Introduction
O factor de transcrição ubíqua e constitutivamente expresso interferão (IFN) factor regulador 3 (IRF3) é crítica para a primeira linha de defesa contra agentes patogénicos, principalmente, através da indução de IFNp, mas também através da indução da quimioquina (CC motivo) ligando 5 (CCL5 ) e várias proteínas anti-virais, incluindo a proteína induzida por IFN com tetratricopeptide repete IFIT1 / 2/3 1-3. IRF3 activação tem sido relatada após infecção com numerosos vírus, ou a exposição ao ácido polyinosinic-polycytidylic (poli I: C) ou lipopolissacárido (LPS) 4. É importante ressaltar que os vírus mais estudados desenvolveram mecanismos para fugir da resposta mediada por IRF3, e, assim, escapar o anfitrião defesa imune inata 5. Assim, a monitorização IRF3 activação é de grande importância para compreender os mecanismos moleculares da defesa do hospedeiro antiviral inata, mas também para identificar a estratégia utilizada pelo vírus para neutralizar esta resposta.
ENT "> Muitos relatórios publicados no entanto proporcionar apenas uma limitada análise de activação IRF3 realizada pela monitorização da indução do gene IRF3-alvo (IFNB1 e IFIT1) e / ou ensaio de gene repórter da luciferase associada a electroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio de baixa resolução (SDS- PAGE) análise de IRF3. No entanto, numerosos estudos bioquímicos, a análise do comportamento de vários mutantes IRF3 e elucidação da estrutura cristalina IRF3 6-11 contribuíram para estabelecer IRF3 que é submetido a uma série complexa de modificações pós-traducionais sequenciais por fosforilação em múltiplos locais. O conjunto de fosforilação envolvida na activação IRF3 parece ser dependente do estímulo e provavelmente do tipo de célula. Em células não infectadas, IRF3 coexiste como as espécies não-fosforilados e hipofosforilado contendo phosphoresidues, incluindo Thr135 e Ser173, no 1 região N-terminal -198 aa 6,12-14. Acumulação deste f hipofosforiladoORM de IRF3 é induzida por indutores de stress, factores de crescimento e agentes que danificam o DNA 6. A fosforilação de resíduos de Ser / Thr na região C-terminal de IRF3 que contém o domínio de transactivação é accionado a seguir a activação por vírus, poli I: C ou LPS em um tipo de célula modo dependente 15-17. C-terminal fosforilação de IRF3 envolve nada menos do que 7 sites de phosphoacceptor distintos organizados em dois grupos principais, Ser385 / Ser386 e Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405, que cada um contribuir para a ativação IRF3 através de dimerização, a acumulação nuclear, associação com o CREB liga�o ao proteína (CBP) / coactivators P300, a ligação ao IFN elemento de resposta sensível (ISRE) sequências de consenso e de transativação de genes alvo 9,10,17-19 DNA. Fosforilação de Thr390 também é pensado para contribuir para a ativação induzida por vírus IRF3 20. Análises de espectrometria de massa de IRF3 demonstraram que Ser386, Thr390, Ser396 e Ser402 resíduos são directamente phosphorylated pelo inibidor da quinase kB ε (IKKε) / vinculativo TANK quinase 1 (TBK1) quinases 9,10. A fosforilação nos resíduos C-terminal é também necessário para a terminação da activação através IRF3 polyubiquitination e degradação mediada por proteassoma 10. Este processo é também dependente da fosforilação em Ser339, que é necessário para o recrutamento de isomerase propil Pin1 10,11. IRF3 espécies que contêm, pelo menos, fosfo-Ser339 / 386/396 resíduos são considerados formas hiperfosforiladas. A seqüência exata ea função de cada local continua a ser um assunto de discussão 10,21. É agora claro que IRF3 activado não representa um estado homogêneo, mas que as espécies activadas diferentes que apresentem características de fosforilação ou dimerização distintas existir 10,22.Para fornecer uma compreensão completa da ativação IRF3 em resposta a patógenos específicos, é necessário, portanto, characterize qual das espécies activadas são induzidas. A indução de genes alvo, IRF3 IFNB1 e IFIT1, provou proporcionar uma leitura fiável para a activação IRF3. No entanto, o acompanhamento expressão destes genes não faz distinção entre diferentes estados de ativação de IRF3. Uma análise abrangente dos estados de ativação IRF3 em um ambiente particular, baseia-se na caracterização detalhada de sua fosforilação e dimerização estado 10. Não fosforilada (forma I), hipofosforilado (forma II) e (hiperfosforiladas formas III e IV) formas IRF3 6,18,23 pode ser resolvido com êxito por mobilidade reduzida em alta-resolução análise de SDS-PAGE. Espécies IRF3 monoméricos e diméricos podem ser eficientemente identificado por análise de PAGE nativa. Estas abordagens são grandemente melhoradas quando utilizada em combinação com anticorpos dirigidos contra fosfoespec�ico IRF3 phosphoacceptor locais distintos.
