Abstract
Le malattie cardiovascolari affligge tutto il mondo a causa di cambiamenti di lifestyle intensive. Rigenerazione del cuore una grande promessa per riparazione e ripristino cardiomiociti persi a causa di infortunio e malattia. In contrasto con la rigenerazione cardiaca robusta di alcuni vertebrati inferiori, cuori mammiferi adulti mostrano tipicamente una capacità minima di rigenerazione cuore e riparazione. Tuttavia, studi recenti hanno suscitato un notevole interesse scientifico con la constatazione che, tra il giorno postnatale 1-7 (P1 a P7), il cuore neonatale del mouse mantiene notevole potenziale rigenerativo dopo la resezione apicale (cioè, amputazione chirurgica e l'esposizione di sinistra apice ventricolare). Una polemica importante su questo risultato potrebbe essere dovuto alle diverse procedure di chirurgia legati utilizzati negli sforzi per replicare o espandere su questo importante risultato. Queste istruzioni presentano dinamicamente i materiali e la metodologia per la resezione apicale in un modello di topo. Le fasi salienti di questo roditore Survivachirurgia l coinvolge ipotermia anestesia, toracotomia, amputazione chirurgica del ventricolo cuore apice, e sutura e il recupero di topi. L'approccio descritto potrebbe espandere l'applicazione del modello di topo di resezione apicale per la ricerca cardiovascolare.
Protocol
Tutti gli esperimenti di topo sono stati approvati dalla cura degli animali e Use Program presso il National Institutes of Health (NIH) con il numero di protocollo H0083R3. Il NHLBI IACUC ha approvato il protocollo, senza analgesici.
1. L'ipotermia Anestesia nei topi neonatale
- Sterilizzare spugne e apparecchi chirurgici in autoclave prima dell'intervento chirurgico. Preparare tutti i materiali chirurgici e accendere un caldo tallone sterilizzatrice 15-20 minuti in anticipo per raggiungere 240 ° C a 270 ° C.
- Trasferire tutte C57BL / 6 cuccioli (età P1) dalla loro madre durante l'allattamento per una gabbia pulita mouse con biancheria fresca e materiali per i nidi. Una volta che i cuccioli sono presi in una sala operatoria, eseguire la chirurgia apicale prontamente per minimizzare il tempo trascorso separato dalla madre e per ridurre il rischio di cannibalizzazione materna.
- Mettere spugne su un letto di ghiaccio e poi mettere un cucciolo sulla spugna per ~ 3 min per raggiungere l'anestesia ipotermia. Confermare anestesia osservando apnea e acinesia e pizzicando un piede posteriore. Controllare lo stato dei neonati spesso perché troppo poco tempo non farà il akinetic cucciolo e apnea, e una durata eccessiva di anestesia può abbassare il tasso di sopravvivenza 12.
2. Toracotomia
- Trasferire il cucciolo dal letto di ghiaccio su una zona banco chirurgica e l'uso del nastro di immobilizzare le braccia, gambe e la coda in posizione supina.
- Disinfettare il petto con betadine e delicatamente pulire con un tampone imbevuto di alcool al 70%.
- Fare un incisione cutanea trasversale lungo la zona via intercostale della cavità toracica con una Vannas primavera forbice, e quindi smussare sezionare i muscoli intercostali avanti per facilitare l'accesso al cuore.
NOTA: I tassi di sopravvivenza migliorano quando la perdita di sangue è ridotto al minimo durante il processo chirurgico.
3. amputazione chirurgica del Cuore ventricolare Apex
- A mano, applicare delicatamente pressione sull'addome per esteriorizzare laapice del cuore. Assorbire sangue intorno l'area chirurgica con applicatori con punta in cotone sterili per la visualizzazione chiara. Per i neonati di controllo sham, procedere direttamente al punto 4 (Sutura e recupero dei Topi).
- Sotto una lampada di ingrandimento e con iridectomia forbici, eseguire delicatamente la resezione frammentaria del ventricolo sinistro (LV) finché la camera LV è esposto. Fare attenzione a ridurre al minimo le parti asportate del LV. Circa il 15% la resezione è necessaria per conseguire esposizione ottimale della camera di LV.
- Assicurarsi che il cuore ritorna alla cavità toracica appena la camera di LV è esposto.
