og derefter returnere det til buret facilitet, hvor det kan modtage mad og vand ad libitum og inspiceres tre gange om dagen i de første 24 timer for aktivitet og ernæringsmæssige indtagelse. Overvåg mus for tegn på smerte og angst og re-dosis med buprenorphin (0,1 mg / kg) subkutant to gange dagligt efter behov for den første 72 timer. Undersøge dyrene dagligt derefter og vejes hver uge.
6. Rådfør dig med en veterinær medlem personalet, hvis nogen mus viser tegn på smerte, angst eller nedsat foderoptagelse. Overvej tidlig eutanasi (i vores protokol for eutanasi teknik anvender CO ₂ overdosis i 7 min, efterfulgt af cervikal dislokation).
7. Ophør af allograft hjerteslag er defineret som en given virkning beder musen til at være sacrificed.

Representative Results

Syngene C57BL / 6 transplantationer opnået langsigtet overlevelse. Udformningen af allograft (figur 1) viste sig at være en succes fra et dyr overlevelse perspektiv og evnen til at vurdere løbende allotransplantatoverlevelse. Dette blev demonstreret gennem overliggende hud forbliver levedygtige, aktive løbende allograft hårvækst, og hjerteslag kunne evalueres med visualisering og finger palpering. Survival data er repræsenteret i figur 2 for syngene transplanterede mus. Den gennemsnitlige overlevelsestid var større end 109 dage. Baseret på overlevelsesdata, er det rimeligt at udlede, at de tekniske aspekter af den transplanterede allograft er designet til at perfundere helhed af brystvæggen, thymus og hjerte. Endvidere evne til syngene dyr at overleve på lang sigt yderligere understøtter, at denne musemodel er ikke kun muligt, men kan replikeres. Dette proof-of-concept en bloc brystvæggen, thymus, og hjertetransplantation validerer the musemodel til at studere kombineret fast orgel og vaskulariseret komposit allotransplantation.

Figur 1. Intraoperative fotos. (A) brystvæggen, thymus og hjerte allotransplantat med succes genvundet, trimmet og visualiseret ex vivo fra den bageste del. De bilaterale interne thorax fartøjer bevares. (B) Modtageren eksterne halsvene (pil) og fælles halspulsåren (pilespids) er krænget fast i løbet af polyimid manchetter som forberedelse til vaskulær anastomose. (C) allograft vaskulære anastomoser er afsluttet. Pilen viser anastomose mellem donoren lungepulsåren og modtagerens eksterne halsvene. Pilespidsen viser anastomose mellem donoren nedadgående aorta og modtagerens fælles carotidarterie. Stjernen identificerer thymus og det reflekterede brystvæggen visualiseres overlfører thymus. (d) En større forstørrelse viser mikrovaskulære anastomoser-manchet. (e) Komplet allograft indsat. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. En bloc brystvæggen, thymus og hjerte allograftoverlevelse Kaplan-Meier-overlevelseskurverne for en bloc brystvæggen, thymus og hjerte allotransplant i syngene C57BL / 6-mus (n = 3;. Gennemsnitlig overlevelsestid var større end 109 dage). Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Der er et væld af fænomener, som faktor i den immunologiske undersøgelse af allotransplantation, der omfatter, men er ikke begrænset til mekanismer for akut og kronisk afstødning, direkte og indirekte antigenpræsentation, modtager sensibilisering eller induktionen af blandet kimærisme. ¹⁹ Dyremodeller er blevet guldstandarden for studiet af transplantation immunologi, og musemodeller er populært gennemføres på grund af deres lave omkostninger, tilgængelighed af transgene og gen-knockout-mus, kommercielt tilgængelige monoklonale antistoffer, relativ nedsat veterinære og boliger behov, og den lethed af replikation. Hidtil har flere hjertetransplanterede modeller er designet til at studere organtransplantation. ^19,22-27 Ligeledes en overflod af musemodeller er blevet udviklet til at studere vaskulariseret sammensatte allotransplantation. ²⁸ Men undersøgelsen af kombineret solide organer og vaskulariseret sammensatte allotransplantation er begrænset,og teknikker har endnu ikke etableret i mus. Den en bloc brystvæggen, thymus, og hjerte transplantation musemodel præsenteres her er en pålidelig og replicerbar værktøj til at studere virkningerne og immunologiske mekanismer kombineret faste organer og vaskulariseret komposit allotransplantation.

For yderligere at fremme inden for transplantation, skal løftet om at forlænge allotransplantatoverlevelse og minimering af immunosuppression gennem nye behandlingsmodaliteter videreføres. En sådan fremgangsmåde er gennem induktion af blandet kimærisme (delvis indpodning af donor hæmatopoietiske celler i modtageren), hvilket kan føre til immunosuppression-fri donorspecifik tolerance, selv om det i nogle tilfælde kimærisme ikke opretholdes. ^29,30 knoglemarvstransfusion / transplantation parret med faste organer ^{31 eller} vaskulariseret komposit allotransplanation ^32,33 kræver omfattende konditionering udgør en betydelig udfordring. Vaskulariseret knoglemarv, ener en del af en vaskulariseret komposit allograft konstruktion, kan omgå dette problem. Vaskulariseret knoglemarvstransplantation muliggør uafbrudt overførsel af donor knoglemarvsceller inden for konserverede donor mikromiljø, og anses for at være overlegen i forhold til cellulære knoglemarvstransplantation alene ved induktion af tolerance og reduktion af immunosuppression krav. ^34-36 endvidere inkorporeringen af thymus væv med vaskulariseret knoglemarvstransplantation har vist sig at øge T-celle kimærisme donor oprindelse i sidste ende spille en støttende rolle i induktion og vedligeholdelse af kimærisme. ^2,9 Ovennævnte strategier forlænge allotransplantatoverlevelse og minimere immunsuppression blev fundamentet at konceptualisere en kombineret fast organ, thymus og vaskulariseret sammensatte allograft musemodel.

