Abstract
nörotransmitter ve nöromodülatör, ve sonuç olarak, farklı sinir yanıtların aktivitesi farklılıklar, anestezi uygulanmış ve uyanıklık hayvanlar arasında bulunabilir. Bu nedenle, uyanık hayvanlarda sinaptik sistemlerinin manipülasyonu izin yöntemleri anestezik etkilenmeyen nöronal işleme sinaptik girdilerin katkısını belirlemek için gereklidir. Burada, biz aynı anda dışı nöral aktiviteyi kaydetmek ve uyanık farelerde kayıt sitelerin yakınında birden çok nöroaktif maddelerin serbest bırakmak için elektrotların yapımında metodoloji sunuyoruz. Bu prosedürleri birleştirerek, biz seçici kafa ölçülü farelerin alt kollikulusun nöronlarda GABA A reseptörleri bloke etmek gabazine ve microiontophoretic enjeksiyonları yapıldı. Gabazine başarılı şekilde frekans tepki alan ve uyarıcı özgü adaptasyon olarak nöral yanıt özelliklerinin güncellenmiştir. Bu nedenle, biz yöntemleri recordin için uygun olduğunu göstermektedirg tek birim faaliyet ve işitsel işleme belirli nörotransmiter reseptörlerinin rolü diseksiyon için.
anlatılan prosedür ana sınırlama kayıt oturumları için hayvanın alışkanlık düzeyine göre belirlenir nispeten kısa kayıt süresi (~ 3 saat) 'dir. Diğer taraftan, çoklu kayıt seansları aynı hayvanda gerçekleştirilebilir. sinir iletiminin ya da (örneğin, sistemik enjeksiyonlar veya Optogenetic modellerin kullanımı gibi) nöromodülasyon seviyesini değiştirmek için kullanılan çeşitli deney prosedürler üzerinde bu tekniğin avantajı, ilaç etkisi, hedef nöron yerel sinaptik girişlerine sınırlı olmasıdır. Buna ek olarak, elektrot özel imalat nöral yapı ile (örneğin, kayıt sinyal-gürültü oranını geliştirmek için uç direnci gibi) ilgi nöron tipine göre belirli parametrelerin ayarlanmasına olanak tanır.
Introduction
Nöral eksitasyon ve inhibisyon etkileşimi duyusal bilginin 1 işlenmesi için esastır. Ayrıca anestezi kortikal aktivasyonu ve sinaptik girdilerin 2,3 zamansal desen dinamikleri üzerinde güçlü bir etkiye sahip olduğu bilinmektedir. Örneğin, anestetikler kortikal nöronlar 3,4 görsel olarak uyarılmış yanıtların süresini değiştirebilir gözlenmiştir. Ayrıca, eksitatör ve inhibitör sinaptik girdiler arasındaki oran hem uyarılmış değiştirerek ve spontan aktivite oranları 6,7, anestezi ve uyanık hayvanlarda 4,5 farklıdır. Uyanıklık sırasında, inhibisyon uyarma daha güçlü iken sinaptik iletkenlikleri ölçülerek, Haider ve arkadaşları 4 anestezi altında genlik bu engelleme eşleşen uyarma bulundu. Bu bulgular uyanık hayvanlarda duyusal işleme belirli sinaptik girdilerin etkilerini incelemek için deneysel prosedürlerin geliştirilmesini ister.
<p class = "jove_content"> (nA sırasına) küçük akım enjeksiyonları uygulanarak tahsil nöroaktif maddelerin kontrollü ejeksiyon yoğun sinaptik girdilerin katkısı ve duyusal işleme 8-13 varsayımsal hücre reseptörlerinin rolünü incelemek için kullanılır olmuştur . microiontophoresis olarak bilinen bu teknik, hızlı ve sınırlı etkiye katkıda kaydedilen nöron yakın ilaç uygulama sağlar. Bu prosedür, örneğin, sistemik enjeksiyonlar, mikrodiyaliz ya Optogenetic tekniklerin kullanılması gibi başka deneysel manipülasyonlar tarafından ortaya yaygın etkisi ile karşılaştırıldığında, nöroaktif maddelere lokal etkilerini araştırmak için daha uygundur. Genellikle, bir domuz geri elektrot konfigürasyonu 14,15 eşzamanlı hedef nöron kaydetmek ve ilgi nöroaktif maddelerin teslim etmek için kullanılır. Bu nöroaktif maddeleri taşıyan bir multibarrel pipet bağlı bir kayıt elektrotu içerir. o DeğişikliklerHavey ve CASPARY 14 tarafından açıklanan riginal prosedür uygulanmıştır. Örneğin, bir tungsten elektrot yerine cam, bir nöral etkinlik 16 kaydetmek için kullanılabilir. Kayıt gereksinimlerini karşılamak için tungsten tel ipuçları, cam izolasyon ve uç maruz kalma uyum elektrolitik dağlama: tungsten elektrotlar 17,18 imalatı için daha önce yayınlanmış yöntemler üç genel adımları içerir.Işitsel nörobilim ilginç ve acil saha uyaran özel adaptasyon (SSA 19) çalışmadır. SSA Diğer nadiren sunulan seslere genelleme değildir tekrarlayan seslere nöral yanıt belirli bir azalmadır. SSA önemi potansiyeli 20,21 uyarılmış işitsel beyin nöral mekanizma yatan sapma tespiti yanı sıra işitsel geç uyumsuzluk olumsuzluk bileşeni için olası bir nöronal karşılığı olarak potansiyel rolü bulunur. SSA oişitsel korteks 19,22-24 kadar IC ccurs. GABA A aracılı inhibisyonunun anestezi 26 etkilenebilir gösterilmiştir SSA 7,16,25 bir kazanç kontrol mekanizması olarak hareket ettiği gösterilmiştir. Burada daha önce ve uyanık farelerde GABAA reseptörlerinin seçici bir antagonist uygulaması esnasında IC nöronlarının tek ünite aktivite kayıt için daha önce tarif edilen yöntemleri birleştiren bir protokol mevcut. İlk olarak, biz domuz geri elektrotlar ve sonraki, cerrahi ve kayıt yöntemlerinin üretimi açıklar. ilaç salımı etkinliği test etmek için, açık alan hem de önce ve gabazine arasında microiontophoretic ejeksiyon sırasında IC nöronların SSA seviyesini karşılaştırıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deney prosedürleri onayı ile Salamanca Üniversitesi'nde yürütülen edildi ve standartlarına uygun yöntemler kullanılarak, Salamanca Hayvan Bakım Komitesi Üniversitesi yanı sıra Avrupa Birliği standartları (Direktif 2010/63 / EU) için nörolojik araştırma hayvanların kullanımı.