Protocolos padrão permitem que um pobre de resoluçãoproteínas que não permite uma separação eficiente de formas fosforiladas IRF3 distintas. Aqui, descrevemos detalhadamente um procedimento para obter a mais alta resolução para monitorar a indução de espécies distintas IRF3 ativado-vírus usando SDS-PAGE acoplado a nativo-PAGE em combinação com immunoblot utilizando anticorpos totais e fosfoespec�ico. In vivo discriminação entre os diferentes ativado formas de IRF3 é executada com base nos seus deslocamentos de mobilidade observadas em SDS-PAGE. Além disso, IRF3 monómero e dímero podem ser distinguidos por electroforese não desnaturantes. A combinação destas duas técnicas complementares com immunoblot revela-se uma abordagem acessível e sensível para adquirir todas as informações necessárias para uma análise completa da activação mediada por fosforilação de IRF3.
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Protocol
NOTA: O protocolo é descrito aqui, usando células A549 infectadas com o vírus Sendai (SeV). No entanto, o protocolo de SDS-PAGE e PAGE nativa também funciona com todos os tipos de células humanas e de murino testadas até agora, particularmente células mielóides estimuladas com vários estímulos de activação 9,15,19,24,25 IRF3.
1. A infecção de células A549
- Manter células A549 em cultura numa placa de 15 cm a 37 ° C / 5% de CO 2 em 20 ml F12K médio / Ham contendo 10% de soro inactivado por calor fetal bovino (HI-FBS) e 1% de L-glutamina (F12K completo / meio Ham).
NOTA: Todas as soluções utilizadas para a cultura de células e tratamentos devem ser estéreis. - Aos 24 horas antes da infecção, Aspirar o meio e lava-se as células com 10 ml de água destilada salina tamponada com fosfato (D-PBS) à temperatura ambiente.
- Adicionar 1 ml de solução de tripsina-EDTA a 0,25% a cada placa para cobrir as células e incuba-se a 37 ° C durante 3 min.
- Pare a incubação, logo que thcélulas e começar a separar a partir da placa por suavemente batendo a placa com uma mão. Inativar a tripsina por adição de 10 ml de meio completo F12K / Ham pré-aquecido por placa e transferência das células para um tubo de 15 ml.
- Centrifugar a 350 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 8 ml de meio F12K / Ham completo para se obter uma suspensão de célula única homogénea.
- Contar as células usando um hemocitômetro. Semente as células a uma densidade de 1 x 10 6 culas por placa de 60 mm em 4 ml de meio F12K / Ham pré-aquecida completa. Incubar durante 20 - 24 horas a 37 ° C / 5% de CO 2. Depois de 20 - 24 horas, as células formam uma monocamada confluente a 90% (o que corresponde a 1,5 x 10 6 células).
- Remover o meio e lava-se as células com 2 ml de F12K isento de soro / meio Ham (SFM). Adicionar 2 ml de SFM fresco por placa de 60 mm.
- Descongelar uma alíquota do vírus Sendai (SeV) (armazenado alíquotas a -80 ° C) em gelo e brevemente vórtex.
- Diluir the vírus em pré-aquecido SFM obter 60 HAU / 100 l. Misturar por pipetagem cima e para baixo suavemente e adicione 100 ml de vírus diluído por placa para executar a infecção em 40 HAU / 10 6 células. Não adicionar o vírus na placa de controlo não infectados.
- Incubam-se as células na incubadora a 37 ° C / 5% de CO 2. Agitar as placas à mão 3 ou 4 vezes, ou utilizando um agitador orbital ou de balanço automática colocado directamente na incubadora, durante a primeira hora de infecção.
- Às 2 h pós-infecção, adicionar 2 ml de meio F12K / Ham contendo 20% de HI-FBS a obter uma concentração final de 10% de HI-FBS.
- Incubam-se as células na incubadora a 37 ° C / 5% de CO 2 durante 1, 4 e 7 horas adicionais, para atingir o tempo total de infecção de 3, 6 e 9 horas, respectivamente. Em cada um desses momentos, vá para a etapa 2.1.
2. Preparação de Extratos de células inteiras (WCE)
- Remover o meio de infecção. Colher as células por raspagem em 1 mlde gelo-D-SBF frio e transferir a suspensão de células a um pré-arrefecida de 1,5 ml tubo de centrífuga.
- Agregar as células por centrifugação a 16.000 xg, a 4 ° C durante 20 segundos e decanta-se cuidadosamente todos os vestígios de D-PBS.
NOTA: Nesta etapa, o sedimento de células pode ser directamente submetido a extracção de proteínas ou congelados rapidamente em azoto líquido ou banho de gelo / etanol seco e armazenado a -80 ° C até a lise. - Preparar o tampão de lise contendo 50 mM de HEPES pH 7,4, 150 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, 10% de glicerol e 1% de Nonidet P-40 em água desionizada (ddH2O). Extemporarily adicionar protease (1 ug / mL de leupeptina e aprotinina a 2 / ml ug) e inibidores de fosfatase (fluoreto de sódio 5 mM, 1 mM de ortovanadato de sódio activado, 2 mM de fosfato de p-nitrofenilo e 10 mM de glicerof osf ato-β pH 7,5).