Den heterotopisk en bloc brystvæggen, thymus, og hjertetransplantation er en sammenlægning af multipel hansriske dyremodeller. Heterotopisk cervikal hjertetransplantation bruger en ikke-sutur cuff i mus er blevet godt etableret og betragtes som mindre teknisk krævende end en heterotopisk abdominal mikrovaskulær hjerte transplantation. ¹⁹ Faktisk har manchetten teknik blevet implementeret i flere andre dyr transplantation modeller. ^37-44 heterotop brystbenet transplantation i rotter blev indført i 1999 af Santiago et al. som en alternativ metode til at studere vaskulariseret knoglemarvstransplantation. ¹ De var i stand til at vise langsigtet perifer kimærisme, tolerance, og overlevelse efter ophør af immunosuppression på postoperative dag 30. ¹ Bozkurt et al. efterfølgende udviklet en rotte model i 2013 at indarbejde brissel og det fulde omfang af den osteomyocutaneous del af brystvæggen. Det skal dog bemærkes, at denne model adskiller sig fra vores model i flere aspekter. Dette omfatter: (1) deres model er blottet for enhver fastorganer, (2) er afsluttet i rotter ved hjælp af traditionelle mikrokirurgiske teknikker, (3) ligering af de interne thorax fartøjer under donor høst, (4) gennemførelse af en ensidig, enkelt stilken via en fælles halspulsåre og ekstern halsvene, og (5 ) transplantation af allograften i ingvinal region. ² Ikke desto mindre deres model var i stand til at påvise, at thymus af donor-oprindelse spiller en væsentlig rolle, ikke kun for kimærisme forstærkning, men også for kimærisme vedligeholdelse i forhold til vaskulariseret knoglemarvstransplantation alene. ² Efterfølgende svin modeller af co-transplantation af thymus og hjerte har vist en overlegen virkning på hjertet allograftoverlevelse. ^10,11 fordelene ved hver af de dyremodeller, men manglen på mekanistisk in vivo-undersøgelser vedrørende kombineret fast organ, thymus og vaskulariseret komposit allotransplantation bedt vores gruppe til at designe denne model.

Oplevelsen executing denne roman model udstillet visse lektioner kræver vores team til at anlægge ændringer for at opnå en bedre dyr overlevelse. Denne model blev forsøgt med én operatør, som i sidste ende forlænget den operative og anæstesi tid til over 3-4 timer, og også langvarig koldt iskæmi tid. Dyr ikke ville vågne efter ophør af proceduren. Implementering af en to-team tilgang skære den samlede operative og anæstesi tid til 90 min. Dette afspejles i 60 min anæstesi tidspunktet for modtageren mus og 0-10 min allograft koldt iskæmi tid. Under allograft reperfusion, musen er modtagelige for blødning, hvilket kan begrænse dens overlevelsesevne i umiddelbar perioperativ. Vi går ind for omhyggelig inspektion af allograft ex vivo til potentielle kilder til blødning, samt blide frigivelse af bulldog mikrovaskulære klemme under allograft reperfusion. Ved at placere allograft i en reflekteret stilling er det lettere at identificere specifikke steder afblødende. Desuden er denne graft indsat position fremmer den mest ergonomiske lay af fartøjer minimerer risikoen for fartøjets knæk. Endelig med de første 48 timers for inddrivelse, modtagerens musens højre øvre ekstremitet vifte af bevægelse kan hindres med hensyn til at klatre buret for at få mad og vand. Derfor anbefaler vi placering af gelatine ernæringsmæssige kilder langs buret for at lette ernæringsmæssige indtagelse. Typisk ved postoperative dag 3, er fuld vifte af bevægelse returneres inden den højre øvre ekstremitet.

Selv om der er begrænsninger for denne model, som omfatter behovet for teknisk dygtighed i mikrokirurgi, tilgængeligheden af ​​to samtidige mikroskoper, og kravet om en to-team tilgang, har det alligevel vist sig at være en succesfuld tilgang til at udføre mekaniske immunologiske undersøgelser i forbindelse med kombineret faste organer og vaskulariseret sammensatte allotransplantation. Dens bredere anvendelse kan bidrage yderligere til at udvikle nye Immunosuppressive protokoller, der studerer mekanik akut og kronisk afstødning, og implementering af mulige strategier til at inducere og opretholde kimærisme og forlænge allotransplantatoverlevelse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Euro-Collins Solution			The solution is not commercially purchased but rather prepared in the laboratory. To make a 500 ml solution add the ingredient listed below to a 330 ml of double distilled water. Mix well, and then fill in the rest of the 170 ml of double distilled water into the solution to a final volume of 500 ml. Ingredients: 1.02 g KH2PO4, 3.66 g K2HPO4, 0.56 g KCl, 0.42 g NaHCO3, and 17.52 g of glucose.
Suture	Ethilon	MWI 72667	6-0 Ethilon https://www.mwivet.com (MWI - Veterinary Supplies)
Polyimide Cuff Vein (21G)	Vention Medical	141-0043	http://www.ventionmedical.com/products-and-services/polyimide-tubing/
Polyimide Cuff Artery (24G)	Vention Medical	141-0027	http://www.ventionmedical.com/products-and-services/polyimide-tubing/
Soft plastic tip catheter	Terumo	SR*OX2419CA	24G x 3/4"
Microsurgical dilator	S&T	D-5a.1	Dilator, 11 cm, FH, 0.1 mm AT10d