1. Tungsten elektrotlar
Not:. Tungsten elektrot üretimi Merrill ve Ainsworth 27 ve Ainsworth ve arkadaşları 28'de tarif edilen özgün tekniğe göre ve Bullock ve ark 17'de tanımlanan iş istasyonu kurulumu kullanılarak gerçekleştirilir..
- 2.5 M? - IC nöronların tek ünite dışı aktivite kayıt, 1.5 ucu empedansı ile elektrotlar kullanın. ayrıntılı bir açıklaması, yukarıda belirtilen referanslarda bulunabilir, çünkü burada, tungsten elektrot üretiminde gereken adımlar, sadece kısaca tarif edilmektedir.
- Bir özel yapılmış hizada tungsten tellerini yerleştirinaracı (Şekil 1A) istenilen uzunlukta kesilmesi yardımcı olmak için. Hizalama aracı teller ~ 40 mm uzunluğunu sınırlamak üzere bir ucunda bir stop 2 mm aralıklarla paralel olarak yapıştırılmış 30 iğne (25 g) oluşur. Dikkatle yapışkan bant ile tellerin gevşek uçları bağlamak ve güçlü makas ile tel kalanını kesti.
- tüm teller bantla bağlı kalır emin, hizalama aracı tungsten tellerin kaldırmak için bant yavaşça çekin. İyi bir elektrik bağlantısı var bu yüzden milin karşı sıkıca telleri tutan, cilalı pirinç mili (Şekil 1B, C) üzerine bant yuvarlayın.
- Iş istasyonunda 5 rpm motor mili bağlayın ve bir aşındırma çözeltisi (KNO 2, 80 ml başına 90 g) içine çıkıntılı tel ipuçları batırmayın. Açı dağlama çözeltisinin yüzeyinde 45 ° 'ekseni mili. tellerin ~ 1/3 çözüm temasa böylece tel ipuçları bırakın.
- Immdevreyi kapatmak için aşındırma banyoya bir karbon çubuk elektrot ERSE. mili dönerken mili mile aşındırma kaynağını uygulamak için bir bahar bakır örgü fırça kullanın. elektrotlar ve 250 mA dağlama çözeltisi geçirilir o anki ayarlayın. Geçerli 200 mA düştüğünde ucu aşındırma durdurun. tel uçları çok ince noktaları kazınmış olacak.
- herhangi bir yağ ve yapışkan kalıntılarını temizlemek için bir alev ile bir keskin tel geçmektedir. borosilikat cam boru içine tel (ilk kör uç) yerleştirin (1.5 mm OD, 0.86 mm iç çap) alt ucu modelleme kil ile bloke edildi. üst ve alt kısmında dikey pipet kelepçe. bir ısıtma bobini (çap 5 mm, derinliği 5 mm) ve bir asma pistonu kullanarak pipet çekin. Tel pistonun ağırlıkla aşağı doğru çekildiğinde, erimiş cam etrafında çok ince bir katman oluşturur.
- sodyum erimiş boncuk yardımıyla elektrotun keskin sonunda ucunu örten cam kaldırtetraborat. Bir boncuk haline dönüşene kadar boncuk oluşturmak için, bir ısıtma elemanı üzerine yerleştirin yavaş yavaş, su (~ 0.5 mi), küçük bir miktarda, sodyum tetraborat (~ 0.25 g) karışımı ve • çapı 2 mm. Isıtıcı elementin sıcaklığı, bir potansiyometre ile kontrol edilir. masaya sabitlenmiş bir manipülatör kolunun üzerine boncuk ve ısıtma elementi yerleştirin ve boncuk düşük büyütmede mikroskop altında odaklanmış kadar hareket ettirin.
- Bir slayta cam kaplı tel Güvenli ve mikroskop altında yerleştirin. ucu ve tetraborat boncuk odak kadar sahne kolları ile slayt taşıyın. biraz eriyene kadar boncuğu ısıtın ve tel ucu ~ 10 insert - 15 mikron. Isıtma potansiyometresini kapatın. boncuk soğuduktan gibi, sözleşmeleri ve altta yatan tungsten açığa elektrodun ucundan camı kaldırır. tungsten elektrot kullanıma hazırdır.
2. Multibarrel Cam Pipet İmalatı
- Çok uçlarını korumakvaril cam kapilerleri ısıyla daralan boru ile (H-konfigürasyonunda beş varil), çektirmenin kelepçeler daha iyi bir tutuş sağlamak ve kırılmaları önlemek ve dikey çektirmenin tane koyun.
- Bu parametreler, özellikle kurulum göre, yanı sıra değiştirildikten sonra 38. İnce ayar: Isı: 84, Alt mıknatıs kuvveti: 49, Ana mıknatıs kuvveti 15 mm ~ ucu uzunlukları edinmek için aşağıdaki parametrelere çektirme ayarlayın Isıtma elemanı.