NOTA: O tampão de lise sem inibidores podem ser armazenadas a 4 ° C. Um protocolo específico para a activação de ortovanadato de sódio é descrita na Tabela de Reagentes específico / Equipment. - Ressuspender o sedimento celular em 70 ul de tampão de lise. Tipicamente, a concentração será de cerca de lisado de 2 ug / uL.
- Incubar em gelo durante 20 min. Flash congelar o lisado por incubação num banho de azoto líquido durante 15 segundos. Descongelar o lisado à temperatura ambiente até que esteja completamente derretida e vórtice durante 10 seg. Repita o / descongelamento / ciclo vortex congelamento 3 vezes.
- Alternativamente, executar o passo de congelação num banho de etanol / gelo seco durante 1 min.
- Centrifugar a 16.000 xg, a 4 ° C durante 20 min. Transferir o sobrenadante (correspondente ao WCE) para um novo 1,5 ml pré-arrefecido tubo de centrífuga. Manter o WCE em gelo em todos os momentos.
- Quantificar proteínas utilizando qualquer procedimento de quantificação de proteína compatível com o tampão de lise, tais como à base de proteína de Bradford ensaio de 26.
3. Resolução do WCE por alta resolução SDS-PAGE
- Preparar três géis desnaturantes de electroforese.
- Para a detecção deFormas IRF3, despeje dois geles de um mínimo de 16 cm de comprimento com um gel de separação composto por 7,5% de acrilamida / bis-acrilamida (37,5: 1), 375 mM de Tris-HCl a pH 8,8 (RT), 0,1% de dodecilsulfato de sódio (SDS ), 1% de persulfato de amónio e 0,1% TEMED em ddH2O e um gel de empilhamento composto por 4% de acrilamida, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 0,05% de SDS, 1% de persulfato de amónio e 0,1% TEMED em ddH 2 O.
Cuidado! Acrilamida, TEMED e SDS são tóxicos e / ou irritantes. Usar luvas de protecção e manipular sob uma coifa. - Para a detecção de proteínas SEV, verter um gel de um mínimo de 8,5 cm de comprimento com características semelhantes às do gel descrito em 3.1.1, excepto em que o gel de separação contém 12% de acrilamida.
- Para a detecção deFormas IRF3, despeje dois geles de um mínimo de 16 cm de comprimento com um gel de separação composto por 7,5% de acrilamida / bis-acrilamida (37,5: 1), 375 mM de Tris-HCl a pH 8,8 (RT), 0,1% de dodecilsulfato de sódio (SDS ), 1% de persulfato de amónio e 0,1% TEMED em ddH2O e um gel de empilhamento composto por 4% de acrilamida, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 0,05% de SDS, 1% de persulfato de amónio e 0,1% TEMED em ddH 2 O.
- Desnaturar o WCE obtido no passo 2.6 pela adição de 1: 4 (v / v) de tampão 5x de carga (125 mM de Tris-HCl a pH 6,8 (RT), 10% de SDS, 20% (p / v) de glicerol, 0,0005% de azul de bromofenol e 25% β-mercaptoetanol em ddH2O), seguido por aquecimento a 100 °C durante 10 min. Rotação rápida dos tubos para derrubar a condensação que se forma no cap.
Cuidado! β-mercaptoetanol é tóxico por inalação. Usar luvas de protecção e manipular sob uma coifa. - Montar os géis do aparelho de migração. Encha as câmaras superiores e inferiores com tampão de corrida contendo 25 mM de base Tris, 0,1% de SDS e 192 mM de glicina em água destilada (dH2O).
- Carga de 14 mL de padrão de peso molecular em um bem de cada 16 centímetros gel e 7 ul de padrão de peso molecular em um poço do 8,5 centímetros gel. Carga 30 ug de WCE desnaturado (preparada tal como descrito no passo 3.2) por poço de os dois geles preparados no passo 3.1.1 para detecção formas IRF3. Carga 8 - 10 ug de WCE desnaturado (preparada tal como descrito no passo 3.2) por poço em o gel preparado no passo 3.1.2 para análise SeV.
- Executar os géis a 30 mA de corrente constante até a frente de migração atinge o fundo do gel.
NOTA: A migração normalmente dura approximately 3 horas para 16 centímetros um gel e 45 min para um 8,5 centímetros gel. - Prossiga para a transferência para membranas de nitrocelulose (etapa 5).
4. Análise de IRF3 Dimerization por Native-PAGE
NOTA: Este método foi originalmente descrito pelo grupo do Dr. T. Fujita 27.
- Prepare os superiores (-) e inferior (+) buffers de eletroforese câmara. O tampão de câmara superior é composto por 25 mM de Tris-HCl a pH 8,4 (RT), glicina 192 mM e 1% de desoxicolato de sódio (DOC) em ddH 2 O. A câmara inferior contém tampão de 25 mM Tris-HCl pH 8,4 (RT) e 192 mM de glicina em ddH 2 O.
NOTA: As memórias intermédias superior e inferior da câmara de electroforese pode ser armazenado a 4 ° C até à sua utilização. No entanto, certifique-se de que eles são pré-aquecida até à TA antes de realizar a eletroforese. - Pour um gel não desnaturante de resolução de um mínimo de 8,5 cm de comprimento contendo 7,5% de acrilamida / bis-acrilamida (37,5: 1), 375 mM de Tris-HCl a pH 8,8 (RT), 1% de muniçãopersulfato nium e 0,1% TEMED em DDH 2 O.