4. Sutura e recupero dei topi
- Suturare le costole e muscoli insieme per sigillare la cavità toracica utilizzando sterili suture Proline 6-0, e quindi chiudere con cura il sito di incisione cutanea con colla pelle.
- Scaldare il neonato sotto una lampada di calore per ~ 3 minuti di recupero, e poi pulire il sangue e tracce di colla utilizzando un preparato alcolico pad 70% before reintroducendo ai suoi fratellini. Prova a completare l'intera procedura chirurgica entro 10 minuti perché riducendo al minimo il tempo trascorso separato dalla madre migliora la sopravvivenza dei cuccioli dopo resezione apicale.
- Dopo ogni intervento chirurgico, collocare gli strumenti chirurgici in contatto con i talloni del tallone sterilizzatrice a caldo per circa 20 sec per sterilizzazione completa. Lasciare gli strumenti chirurgici per raffreddare a TI prima di ogni intervento chirurgico.
- Dopo aver completato interventi chirurgici per tutti i cuccioli in una cucciolata, mescolare i cuccioli con biancheria da letto e gli escrementi della madre prima di tornare al nido della madre.
NOTA: In genere, ICR / CD-1 topi sono madri adottive meglio di C57BL / 6, ma anche tra le madri che allattano di uno stesso background genetico, gli istinti che favoriscono variano. In caso di sostituzione di una madre che allatta è necessario per ridurre la mortalità materna entro cannibalizzazione, rimuovere i cuccioli P0 ad una madre che allatta e quindi eseguire la resezione apicale in P1. Solo eseguire sia l'operazione simulata o r apicaleesection in una cucciolata di cuccioli, perché mescolando finzione e cuccioli chirurgiche potrebbero diminuire il tasso di sopravvivenza del gruppo chirurgico di cuccioli 6.
Analisi 5. post-chirurgica
- Un giorno dopo l'intervento chirurgico, monitorare i cuccioli, garantire che non vi è alcuna differenza tra finzione e gruppi chirurgici, e contare il numero di cuccioli per misurare il tasso di sopravvivenza. Se gli interventi vengono eseguiti correttamente, i tassi di sopravvivenza dovrebbero essere simili e superiore al 60% sia finto e gruppi chirurgici.
- Isolamento Cuore e fissazione.
- Eutanasia i cuccioli a giorni 1 e 2 post-operatorio tramite decapitazione e il giorno 21 post-operatorio da CO2, con una garanzia di morte da dislocazione cervicale, quindi pulire il petto con un preparato alcolico del 70%.
- Incidere la pelle linea mediana e muscoli del torace e poi aprire il torace.
- Asportare l'intero cuori dalla cavità toracica e fissare l'intero cuore di ogni campione in 5 ml di 4% paraformaldeide O / N a RT.
- Il giorno successivo, trasferire i campioni al 70% di etanolo. I campioni possono essere conservati fino a una settimana prima della paraffina.
- Slice sezioni di paraffina a 5 micron di spessore attraverso l'intero ventricolo ed eseguire ematossilina standard ed eosina (H & E) e la colorazione tricromica di Masson per esaminare la risposta rigenerativa 5, 7. In particolare, H & E macchia è utilizzato per esaminare la sostituzione del muscolo e macchia tricromica di Masson è utilizzato esaminare le risposte fibrotiche 5.
- Selezionare l'area di interesse e creare almeno tre focolai per campione manualmente utilizzando uno scanner di diapositive. Immagine e analizzare i vetrini di colorazione a 40 × ingrandimenti secondo le istruzioni del produttore con i parametri di default.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cuccioli di topo sono stati sacrificati 1, 2, e 21 giorni dopo la resezione-apicale, e il loro cuore sono stati raccolti per H & E e macchia Trichrome di Masson. Colore blu a macchia tricromica di Masson indica la deposizione di matrice extracellulare epicardico 5. Con successo resezione apicale, un coagulo di sangue è effettivamente formata per sigillare il LV uno giorno post-resezione apicale, come mostrato nella Figura 1A. Un graduale riassorbimento del coagulo di sangue e fibrosi cardiaca precoce è osservata, e sostituzione con tessuto miocardico si verifica fino completa rigenerazione del miocardio ha luogo 21 giorni dopo la resezione apicale (Figura 1B e C). L'analisi morfologica mostra alcuna differenza tra i cuori sottoposti a resezione e sham-operati a 21 giorni dopo l'intervento chirurgico (Figura 1C e D).