- tıkalı ipuçları iki pipetler elde etmek için kılcal çekin. modelleme kil kullanarak bir slayt üzerinde bir pipet montaj ve dış çapı kadar ~ mikroskop altında 20 pipet kırmak - 30 mikron, ince makas veya forseps ya da bir neşter düz tarafını kullanarak. kırık kenar çok pürüzlü, adım 1.7'de açıklanan tetraborat boncuk tekniğini kullanarak rafine.
- 3 eksenli minyatür micropositioner sonunda 20 G iğne ile yapılan bir tutucuya (bölüm 1) tungsten elektrot yerleştirin mikroskop erkeklere üzerine montee. ~ Ucundan 30 mm 10 ° - forseps kullanarak, elektrodun 5 ucunu bükün.
- Mikroskop altında, dikkatle multibarrel ucu üzerinde tungsten elektrot hizalayın. Bir kez hizalanmış, iki üst varil arasındaki oluğa uydurma, multibarrel o kadar kişileri elektrot indirin. uzakta multibarrel ucundan 20 mikron - bu ~ 15 çıkana kadar elektrot ucu kaydırın. elektrot ve daha iyi bir bağ elde etmek için mümkün olduğu kadar küçük multibarrel ve daha ince bir topluluk arasındaki açı yapar.
- ipuçları uzak ışık-kurutmalı yapıştırıcı ~ 5 mm küçük bir damla uygulayın. tutkal multibarrel kanalları engellenmesini önlemek için ucu bulmuyor dikkatli olun.
- Bir mavi ışık LED lamba kullanarak tutkal Cure. Gerekirse daha iyi yapışması için, yapışkan uygulama / sertleştirme tekrarlayın.
- tungsten elektrot ucu, sahibinin serbest bırakılıncaya kadar hafifçe mikroskop sahne taşıyın. slayt domuz geri topluluk çıkarın.
- inci Wrapkısa bir uzunlukta kumbara geri elektrot e orta bölüm tüp ısı büzülme ve daha multibarrel tungsten elektrot sabitlemek için cam için hızlı kür epoksi uygun olan uygulayın.
Microiontophoresis 3. ilaçlar
Not: su içinde çözündüğünde microiontophoresis için kullanılan ilaçlar, bir elektrik yükü olması gerekir. ilgi ilaç bu işlem için uygun olup olmadığını görmek için literatürü kontrol edin. Burada, gabazine prosedürü, GABA A reseptörünün bir antagonisti, tarif edilmektedir.
- suyu sterilize ve hiçbir çözünen içeren güvenli bir 0.2 mikron şırınga filtre kullanılarak damıtılmış su filtre. Bu distile su kullanılarak gabazine 20 mM ~ 1000 ul hazırlayın.
- ince uçlu pH elektrodu kullanılarak 0.2 um filtre edildi NaOH ile 4'e seyreltme pH ayarlayın.
- -20 ° C'de 200 ul alikotları - 100 saklayın. kayıt gününde defrost. O gün, hayvan önce dizginlemekBir esnek plastik bir iğneye sahip bir 100 ul mikroenjektör kullanılarak, ilaçla multibarrel elektrot - (5 ul 3) baskı, varil doldurun.
4. Cerrahi ve Headpost implantasyon
- 27 ve 30 g ağırlıkları ile iki erkek CBA / J farelerinin (Mus musculus) deneyleri yapın. Bryant ve arkadaşları 29 cerrahi ve kayıt prosedürleri uygulayın, Portfors ve işbirlikçileri 30-32 ve Duque ve Malmierca 26.
- gün önce ameliyat olarak hayvanları ele almak ve onları özgürce keşfetmek için izin vererek kayıt odasına onları alıştırmak. Günde 3 seans, en az 30 dakika süren her birini gerçekleştirin. Bu şekilde hayvanların kayıtları sırasında sakin ve rahat olacak.
- kas içinden enjekte edilen Ketamin (50 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) içindeki bir karışımı kullanarak fare anestezisi. Bu doz ile hayvan yaklaşık 1 saat boyunca derin anestezi. bir thir tamamlayıcı dozlarda vermekbaşlangıç dozunun d gerektiği gibi.
- 38 ± 1 ºC sıcaklık korumak ve iki kulak çubukları ve bir lokma çubuğunu kullanarak bir stereotaksik çerçeve içinde, hayvanın kafasını stabilize etmek için ayarlanmış bir ısıtma battaniye hayvan yerleştirin. kulak çubukları ile kulak zarına delmek için dikkatli olun.
- oftalmik jel bir damla uygulayarak gözleri koruyun.
- makas kullanılarak kafa derisi Tıraş ve cildi dezenfekte povidon-iyot uygulayın.
- Bir neşter kullanılarak, kafatası maruz ve parietal ve oksipital kemiklerin daha rostral kısmını kaplayan periost geri çekmek için orta hat boyunca bir kesi yapmak.
- Kafatası üzerinde bir yuvarlak ve düz tabanı (5 mm çapında) ile hafif duralümin headpost (ağırlık ~ 0.65 g, uzunluk 30 mm, Şekil 2A) Tutkal. headpost ücretsiz uçları bırakarak ortasında bir gümüş tel Tutkal. gümüş tel elektrofizyolojik kayıt için referans elektrot olarak kullanılır.
- lig ince bir tabaka sürünht-kurutmalı kafatası üzerinde yapışkan ve headpost tabanı. 10 saniye bekleyin ve orta hat boyunca, parietal kemiklerin rostral alana headpost yerleştirin.
- Etkili bir yapışma gücü, ışık 20 saniye süreyle bir mavi ışık kaynağı kullanılarak yapışkan tedavi.
- üç delik etrafında ve elektrikli matkap ve küçük bir matkap ucu kullanarak headpost tabanına arkasında delin.