- Pré-correr o gel a 40 mA de corrente constante durante 30 min em gelo. Pressionar o aparelho de correr para o gelo, aproximadamente, ao nível do tampão de electroforese câmara inferior. É importante que o gel não está em gelo.
- Durante a pré-corrida, misturar WCE mantidas em gelo com tampão de carga nativa-PAGE 2x 1: 1 (v / v) contendo 125 mM de Tris-HCl a pH 6,8 (RT), 30% de glicerol e 0,1% de azul de bromofenol em ddH 2 O.
- Carga 8 - 10 ug WCE (preparada tal como descrito no passo 4.4) imediatamente no final da pré-corrida.
- Submeter o gel a 25 mA de corrente constante em gelo, tal como descrito acima para a pré-prazo, até a frente de migração atinge o fundo do gel (cerca de 40 min).
5. Análise de imunotransferência de IRF3 Espécies
- Preparar o tampão de transferência contendo 25 mM de base Tris e 192 mM de glicina em ddH 2 O. Refrigerar a transferência de tampão a 4 ° C antes da utilização.
- Wet três pedaços de membrana de nitrocelulose cortada num tamanho ligeiramente maior do que os geles em uma caixa de plástico / de vidro contendo o tampão de transferência. Indicar a orientação da membrana através do corte dos cantos. O tampão de transferência pode ser reutilizado 3 vezes. Armazenar o tampão a 4 ° C entre as utilizações.
- Uncast os géis (SDS-PAGE e PAGE nativa) e cortar um canto de cada gel para facilitar a orientação correcta.
- Para nativa-PAGE em gel a incubar à temperatura ambiente com agitação suave durante pelo menos 30 min no tampão de SDS-PAGE a corrente para remover o COD antes da transferência para o tampão de transferência.
- Incubar os géis de SDS-PAGE (e nativa-PAGE) em tampão de transferência durante 5 - 10 min.
- Montar um sanduíche de transferência por gel em uma cassete de transferência com a membrana para o eletrodo positivo (espuma papel pad / filtro / membrana / gel / filtro de papel / almofada de espuma). Ter cuidado para remover todas as bolhas entre as camadas da sanduíche.
- Realize a transferência como recomendado by fabricante para o aparelho de transferência usado.
Observação: executar todas as incubações e lavagens em os próximos passos na mesa vibratória de balanço ou orbital. - No final do tempo de transferência, incubar as membranas durante 15 min na solução de fixação contendo ácido acético a 7%, etanol a 40% e 3% de glicerol em ddH 2 O. Lavam-se as membranas 3x 5 minutos em PBS (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10,2 mM de Na 2 HPO 4 1,8 mM e KH 2 PO 4 em dH2O).
Cuidado! O ácido acético é tóxico, irritante e inflamável. Usar luvas de protecção e manipular sob a coifa.
NOTA: A solução de fixação pode ser reutilizado várias vezes. - Para a membrana nativo-PAGE prosseguir diretamente para a etapa 5.11.
- Lavar as três membranas de SDS-PAGE rapidamente em dH2O antes da incubação durante 1 min em solução Ponceau Red contendo 6,57 mM de Ponceau Red e ácido acético a 1% em ddH 2 O.
NOTA: A solução vermelho ponceau pode ser r eused várias vezes. - Lavar as membranas em dH2O até que o fundo é branco o suficiente para ver as bandas de proteína manchadas de vermelho. Nota os marcadores com um lápis e cortar o excesso de membrana em torno das proteínas. Destain as membranas por incubação durante 5 min em PBS, sob agitação.
- Incubam-se as membranas durante 1 hora à temperatura ambiente ou O / N a 4 ° C em solução de bloqueio (PBS contendo 0,05% de Tween 20 e leite seco a 5% não gordo (PBS-T-leite). Lavam-se as membranas 3x 5 min em PBS-T.
NOTA: A lavagem com PBS-T é opcional e só estritamente necessária quando se aplica anticorpos diluídos em PBS-T contendo 5% de albumina de soro bovino (PBS-T-BSA) (Figura 1 e Tabela 1) no passo seguinte. - Incubar as quatro membranas (a partir de SDS-PAGE e PAGE nativa-) com os anticorpos primários de acordo com a ordem sequencial detalhado na Figura 1 e Tabela 1. Execute 5x lavagens a 5 min em PBS-T.