Figura 1. Rappresentante H & E e di MassonColorazione tricromica. Miocardio ventricolare di cuori del mouse neonatale 1 (A), 2 (B), o 21 (C) giorni dopo la resezione apicale e 21 giorni dopo l'intervento sham (D). Per ogni subfigure, la barra della scala del pannello di sinistra è di 1 mm e la barra della scala del pannello destro è di 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Spese di pubblicazione per questo articolo sono stati sponsorizzati da un dono da Strumenti Belle Science il dottor Jian Hou.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Drs. James Hawkins, Zu-Xi Yu e Xuan Qu dal National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) per la loro assistenza con la chirurgia del mouse e la preparazione e la colorazione delle sezioni di paraffina. Gli autori sono grati al NIH Fellows Comitato Editoriale per l'assistenza editoriale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors, 1.5 mm | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Vannas Spring Scissors - 2 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-03 | Iridectomy scissors |
| Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Iris Forceps, Straight, Serrated | Fine Science Tools | 11064-07 | |
| Iris Forceps, Curved, Serrated | Fine Science Tools | 11065-07 | |
| Shea Scissors - Curved/Blunt-Blunt/12cm | Fine Science Tools | 14105-12 | |
| Round Handled Suture Tying Forceps, Straight | Fine Science Tools | 18025-12 | |
| Round Handled Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15400-12 | |
| Fine Hemostat | Fine Science Tools | 13007-12 | |
| Magnifying Lamp | Luxolamp Corp | IM120 | |
| Heating lamp | Brandt Equipment llc | 51152/3 | |
| 6-0 Prolene sutures | Ethicon | 8889H | |
| Skin glue-Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicators | Dynarex | 4305 | |
| WEBCOL Alcohol Prep Pad | Covidien | 6818 | Medium 2 PLY, 200/BOX, Satured with 70% Isopropyl Alcohol |
| Curity All Purpose Sponges | Covidien | 9024 | Non-woven 4 PLY, 4"x4" (10.2cm×10.2cm) |
| Bench top protector sheet | KIMTECH SCIENCE | 7546 | 18" x 19.5" (45.72cm x 49.53cm) x 50 |
| 0.9% Sodium Chloride, 250ml | Hospira Inc. | NDC 0409-6138-22 | |
| Betadine Solution Swabsticks | Purdue Products L.P. | NDC 67618-153-03 | |
| Autoclave | TOMY Digital Biology | SX-700 | HIGH-PRESSURE STEAM STERILIZER |
| Slide scanner | HAMAMATSU | NanoZoomer 2.0-RS |
References
- Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6, 231-239 (2014).
- Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 14, 529-541 (2013).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R. Turning back the cardiac regenerative clock: lessons from the neonate. Trends Cardiovasc Med. 22, 128-133 (2012).
- Porrello, E. R., Olson, E. N. A neonatal blueprint for cardiac regeneration. Stem Cell Res. 13, 556-570 (2014).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nat Protoc. 9, 305-311 (2014).
- Allen, T. C. Armed Forces Institute of Pathology. Hematoxylin and eosin. Laboratory methods in Histotechnology. Prophet, E. B., Mills, B., Arrington, J. B., Sobin, L. H. , American Registry of Pathology. Washington DC. 53-58 (1992).
- Andersen, D. C., Ganesalingam, S., Jensen, C. H., Sheikh, S. P. Do neonatal mouse hearts regenerate following heart apex resection? Stem cell reports. 2, 406-413 (2014).
- Kotlikoff, M. I., Hesse, M., Fleischmann, B. K. Comment on 'Do neonatal mouse hearts regenerate following heart apex resection?'. Stem cell reports. 3, 2 (2014).
- Sadek, H. A., et al. Multi-investigator letter on reproducibility of neonatal heart regeneration following apical resection. Stem cell reports. 3, 1 (2014).
- Andersen, D. C., Jensen, C. H., Sheikh, S. P., et al. Response to Sadek et al. and Kotlikoff et al. Stem cell reports. 3, 3-4 (2014).
- Phifer, C. B., Terry, L. M. Use of hypothermia for general anesthesia in preweanling rodents. Physiol Behav. 38, 887-890 (1986).
- Laflamme, M. A., Murry, C. E.
- Laflamme, M. A., Murry, C. E.
- Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 13380-13385 (2012).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