- kafatası ve headstage arasında ek temas noktalarını hizmet etmek delinmiş deliklerde iki saat vidasını (~ 2 mm uzunluğunda) yerleştirin. vidalar 1 ½ bir rahat uyum elde etmek için döner gerektirir. Onlar gevşek olmadığından emin olmak için forseps ile vidaları kontrol edin.
- emin kişileri Dura yapım üçüncü deliğe gümüş topraklama kablosunun ucunu yerleştirin. kafatasına teli bağlamak için su geçirmez siyanoakrilat yapıştırıcı küçük bir damla uygulayın.
- kafatası ile headpost bağı güçlendirmek için ışıkla sertleşen kompozit uygulayın. headpost tabanını Kapak, gümüş tel düşük kısmı,ve dikkatli olmak vidalar, kayıt sırasında erişime izin vermek için, lambda arkasında uzatmak değil. mavi ışık kaynağı kullanılarak Cure.
- Kafatasının üzerinde ekleme yakın boynun arkasındaki kas geri çekin. Küçük bir trefin (2.35 mm çapında) kullanılarak, alt kollikulusu (IC) ortaya çıkarmak için, sadece orta hatta lambda dikişine ve yanal altında bir yuvarlak pencere açın. Sınırlar gevşek olduğunda, ince cımbız ile kaplama kemiği yukarı çekin. Kanama oluşursa, bunu durdurmak için soğuk steril tuzlu su ile durulayın.
- Kompozit ve hafif kür o pencerenin etrafında küçük (~ yüksek genişliğinde 1 mm ve ~ 1 mm) duvar yapmak.
- antibiyotikli merhem ile maruz kafatası ve kas örtün. Sonra, kayıt penceresi etrafında duvar yaptıktan sonra iyice üretilen dolgu, steril serum fizyolojik ile IC maruz yüzeyini ıslak ve vazelin ile örtün.
- bir analjezik olarak (steril tuzlu su içinde 1:10 oranında seyreltildi 0.03 mg / kg) deri altına enjekte edilir Buprenorfin.
- t hayvan tutuno uyanır ve kayıt oturumları öncesinde üç gün boyunca ameliyatın onun konut kafesine geri gelene kadar o battaniyeyi ısıtılması. Bireysel rat's konut kafeste Ev hayvanları jöle temizleme kafes arkadaşları önlemek ve metal ızgara kapağı dokunmak headpost. Hayvan tek yer zaman kafeste bazı zenginleştirme yerleştirin. Ayrıca, günlük enfeksiyonu önlemek ve dikkatli bir şekilde hayvan düzgün kurtarır ve rahatsızlık herhangi bir belirti görünmüyor kontrol etmek için talaş değiştirin. vazelin maruz beyin korunması kayıt penceresi üzerinden olup olmadığını da kontrol.
5. Elektrofizyolojik Kayıt ve Microiontophoresis
- İyileştikten sonra, kayıt ortamına alışmaları için hayvan zaman vermek ve başını sahip ölçülü. Fare vücut büyüklüğü (Şekil 2B) oyulmuş bir ısmarlama yastıklı köpük süzgeç üzerinde otururken sahibine headpost sabitleyerek hayvan gelmesini. Bu irade limbu fare hareketleri ve sakinlik katkıda bulunacaktır.
- 10 dk seans ile başlayın ve giderek 120 dakikaya süresini kadar artar. Oturum sırasında, belirli aralıklarla 33 tatlı sıvılar ile hayvanlar (yoğunlaştırılmış süt, su içinde 30:70 seyreltilmiş) ödül. Daha sonra, kayıt oturumu sırasında, başında ve oturumun sonunda ya da hiç nöron izole ederken aynı ödül vereceğim.
- Hayvan çok kayıttan önce heyecan, hafif bir sakinleştirici asepromazin (2 mg / kg, intraperitonal) enjekte edilir. ilgi sinir sistemine göre, sedatif sonuçlarınızı etkileyebilir.
- 10 dakika - Hayvan özgürce 5 için kayıt odasına keşfetmek edelim.
- Köpük ısmarlama yastıklı süzgeç (Şekil 2B) içine hayvanın vücudunu yerleştirin.
- Stereotaktik çerçeve (Şekil 2C) bağlı bir tutucuya headpost edin. Bu hayvana bir sıvı ödül vermek için iyi bir zaman.
- CoBir pamuk battaniye ile hayvanın vücudunda ver ve gevşek plastik bir hemicylinder ve yapışkan bant kullanarak sabitleyin.
- kayıt penceresinden vazelin çıkarın ve sıcak steril tuzlu su ile durulayın.
- Tutanak sinirsel aktivite ve gabazine ve iyontoforez uygulaması.
- onun tutucu multibarrel elektrot, bir Microdrive tarafından kontrol edilir ve bir micromanipulator bağlı yerleştirin.
- küçük timsah klipleri kullanarak, kayıt için teller bağlayın. tungsten elektrot sonuna kadar olumlu terminali ve temas dura gümüş tel Toprak terminalini bağlayın.
- Her bir varil içinde bir kaplanmamış gümüş tel yerleştirin, böylece bir ucu temas çözüm ve diğer ucu erişilebilir. Üreticinin talimatları izleyerek, microiontophoresis cihaza bu amaçları bağlayın.
- ucu temas beynin yüzey kadar multibarrel elektrot hareket ettirin. th kuruma önlemek için sıcak steril tuzlu su uygulamake beyin dokusu. Bu noktada (gabazine -10 nA belirli ilaç için literatürü kontrol edin) bir tutma akımı uygulamak tek birim faaliyet ararken varil ucundan ilacın akmasını önlemek için.
- Tek nöron dışı aktivite izole etmek için standart teknikleri kullanın. Nöronun frekans tepki alanını (FRA) elde, yani frekansları ve nöron bu seslerin 34-36 duyarlı olduğu için cevabı uyandırabilen şiddetleri kombinasyonu.