Figura 1. Sequência de Análises Immunoblot. O esquema descreve os SDS-PAGE e PAGE nativa-géis individuais necessários para detectar as várias formas fosforiladas e monoméricos / IRF3 dimérica. A ordem específica dos anticorpos aplicados à membrana resultante de cada gel no processo de imunotransferência é descrito. Note-se que os anticorpos anti-actina são utilizados em primeiro lugar para assegurar carga igual das amostras antes da aplicação de quaisquer outros anticorpos específicos. A sequência alternada, com os anticorpos anti-actina sendo aplicada após os anticorpos anti-fosfo-IRF3, também funciona. Decapagem é usado entre anti-actina e anticorpos anti-SEV, ou entre anti-fosfo-IRF3 e anticorpos anti-IRF3 por causa da sobreposição de tamanho dos sinais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Os anticorpos primários | Diluição | O tampão de diluição | Incubação | Anticorpos secundários | Comentários |
| Anti-actina | 1 / 10.000 | PBS-T-BSA | 15 min a RT | Anti-murganho | Use após SDS-PAGE Antibodyies diluído pode ser reutilizado várias vezes, se for armazenado a 4 ° C na presença de 0,02% de azida sódica. |
| Anti-IRF3-P-Ser386 | 1/200 | PBS-T-BSA | O / N a 4 ° C | Anti-coelho | Use depois de Native-PAGE. Não é recomendável reutilizar o anticorpo diluído |
| Anti-IRF3-P-Ser396 | 1 / 10.000 | PBS-T-BSA | O / N a 4 ° C | Use após SDS-PAGE. Não é recomendável reutilizar o anticorpo diluído Anti-IRF3-P-396 também está disponível a partir de sinalização celular. Diluição óptima foi definida como 1 / 1.000 para este anticorpo, mas pode variar entre lotes. | |
| Anti-IRF3-P-Ser398 | 1 / 10.000 | PBS-T-BSA | O / N a 4 ° C | Anti-coelho | Use após SDS-PAGE. Não é recomendável reutilizar o anticorpo diluído |
| Comprimento total Anti-IRF3 | 1/7500 | PBS-T-leite | 3 h à TA | Anti-coelho | Use após SDS-PAGE. Anticorpo de comprimento completo anti-IRF3 pode ser utilizado após nativa-PAGE, mas é menos sensível para detectar o monómero. Anticorpos diluídos pode ser reutilizado várias vezes, se for armazenado a 4 ° C na presença de 0,02% de azida sódica. |
| Anti-IRF3-NES | 0,5 ug / ml | PBS-T-leite | 3 h à TA | Anti-coelho | Use depois de Native-PAGE. Antibodyies diluído pode ser reutilizado várias vezes, se for armazenado a 4 ° C na presença de 0,02% de azida sódica. |
| Anti-SEV | 1 / 14.000 | PBS-T-BSA | 3 h à TA | Anti-coelho | Use após SDS-PAGE. Antibodyies diluído pode ser reutilizado várias vezes, se for armazenado a 4 ° C na presença de 0,02% de azida sódica. |
| NOTA: A diluição e buffer utilizado para anticorpos secundários HRP-acoplados precisam ser otimizados, pois varia de uma empresa para a outra. | |||||
Tabela 1. Especificações de anticorpos utilizados no Processo de imunotransferência.
- Incubam-se as membranas com a peroxidase de rábano (HRP) conjugado a anticorpos secundários, conforme descrito na Figura 1 e Tabela 1. Lavam-se as membranas 5x 5 min em PBS-T, seguido por 2x 5 min em PBS, para remover completamente os traços de Tween.
- Incubam-se as membranas durante 1 minuto em um volume de reagente de quimioluminescência reforçada suficiente para cobrir completamente as membranas. Secam-se as membranas, utilizando papel de filtro.
- Coloque as membranas em um analisador de imagem luminescente para visualizar as bandas imunorreactivas.
- Como alternativa, realizar a detecção de bandas imunorreactivas usando sensíveis filmes X-Ray.
- Lavam-se as membranas 3x 5 minutos em PBS.
NOTA: Nesta etapa as membranas podem ser mantidos secos. No entanto, se mais de fraccionamento é necessária, é melhor para realizar a decapagem, antes da secagem da membrana. As membranas podem também ser armazenados de curto prazo em PBS. - Para as membranas que não necessitam de remoção entre incubação com anticorpos (ver Figura 1) proceder directamente para o passo5,20.
- Quando é necessária uma decapagem entre anticorpos (ver Figura 1), incubar as membranas em solução pré-aquecida de extracção contendo 2% de SDS, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT) e 0,7% β-mercaptoetanol em ddH2O a 50 ° C durante 20 min sob agitação regular. Lavam-se as membranas 3x 5 minutos em PBS.
NOTA: Agitação durante o procedimento de remoção é fundamental. De decapagem pode ser realizada num forno de hibridação. Alternativamente, de decapagem pode ser realizada usando membranas seladas em sacos de plástico e imerso em um banho de água. Neste caso, é importante para agitar as membranas 4 - 5 vezes durante a incubação. - Incubam-se as membranas durante 1 h à TA ou O / N a 4 ° C em PBS-T-leite.
- Repita os passos 5.12 a 5.16 de acordo com a Figura 1.