- Benzer bir ateşleme hızı ve desen uyandırmak iki frekansları (f1 ve f2) seçin. Tuhaf paradigma altında olanlar frekansların her biri nadir ve tekrarlayan uyaran sunun.
Not: Kısaca, tuhaf paradigmada, bir frekans (f1) meydana gelme olasılığı yüksek olan tekrarlayan uyaran olarak sunulmaktadır, ikinci (f2) tekrarlayan olanlar arasında rastgele serpiştirilmiş nadiren ortaya çıkan sapkın uyarıcı, ise. İkinci tuhaf dizisinde, bağılİki uyaranların olasılıkları tersine çevrilir. Uyarma paradigması ayrıntıları daha önce 22,37 tarif edilmiştir. - (- 20 nA 10) pozitif değerlere akım kaydırarak gabazine serbest bırakın. Yine FRA edinin ve gabazine uygulama altında tuhaf bir paradigma tekrarlayın. görülmektedir ateşleme hızının gözle görülür bir etkisi kadar fırlamasını korumak; Özellikle ilaç konsantrasyonu ve püskürtme akımın büyüklüğüne bağlı olarak, 20 dakika - genellikle 5 alır. İlacın etkisi altında değerlerini elde etmek için kayıt protokolü tekrarlayın.
- tutma değerlerine mevcut döndürerek enjeksiyon durdurun. Tuhaf paradigmaya FRA ya da tepki değerlerini kontrol etmek döndüren izleyerek yıkayacak ilacın etkisi bekleyin.
Not: Kayıt seansları 2 sürebilir - günde 3 saat ve hayvan rahatsızlık veya mücadele herhangi bir işaret göstermesi durumunda daha erken sona erdirilmelidir. ödül sıvı vermek ve kayıt ch kapakvazelin ile amber.
6. Veri Analizi
- önce ve gabazine enjeksiyon yanı sıra SSA seviyesine sırasında FRA ölçün.
- Ortak-SSA indeksi (CSI) ve daha önce 19,22,23,38,39 açıklandığı gibi frekansa özgü SSA indeksi (SI) SSA tepkisinin gücünü ölçmek. CSI ve SI nadir uyarıcıya nöronal tepki ve tekrarlayan birine yanıt arasındaki normalize farkı yansıtmaktadır. Pozitif CSI ve SI değerleri (uyaran başına sivri) tekrarlayan sesleri daha nadir yüksek sinirsel tepki gösterir.
- kontrolü ve ilaç püskürtme durumuna gelen verileri karşılaştırmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz IC 4 iyi izole nöronların tek ünite aktivitesini kaydedildi. Uyanık farelerde hücre dışı kayıtları elde edilen tipik bir sinyal-gürültü oranı Şekil 3B'de gösterilmiştir. Şekil 4A önce ve GABA A blokajı gabazine ile reseptörlerinin boyunca her nöron frekans tepki alanını (FRA) göstermektedir. tepki kuvveti (ani / uyaran) ve spektral ayarlama bir genişlemesi olarak bir artışı gözlenmiştir. Uyarılmış yanıt artışı (Şekil 4B) sunulan tüm frekansları ve şiddetleri için nöral yanıt elde edilen birikmiş peri-uyarıcı zaman histogramlar da açıktı.
Nöronun FRA (Şekil 4A haçlar) içindeki frekansların Bir veya iki çift s, bir acayip paradigma tekrarlayan veya nadir sesler olarak sunulmak üzere seçildionların tepkileri SSA seviyesini tudy. Önce ve gabazine enjeksiyon sırasında iki örnek nöronlar (F1 ve F2) her bir frekans ses uyarılmış yanıtlar için Şekil 5A, B, nokta raster olarak gösterilmiştir. nokta Raster ve PSTHs gözlendiği gibi iki örnek nöronlar için, ses-uyarılmış yanıt net bir değişim oldu.
Aynı şekilde, GABA A reseptörlerinin yerel abluka önceki çalışmamızda 16 ile anlaşma nadir ve tekrarlayan sesleri büyük çoğunluğu (Şekil 5C) nöronal tepki yükseldi. SSA farklı düzeylerde olumlu CSI yansıdı f1 ve f2 sinirsel tepkileri, gözlenmiştir (CSI aralığında: -0.26 0.25 ± 0.23, 0.43) ve SI değerleri (SI aralığı: -0.41, 0.83 ile 0.23 ± 0.25) . Şekil 5D de görüldüğü gibi vakaların çoğu için, tekrarlayan sesi yükseldi tepki bu endekslerde bir düşüşe neden oldu
Tungsten Elektrotlar imalatı için Şekil 1. Malzeme. Yerinde bazı tungsten teller ile (A) Elektrot hizalama aracı. Soldaki hafif parça teller için bir durağıdır. Makas ucu bağlı elektrotlar bir parti ile. (B) Boş mili. (C) Mil istenilen uzunlukta tel kesmek için bir rehber olarak kullanılan yan gösterir ve bir tutucu üzerinde duran. Büyük halini görmek için tıklayınız bu rakamın.
Uyanık Fareler Recordings 2. Aksesuarlar rakam. (A) Headpost. (B) yastıklı köpük koruyucularını Ismarlama. Yeri tHer iki parçanın arasında o fare dışında başını bırakarak. stereotaksik çerçeveye (C) Değişiklikler. headpost tutucu (üst bar) headpost implantasyon sırasında yardımcı olur ve kayıtları sırasında başını sınırlamaktadır. Isırma parçası (alt bar) sadece headpost implantasyon sırasında kullanılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil Uyanık Mouse Kayıt 3. örneği. (A) fare IC bir nöronun Frekans tepkisi alanı. (B) bu nöron kaydedilen tepe Dalgaformları. (C, D) Nokta raster ve frekanslarda bir acayip paradigması kullanarak bu nöron kaydedilen peristumulus zamanlı histogram belirtilen noktalar (A). verilerden RedrawnDuque ve Malmierca 26 yayınlamıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
GABA A Blockade Şekil 4. etkisi Spectral ve Geçici Müdahale Özelliklerine reseptörlerinin. Dört IC (A) Frekans tepkisi alanı öncesi ve gabazine ve microiontophoretic enjeksiyonu sırasında nöronlar kaydedildi. (A) siyah haçlar frekansları nadir ve tekrarlayan sesler olarak sunulmak üzere seçildi göstermektedir. (B) öncesi ve enjeksiyon sırasında tepki alan oluşturmak için sunulan tüm frekansları ve şiddetleri sinirsel tepki peri-uyaran zaman histogramları Birikmiş gabazine evi. siyah çubuklar ses süresini gösterir.Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
GABA A Blockade Şekil 5. etkisi Tekrarlanan ve Nadir Sounds Tepki üzerine reseptörlerinin. (A, B) önce ve gabazine uygulanması esnasında ender (kırmızı,% 10) ve tekrar uyarıcı (mavi,% 90) olarak gösterilen bir frekans çiftine engelleyici yanıtı Nokta raster. Her frekans her biri nadir-ve tekrar olarak sunuldu şekilde iki dizi oynanır. Gölgeli arka plan uyaran süresini gösterir. (C). Nadir olarak öncesi ve gabazine uygulaması sırasında tekrarlayan ses olarak sunulan frekans yedi çiftleri Tek nöron yanıtları. (D) Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uyanık hayvanlarda nöroaktif maddelerin microiontophoresis soruşturma ve tek nöronların 40,41 aktivitesi belirli sinaptik girdilerin rolünü incelemek için güçlü bir tekniktir. Daha da önemlisi, bu işlem anestezik potansiyel müdahalesi olmadan nöral devrelerinde nörotransmitter ve nöromodülatör etkisi belirlenmesini sağlar. Burada, biz uyanık farelerin IC gabazine uygulaması sağlam frekans ayarlama (Şekil 4A), geçici tepki desenleri (Şekil 4B) ve SSA (Şekil 5) değişti olduğunu göstermektedir.
anlatılan prosedür ana sınırlama kayıt oturumları için hayvanın alışkanlık düzeyine göre belirlenir nispeten kısa kayıt süresi (~ 3 saat) 'dir. Diğer taraftan, çoklu kayıt seansları, aynı hayvan üzerinde gerçekleştirilebilir. microiontophoresis o ne kadar belirsiz kullanılarakuygulanan nöroaktif maddeler çevredeki dokuya yayılır. Bu nedenle, nöronal ağ aktivitesi üzerine olası etkisi kaydedilen nöron değil, aynı zamanda çevredeki glial ve nöronal hücrelerin sadece etkileyerek elde edebilir. Örneğin, şeker ve arkadaşları 42 hızlı bir şekilde kaldırılır belirli iyontoferik teslim moleküller, 600 um kadar yayılabilir göstermiştir. fareler IC bu aralık dendritik milleri ölçüde en kapak değil, aynı zamanda komşu hücrelerin nöronal tepkisini etkileyecektir. Olarak mekansal 16,43 işler, diğer deneysel daha spesifik hedef nöron ve yerel ağın test sinaptik girdi ince ayrıntılarıyla diseksiyonu izin veren hücre içi ilaç diyaliz gibi sınırlı değildir Özetle, iyontoforez tarafından yayımlanan ilaç olduğunu prosedürler gibi sistemik enjeksiyonlar, optogenetic tekniklerin kullanımı, ya da push-pul olarak nörotransmisyon veya nöromodülasyon, seviyesini işlemek için kullanılanl diyaliz.
Cam pipetler ucu çapı ve kalıcılık ve enjeksiyon akımların büyüklüğü dokusuna spesifik olmayan ilaç sızıntısını önlemek için izlemek için anahtar faktörlerdir. (NA onlarca düzenin) düşük enjeksiyon akımları birbirine yakın nöronların kayıt sağlayan ilacın yayılmasını sınırlamak. Örneğin, Örnek (nöronlar 1-3) halinde kullanılan dört nöron üç 16 mesafeler ve aralarında 800 um ile aynı ray boyunca kaydedildi. Nöron 1 ve 2 arasında 16 mikron, kısa mesafe rağmen nöron 2 açık bir şekilde farklı bir yanıt (Şekil 4) gözlemlenmiştir.
Önerilen domuz geri yapılandırmaya bazı alternatifler, kullanılmıştır. Bunlardan biri yerine ayrı bir elektrot, kayıt için multibarrel pipetler birinin kullanılmasından oluşmaktadır. topluluklarının yapımı, bu durumda daha az karmaşık olsa da, dezavantajları vardır. First, tüm kanallar kayıt ve ilaç iletimi için uygun olmayabilir ucunda aynı açma çapa sahip olacaktır. Ayrıca, domuz-arkaya konfigürasyonda çıkıntı elektrot ucu olasılıkla multibarrel geniş ucu neden olduğu hedef hücreye zarar görmesini engeller. İkinci yaygın alternatif tungsten elektrotlar yerine 15,44 kayıt için tek varil cam pipetler kullanılmasıdır. Cam elektrotlar uzun kayıtları sırasında gerekli boyutlara imalatı, ancak tıkama eğiliminde kolay ya da çok, beynin derinliklerine seyahat ederken bizim deneyim tungsten elektrotlar daha güvenilir kayıtlar sağlar. Ayrıca, tungsten elektrotlar kullanarak bir nöral izleyici enjeksiyonu 45 kullanıldığı zaman gerekli olan diğer ayrıntılı histolojik prosedürlerden uzak, kayıt siteleri bulmak için elektrolitik lezyonu üretmek mümkündür. multibarrel cam pipetler kullanılması kaydı çok yakın çoklu agonistleri ve / veya antagonistleri tahliyesine izinduyusal işleme nörotransmitter sistemleri arasındaki etkileşim çalışmasında altında olduğunda çok büyük bir avantajdır site.