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Representative Results
A Figura 2 mostra uma imagem de imunotransferência típica de IRF3 detectada com anticorpos e anticorpos totais IRF3 IRF3 fosfoespec�ico contra-Ser396 e Ser398 após resolução de WCE por alta-resolução de SDS-PAGE. Em células não estimuladas A549, IRF3 é detectado como duas bandas a 50 e 53 kDa no SDS-PAGE correspondente à não-fosforilada (Forma I) e o hipofosforilado (Forma II) espécies de IRF3. A exposição de células A549 para SEV para 3 - 9 hr resultados em um deslocamento dependente do tempo para migrar lentamente formas hiperfosforiladas III e IV, que são bem distinguida das formas I e II. As bandas migram para hiperfosforiladas 55-57 kDa. As formas III e IV também são especificamente imunodetectada utilizando os anticorpos contra fosfoespec�ico Ser396 e Ser398. A imunodetecção de actina serve como um controlo de carga igual entre as pistas. Um controlo de infecção SeV é mostrado pela acumulação da nucleocápside do vírus da protein (N), que migra a 60 kDa.
Na Figura 3, o perfil de detecção obtidas a partir de IRF3 WCE resolvido por PAGE nativa-seguido por imunotransf erência utilizando anticorpos anti-IRF3 NES e anticorpos contra fosfoespec�ico Ser386 é mostrado. Em células não estimuladas A549, IRF3 é detectada como uma única banda correspondente à forma monomérica. Após a infecção com SeV para 3 - 9 horas, os níveis de redução de monómero IRF3 com uma acumulação concomitante de uma banda migrando lentamente que corresponde à forma dimérica da IRF3. Os anticorpos contra fosfoespec�ico Ser386 única detectar espécies IRF3 dímero.
Figura 2. Detecção de IRF3 Distinto fosforilados Espécies (formulário I-IV) Induzido por SeV A infecção em células A549. Células A549 foram deixados não infectadas ou infectadas com SeV para o indicavezes o Ted. WCE foram analisados por alta-resolução de SDS-PAGE seguido por imunoblot (IB), utilizando anti-IRF3-Ser396 (IRF-3-P-Ser396) e anti-IRF3-Ser398 (IRF-3-P-Ser398) anticorpos fosfoespec�ico e anti anticorpos proteína completa -IRF3. A infecção foi monitorizada utilizando anticorpos anti-SEV (a proteína da nucleocápside N é mostrado). Os anticorpos anti-actina foram utilizados como controle de carga. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Monitorização de fosforilada / dimerizado por indução IRF3 SeV em células A549. As células A549 foram deixadas não infectadas ou infectadas com SeV durante os tempos indicados. WCE foram resolvidas por PAGE nativa e-revelado por imunotransf erência utilizando anticorpos anti-IRF3-Ser386 (IRF-3-P-Ser386) e anticorpos anti-fosfoespec�ico IRF3-NES ANTIBodies. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo aqui descrito consiste de uma combinação de alta-resolução de SDS-PAGE e PAGE nativa-acoplado com a utilização de vários anticorpos fosfoespec�ico para distinguir o monomérica / dimérica e phosphoforms I-IV da IRF3. Detecção adequado dessas espécies IRF3 é essencial para caracterizar completamente a ativação IRF3 em um ambiente específico. Por exemplo, estimulação por LPS de macrófagos activados, conduz à formação de dimérico, Ser396 / 398 IRF3 fosforilado que exibe uma hipofosforilado (Forma II), mas não hiperfosforilada (forma III e IV), no teste padrão de SDS-PAGE a 15. Utilizando o protocolo descrito, este perfil pode ser distinguido a partir de formas hiperfosforiladas induzida por vírus que requerem fosforilação Ser339 adicional, além de Ser386 e Ser396 fosforilação 10. Importante, este também permite discriminar entre a Ser396 fosforilada espécies que não apresentam a dimerização, mas são transcricionalmente activa 10. Eu souportantly, é preciso notar que o padrão de forma I a IV de phosphoforms IRF3 aplicado a IRF3 humano. O Murino IRF3 não exibem um padrão semelhante e, por conseguinte, de activação de IRF3 é caracterizada apenas pela utilização de anticorpos fosfoespec�ico em imunotransferência após SDS-PAGE e por PAGE nativa.
A concretização de uma separação de alta resolução da espécie fosforilada distintos de IRF3 por SDS-PAGE requer parâmetros específicos. Para a resolução adequada, é muito importante o uso de géis que têm um comprimento mínimo de 16 cm. Mesmo com este comprimento do gel de separação, que é a chave para permitir a migração da frente atingir o fundo do gel para se obter uma separação adequada das diferentes formas IRF3. Além disso, o gel de empacotamento deve estender-se para um mínimo de 1 cm abaixo do pente para obter bandas bem definidas. Isto é importante, como as formas hiperfosforiladas de IRF3 migram muito próximas uma da outra. Mal bandas focadas irá resultar em falta de distinção entre phosphorylated forma prejudicando sua respectiva quantificação. Além disso, a concentração de persulfato de amónio e TEMED variar de um protocolo de SDS-PAGE para outro. Variação nestas concentrações daqueles aqui indicados foi encontrado para prejudicar significativamente a resolução na separação das espécies IRF3.