domuz geri elektrotların üretimi için mevcut protokol açıklanan prosedürler mümkün deney ve sistematik bir ilgi henüz özelleştirilmiş bir biçimde hedef alan özellikleri özel ihtiyaçlarına göre kayıt elektrotları üretmek için yapmak. bunlar kolaylıkla temin edilebilir Ek olarak, headpost tespit malzemeleri, geleneksel diş hekimliği kullanılır. Böylece, protokol kritik adımlar hayvan alışkanlık ve iyi izole nöronların ve istikrarlı elektrofizyolojik kayıtlar katkıda bulunan ana faktörlerdir tungsten elektrotlar, gravür vardır. Genel olarak, bu teknik, bir araç Uyanık, tek veya çok-birimli nöronal aktivite birden nöroaktif maddelere rolünü araştırmak için, nispeten basit, ekonomik ve çok güvenilir, başölçülü fareler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
MINECO tarafından finanse edildi Bu proje BFU201343608-P ve PSI2013-49348-EXP ve ARP MSM ve MRC çekirdek fonlarına JCYL hibe SA343U14 verir. YAA bir CONACyT (216106) ve Eylül dostluk düzenledi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tungsten wire | Harvard Apparatus LTD | 33-0099 | 0.005 inches x 3 inches |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus LTD | 30-0053 | Borosilicate standard wall without filament, 1.5 mm OD, 0.86 mm ID, 100 mm long |
| Multibarrel glass capillaries | World Precision Instruments | 5B120F-4 | 5-barrel capillary, 4 inches long, 1.2 mm OD, with filament |
| Diaplus | DiaDent | 2001-2101 | Light-curing adhesive, used to attach the tungsten electrode to the glas multibarrel pipette |
| G-Bond | GC Corporation | 2277 | Light-curing adhesive, used to attach the headpost to the animal's skull |
| Charisma | Heraeus Kulzer | 66000087 | Light-curing composite, used to reinforce the bond of the headpost with the skull |
| Araldit Cristal | Ceys | 2-component expoxy, used to further secure the attachment of the tungsten electrode to the glass multibarrel pipette | |
| Heating blanket | Cibertec | RTC1 | |
| Stereotactic frame | Narishige | SR-6N | Modified for mice |
| Microiontophoretic device | Harvard Apparatus LTD | Neurophore BH-2 | Including IP-2 iontophoresis pumps (one for each drug delivery channel) and a balance module |
| Multibarrel glass pipette puller | Narishige | Model PE-21 | |
| LED lamp | Technoflux | CV-215 | 5 W, 430-485 nm |
| MicroFil | World Precision Instruments | MF34G-5 | Flexible plastic needle, 34 AWG |
| Imalgene | Merial | Ketamine, 100 mg/mL | |
| Rompun | Bayer | Xylazine, 20 mg/mL | |
| Gabazine / SR-95531 | Sigma | S106 | Prepare ~ 1000µl of 20 mM gabazine in distilled water and adjust the pH to 4 |
References
- Harris, K. D., Thiele, A.
- Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Effects and mechanisms of wakefulness on local cortical networks. Neuron. 69 (6), 1061-1068 (2011).
- Sellers, K. K., Bennett, D. V., Hutt, A., Williams, J. H., Frohlich, F. Awake vs. anesthetized: layer-specific sensory processing in visual cortex and functional connectivity between cortical areas. J Neurophysiol. 113 (10), 3798-3815 (2015).
- Haider, B., Hausser, M., Carandini, M. Inhibition dominates sensory responses in the awake cortex. Nature. 493 (7430), 97-100 (2013).
- Rudolph, M., Pospischil, M., Timofeev, I., Destexhe, A. Inhibition determines membrane potential dynamics and controls action potential generation in awake and sleeping cat cortex. J Neurosci. 27 (20), 5280-5290 (2007).
- Buran, B. N., von Trapp, G., Sanes, D. H. Behaviorally gated reduction of spontaneous discharge can improve detection thresholds in auditory cortex. J Neurosci. 34 (11), 4076-4081 (2014).
- Duque, D., Malmierca, M. S., Caspary, D. M. Modulation of stimulus-specific adaptation by GABA(A) receptor activation or blockade in the medial geniculate body of the anaesthetized rat. J Physiol. 592, (Pt 4) 729-743 (2014).
- Stone, T. W. Microiontophoresis and Pressure Ejection. , Wiley. (1985).
- Lalley, P. M. Modern techniques in neuroscience research). Windhorst, U., Johansson, H. , Springer. 193-212 (1999).
- Foeller, E., Celikel, T., Feldman, D. E. Inhibitory sharpening of receptive fields contributes to whisker map plasticity in rat somatosensory cortex. J Neurophysiol. 94 (6), 4387-4400 (2005).
- Foeller, E., Vater, M., Kossl, M. Laminar analysis of inhibition in the gerbil primary auditory cortex. J Assoc Res Otolaryngol. 2 (3), 279-296 (2001).
- Kurt, S., Crook, J. M., Ohl, F. W., Scheich, H., Schulze, H. Differential effects of iontophoretic in vivo application of the GABA(A)-antagonists bicuculline and gabazine in sensory cortex. Hear Res. 212 (1-2), 224-235 (2006).
- Sivaramakrishnan, S., et al. GABA(A) synapses shape neuronal responses to sound intensity in the inferior colliculus. J Neurosci. 24 (21), 5031-5043 (2004).
- Havey, D. C., Caspary, D. M. A simple technique for constructing 'piggy-back' multibarrel microelectrodes. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 48 (2), 249-251 (1980).