A detecção de formação IRF3 dímero através do-PAGE nativa foi originalmente descrito pelo grupo do Dr. T. Fujita. Este protocolo utiliza tampão contendo DOC que permite a dissociação do dímero IRF3 de CBP / p300 27. É altamente recomendável para prosseguir para-PAGE nativo imediatamente após a lise celular, como o armazenamento da WCE a -80 ° C verificou-se resultar numa alteração significativa da razão monómero IRF3 / dímero. Além disso, é muito importante que o pH dos tampões de câmara superior e inferior é ajustado para pH 8,4, à TA, e não a 4 ° C, após mistura de todos os componentes para obter a separação adequada do monómero vs dímero. Uma separaçãogel com um comprimento mínimo de 8,5 centímetros permite a separação adequada de monômero IRF3 e dímero. O volume ideal de amostra mais tampão de carregamento é de cerca de 8 ul para a 5 mm bem como a resolução é melhor quando o volume é reduzido ao mínimo. Assim, é importante usar o menor volume de tampão de lise para obter WCE com uma elevada concentração. No entanto, deve ser tido em conta que a extracção de proteína requer a lise eficiente de, pelo menos, 5 vezes o volume do sedimento celular. Se o volume das amostras excede o limite indicado acima, isso iria resultar em má resolução do monómero / dímero. Isto pode ser resolvido através da adição de um gel de empilhamento a 4% contendo acrilamida, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 1% de persulfato de amónio e TEMED a 0,1% em ddH 2 O. É muito importante para carregar as amostras sem perturbar bandas. Carregando lentamente com um gel de carregamento de ponta estreita para o fundo do poço, dá resultados muito bons.
Aqui, descrevemos a in vivo detecção da fosforilação em resíduos específicos utilizando anticorpos fosfoespec�ico atualmente disponíveis contra Ser386 9, 19 e Ser398 Ser396 15. A utilização de mutantes IRF3 e espectrometria de massa análises confirmaram que estes resíduos são fosforilados após a infecção pelo vírus ou a sobre-expressão de cinases IKKε / TBK1 e são essenciais para a activação IRF3 6,9,10,19,21. A imunodetecção de fosfo-Ser396, Ser398 e fosfo-IRF3 total após SDS-PAGE requer o uso de dois geles idênticos (Figura 1). Com efeito, observa-se uma perda significativa de sensibilidade quando são utilizados anticorpos fosfoespec�ico após a remoção da membrana. Portanto, é altamente recomendado o uso de anticorpos fosfoespec�ico primeiro. Note-se que os anticorpos primários e secundários alternativos também podem funcionar, mas as diluições e sequência de uso específicos devem ser otimizados. Para a análise IRF3, 30 ug de WCE é adequado para se obter uma detecção significativa de IRF3fosforilação por imunotransf erência usando os anticorpos indicados pelo uso de 4 mm de largura poços. Embora em muitos tipos de células infectadas com vírus diferentes 30 ug verificou-se ser apropriado, esta quantidade pode precisar de ser aumentada, dependendo do tipo de célula e da estimulação. É preferível utilizar extractos frescos para SDS-PAGE, mas a detecção de fosforilação IRF3 utilizando os anticorpos descritos na presente fosfoespec�ico papel é suficientemente estável para permitir um ciclo de armazenagem do WCE a -80 ° C antes da análise. As concentrações de inibidores de fosfatase aqui descritas verificou-se ser suficiente para se utilizar células A549. Concentrações mais elevadas não foram encontrados para produzir melhores resultados. No entanto, estas concentrações talvez precise ser aumentado quando se estuda a ativação IRF3 em tipos de células que apresentam níveis mais elevados de actividade de fosfatase. É importante ressaltar que a fosforilação de IRF3 e os mecanismos subjacentes ainda estão longe de ser compreendido. Por conseguinte, um painel completo de Ser / Thr- Tyr-fosfatase e emhibitors é usado para bloquear possíveis atividades ainda descaracterizados que poderiam afetar a detecção de IRF3 fosforilação, dimerização e degradação. Para a detecção de monómero e dímero IRF3 após a maioria das infecções por vírus e na maioria dos tipos de células, 8 - 10 ug WCE verificou-se ser suficiente. Todavia, a maior quantidade de proteínas pode ser necessário para a estimulação activação IRF3 menos eficientemente. Os anticorpos contra fosfoespec�ico Ser386 utilizados neste estudo são recomendados para serem usados em-PAGE nativa como a sensibilidade em SDS-PAGE desnaturante é muito fraco. Além disso, a fosforilação em Ser386 é proposto para correlacionar com a forma dimérica de IRF3 9, tornando assim a utilização destes anticorpos na nativa-PAGE de uma estratégia adequada para confirmar este conceito num ambiente específico. De nota, os anticorpos alternativos estão disponíveis a partir de várias empresas e são reivindicados a detecção eficaz fosfo-Ser386 após SDS-PAGE. Anticorpos contra fosfoespec�ico Ser396 também têm sido eficientemente used para detectar IRF3 fosforilação após nativo-PAGE 20. Importante, Ser402 no cluster de terminal-C de sítios phosphoacceptor foi encontrado igualmente para ser importante para a activação IRF3 e a fosforilação de Ser402 foi observado através de análise por espectrometria de massa de IKKε / fosforilada-TBK1 IRF3 10,21,28. No entanto, apesar de duas tentativas diferentes (NG, não publicado), não há anticorpos fosfoespec�ico estão actualmente disponíveis para seguir a fosforilação deste resíduo específica in vivo. Note-se que anticorpos contra fosfoespec�ico Thr157 e Ser339 também foram descritos 11,13. Estes anticorpos fosfoespec�ico adicionais poderiam ser utilizados num procedimento de alta resolução de SDS-PAGE semelhante ao descrito aqui. Neste caso, grandes géis de SDS-PAGE adicionais seriam necessárias para cada anticorpo e processados da mesma maneira como o gel # 2 (Figura 1). Para nosso conhecimento não há anticorpos contra fosfoespec�ico Ser173 ou Thr390 ainda têm sido descritos,mas eles poderiam ser facilmente adicionados com o protocolo descrito aqui, uma vez que se tornam disponíveis 14,20.