- Dondzillo, A., Thornton, J. L., Tollin, D. J., Klug, A. Manufacturing and using piggy-back multibarrel electrodes for in vivo pharmacological manipulations of neural responses. J Vis Exp. (71), e4358 (2013).
- Perez-Gonzalez, D., Hernandez, O., Covey, E., Malmierca, M. S. GABA(A)-Mediated Inhibition Modulates Stimulus-Specific Adaptation in the Inferior Colliculus. PLoS ONE. 7 (3), e34297 (2012).
- Bullock, D. C., Palmer, A. R., Rees, A. Compact and easy-to-use tungsten-in-glass microelectrode manufacturing workstation. Med Biol Eng Comput. 26 (6), 669-672 (1988).
- Sugiyama, K., Dong, W. K., Chudler, E. H. A simplified method for manufacturing glass-insulated metal microelectrodes. J Neurosci Methods. 53 (1), 73-80 (1994).
- Ulanovsky, N., Las, L., Nelken, I. Processing of low-probability sounds by cortical neurons. Nat Neurosci. 6 (4), 391-398 (2003).
- Escera, C., Malmierca, M. S. The auditory novelty system: An attempt to integrate human and animal research. Psychophysiology. 51 (2), 111-123 (2014).
- Malmierca, M. S., Sanchez-Vives, M. V., Escera, C., Bendixen, A. Neuronal adaptation, novelty detection and regularity encoding in audition. Front Syst Neurosci. 8, 111 (2014).
- Malmierca, M. S., Cristaudo, S., Perez-Gonzalez, D., Covey, E. Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the anesthetized rat. J Neurosci. 29 (17), 5483-5493 (2009).
- Antunes, F. M., Nelken, I., Covey, E., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation in the auditory thalamus of the anesthetized rat. PLoS ONE. 5 (11), 14071 (2010).
- von der Behrens, W., Bauerle, P., Kossl, M., Gaese, B. H. Correlating stimulus-specific adaptation of cortical neurons and local field potentials in the awake rat. J Neurosci. 29 (44), 13837-13849 (2009).
- Perez-Gonzalez, D., Malmierca, M. S. Variability of the time course of stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus. Front Neural Circuits. 6, 107 (2012).
- Duque, D., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse: anesthesia and spontaneous activity effects. Brain Struct Funct. , (2014).
- Merrill, E. G., Ainsworth, A.
- Ainsworth, A., Dostrovsky, J. O., Merrill, E. G., Millar, J. An improved method for insulating tungsten micro-electrodes with glass [proceedings]. J Physiol. 269 (1), 4-5 (1977).
- Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice. J Neurosci Methods. 178 (1), 75-79 (2009).
- Portfors, C. V., Roberts, P. D., Jonson, K. Over-representation of species-specific vocalizations in the awake mouse inferior colliculus. Neuroscience. 162 (2), 486-500 (2009).
- Portfors, C. V., Mayko, Z. M., Jonson, K., Cha, G. F., Roberts, P. D. Spatial organization of receptive fields in the auditory midbrain of awake mouse. Neuroscience. 193, 429-439 (2011).
- Muniak, M. A., Mayko, Z. M., Ryugo, D. K., Portfors, C. V. Preparation of an awake mouse for recording neural responses and injecting tracers. J Vis Exp. (64), (2012).
- Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nat Protoc. 1 (2), 936-946 (2006).
- Malmierca, M. S., et al. A discontinuous tonotopic organization in the inferior colliculus of the rat. J Neurosci. 28 (18), 4767-4776 (2008).
- Izquierdo, M. A., Gutierrez-Conde, P. M., Merchan, M. A., Malmierca, M. S. Non-plastic reorganization of frequency coding in the inferior colliculus of the rat following noise-induced hearing loss. Neuroscience. 154 (1), 355-369 (2008).
- Palmer, A. R., Shackleton, T. M., Sumner, C. J., Zobay, O., Rees, A. Classification of frequency response areas in the inferior colliculus reveals continua not discrete classes. J Physiol. 591 (16), 4003-4025 (2013).
- Ayala, Y. A., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation and deviance detection in the inferior colliculus. Front Neural Circuits. 6, 89 (2013).
- Duque, D., Perez-Gonzalez, D., Ayala, Y. A., Palmer, A. R., Malmierca, M. S. Topographic distribution, frequency, and intensity dependence of stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the rat. J Neurosci. 32 (49), 17762-17774 (2012).
- Ayala, Y. A., Perez-Gonzalez, D., Duque, D., Nelken, I., Malmierca, M. S. Frequency discrimination and stimulus deviance in the inferior colliculus and cochlear nucleus. Front Neural Circuits. 6, 119 (2013).
- Perkins, M. N., Stone, T. W. In vivo release of [3H]-purines by quinolinic acid and related compounds. Br J Pharmacol. 80 (2), 263-267 (1983).
- Lalley, P. M. Modern Techniques in Neuroscience Research. Windhorst, U., Johansson, H. , Springer. Berlin Heiderlberg. Ch. 7 193-212 (1999).
- Candy, J. M., Boakes, R. J., Key, B. J., Worton, E. Correlation of the release of amines and antagonists with their effects. Neuropharmacology. 13 (6), 423-430 (1974).
- Martins, A. R., Froemke, R. C. Coordinated forms of noradrenergic plasticity in the locus coeruleus and primary auditory cortex. Nat Neurosci. , (2015).
- LeBeau, F. E., Rees, A., Malmierca, M. S. Contribution of GABA- and glycine-mediated inhibition to the monaural temporal response properties of neurons in the inferior colliculus. Journal of Neurophysiology. 75 (2), 902-919 (1996).
- Ayala, Y. A., Malmierca, M. S. Cholinergic modulation of stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus. The Journal of Neuroscience. 35 (35), 12261-12272 (2015).