Atividade IRF3 é denunciado por degradação mediada por proteassoma de formas hiperfosforiladas 11,17. O protocolo aqui descrito também permite a monitorização da degradação IRF3 quando a cinética da estimulação é prolongada e é acoplado com a utilização de inibidores de proteassoma (MG132, lactacistina ou bortezomid). Normalmente, em células A549 infectadas com SeV a 40 HAU / 10 6 células, IRF3 fosforilação começa assim que a degradação infecção e IRF3 pós-SEV 2 horas inicia-se após 12 horas. Degradação mediada por proteassoma será concluído a partir da diminuição observada de formas III e IV níveis em pontos de tempo final que é revertida em condições com inibidores de proteassoma. Isso também irá traduzir em nativo-PAGE em uma diminuição dos níveis de dímero IRF3 que são recuperados após tratamento inibidor do proteassoma 29. Importante, o techni de alta resoluçãoQue aqui apresentada permite diferenciar o processo de degradação e a falta de activação. Com efeito, tanto a degradação e a falta de activação de IRF3 resultado na ausência de detecção de dímero / fosfo-Ser386 / 396. No entanto, a falta de activação está associada com a detecção de monómero IRF3 e de formas I e II, enquanto estas espécies IRF3 não são detectados quando IRF3 30 é degradada.
A imunoprecipitação acoplada com análise baseada em espectrometria de massa é um método de escolha para a detecção da fosforilação in vivo de IRF3 em locais distintos. Esta técnica foi utilizada para confirmar a fosforilação de IRF3 em Ser173, Ser175, Ser386, Thr390, Ser396 e Ser402 resíduos 10,20,21. No entanto, ainda não espectrometria de massa é uma técnica acessível / Benchside que pode ser facilmente utilizado para a análise diária de activação IRF3 após vários estímulos em diferentes pontos de tempo. Portanto, o procedimento aqui descrito utilizando SDS-PAGE acoplado a nativa-PAGE em combinação com immunoblot utilizando anticorpos totais e fosfoespec�ico constitui uma abordagem prática, acessível e sensível para detectar todas as formas atualmente definidos de actived IRF3.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | Warm in a 37 °C bath before use. |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 12483-020 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | For cell culture. |
| Trypsin/EDTA 0.25% | Life Technologies | 25200-072 | |
| Sendai virus Cantell Strain | Charles River Laboratories | 600503 | |
| Hepes | Bioshop | HEP001 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
| EDTA | Bioshop | EDT001 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Registred trademark corresponding to Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergent |
| Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
| Aprotinin | Bioshop | APR600.25 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | Activation of sodium orthovanadate 0.2 M : 1) Ajust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthotovanadate solution may vary with lots of chemical. 2) The solution is yellow at pH 10.0. 3) Boil until colorless. 4) Cool to RT. 5) Reajust the pH to 10.0 and repat steps 3-4 until the solution remains colorless and stabilizes at 10.0. Store the activated sodium orthovanadate aliquots at -20 °C. |
| p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Beta-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G6376 | |
| Bio-Rad Protein Assay Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | Cytotoxic |
| Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40% | Bioshop | ACR005 | Cytotoxic |
| Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | LabChem | LC15320-4 | Work under fume hood. Toxic and irritant. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | Irritant. |
| Amonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Toxic and irritant. |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Work under fume hood. Toxic to the nervous system, mucous membranes. May be toxic to upper respiratory tract, eyes, central nervous system. |
| Glycine | Bioshop | GLN001.5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Bioshop | SHY700 | Irritant. |
| Nitrocellulose membrane (0.45 mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Acetic acid glacial | Bioshop | ACE222.4 | Work under fume hood. Toxic, irritant and flammable. |
| Red ponceau | Sigma-Aldrich | P3504 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | For PBS composition for immunoblot. |
| Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | For PBS composition for immunoblot. |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | For PBS composition for immunoblot. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | For PBS-T-BSA composition for immunoblot. |
| Non-fat dry milk | Carnation | ||
| Poly sorbate 20 (Tween) | MP Biomedicals | 103168 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Store aliquoted at -20 oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF-3-P-Ser396 | Home made19 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Cell Signaling Technology | 4947s | Store at -20 oC. |
| Anti-IRF-3-P-Ser398 | Home made15 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Anti-IRF-3-full length | Actif motif | 39033 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Store aliquoted at -20 oC. |
| Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
| LAS4000mini CCD camera apparatus | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range | Bio-Rad | 161-0317 | Store aliquoted at -20 oC. |
References
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