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Immunology and Infection

की इंट्रा-सांस की नली प्रशासन Published: March 2, 2016 doi: 10.3791/53964
Automatic Translation
1, 1, 1
1Baylor Institute for Immunology Research, Baylor Research Institute

Abstract

यहाँ, हम कुशलतापूर्वक एक विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन है और सीधे हेमोफिलस इन्फ्लुएंजा देने चूहों के निचले इलाकों में सांस। हम एच तैयार करने के लिए प्रक्रिया का प्रदर्शन इन्फ्लुएंजा inoculum, एच के इंट्रा-सांस की नली टपकाना फेफड़ों में इन्फ्लुएंजा, ब्रांको-वायुकोशीय पानी से धोना तरल पदार्थ (BALF), BALF में प्रतिरक्षा कोशिकाओं का विश्लेषण, और आरएनए अलगाव अंतर जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए का संग्रह। यह प्रक्रिया किसी भी बैक्टीरिया, वायरस या कवक को फेफड़ों की सूजन की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रत्यक्ष सांस की नली टपकाना ज्यादातर intranasal या एयरोसोल साँस लेना प्रक्रियाओं से अधिक पसंद है क्योंकि यह अधिक कुशलता से कम अस्पष्टता के साथ निचले श्वसन तंत्र में बैक्टीरियल inoculum बचाता है।

Introduction

सूजन संक्रामक एजेंटों के खिलाफ रक्षा की एक मौलिक प्रतिरक्षा तंत्र है। यह रोगज़नक़ उन्मूलन और क्षतिग्रस्त ऊतकों की मरम्मत को बढ़ावा देता है। यह भी एक सामान्य स्वस्थ राज्य के लिए 1 वसूली की सुविधा। हालांकि, dysregulated सूजन अक्सर पुराने भड़काऊ रोगों 2 की ओर जाता है। Airway सूजन क्रोनिक प्रतिरोधी फेफड़े के रोग (सीओपीडी), अस्थमा और फेफड़े फाइब्रोसिस 3 के रूप में अलग अलग फेफड़े के रोगों के लिए एक प्रारंभिक ट्रिगर है।

गैर typeable (unencapsulated) हेमोफिलस इन्फ्लुएंजा (NTHi) पुरानी ऊपरी और निचले फेफड़ों भड़काऊ रोगों 4,5 के साथ जुड़ा हुआ है। यह क्रोनिक प्रतिरोधी फेफड़े के रोग 4,6,7 के साथ बच्चों और वयस्कों के निचले वायुमार्ग से पृथक प्रमुख प्रजातियों है। NTHi संक्रमण के बाद भड़काऊ प्रतिक्रिया (जैसे TNF और आईएल 1β के रूप में) proinflammatory साइटोकिन्स के अपरेगुलेशन के द्वारा होती है, और यह ख मध्यस्थता हैY माइटोजन सक्रिय प्रोटीन काइनेज (MAPK) और परमाणु कारक-κB (एनएफ-κB) टोल की तरह रिसेप्टर्स के माध्यम से (TLRs) 8।

माउस मॉडल क्योंकि अलग अलग जीन की कमी लाइनों की उपलब्धता के फेफड़ों की सूजन की बीमारी अंतर्निहित विकृति का विश्लेषण करने के लिए बहुत उपयोगी उपकरण हैं। कई तरीकों को लाइव / तनु बैक्टीरिया और intranasal टपकाना और aerosolized साँस लेना 9,10 सहित बैक्टीरियल उत्पादों, टीका लगाना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। यहाँ, हम इंट्रा-सांस की नली टपकाना प्रदर्शित करता है। हालांकि कम अक्सर इस्तेमाल किया, इस दृष्टिकोण और अधिक कुशल और अत्यधिक कम श्वसन तंत्र के लिए inoculum के प्रत्यक्ष वितरण की वजह से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है।

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Protocol

सभी प्रयोगों संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) Baylor अनुसंधान संस्थान के दिशा निर्देशों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया।

1. संवर्धन गैर typeable हेमोफिलस इन्फ्लुएंजा (NTHi) और Inoculum तैयारी

  1. एक चॉकलेट अगर प्लेट पर प्लेट NTHi और प्लेट 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में रात भर एक humidified सीओ 2 इनक्यूबेटर में उल्टा रखने के लिए। अगले दिन, संस्कृति मस्तिष्क दिल अर्क शोरबा में बैक्टीरिया। फिर, एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में शोरबा के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
  2. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 4000 XG पर अपकेंद्रित्र। फिर, सतह पर तैरनेवाला त्यागें और बाँझ 1x पीबीएस के 1 मिलीलीटर में गोली फिर से निलंबित। यह कदम एक बार दोहराएँ।
  3. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में 600 एनएम तरंगदैर्ध्य पर 1x पीबीएस के 900 μl में फिर से निलंबित समाधान के 100 μl स्थानांतरण और पतला संस्कृति के absorbance के उपाय।
  4. व्यवहार्यता और कॉलोनी बनाने इकाई का निर्धारण करते हैंचॉकलेट अगर प्लेटों पर 1:10 धारावाहिक dilutions संवर्धन और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर incubating और 5% सीओ 2 से inoculum के एस (CFUs)।
  5. व्यवहार्यता और CFUs पिछले चरण से निर्धारित आधार पर, 20 x 10 6 CFU / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए inoculum समायोजित करें।

2. इंट्रा-सांस की नली (यह) टपकाना

  1. एक 150 मिलीग्राम / एमएल ketamine + 20 मिलीग्राम / मिलीलीटर xylazine समाधान के साथ माउस के 0.1 मिलीग्राम / 10 ग्राम शरीर के वजन के साथ माउस intraperitoneally (आईपी) इंजेक्षन। प्रक्रिया एक प्रकाश स्रोत पशु गर्म रखने के लिए के साथ हुड में किया जाना चाहिए।
  2. माउस के इंटरडिजिटल अंतरिक्ष चुटकी सत्यापित करने के लिए है कि माउस पर्याप्त रूप से anesthetized है।
  3. अपनी पीठ पर माउस रखें। गर्दन के उदर क्षेत्र दाढ़ी और chlorhexidine और 70% एथिल शराब के साथ कीटाणुरहित।
  4. गर्दन चूहा दांत संदंश का उपयोग कर के ऊपरी उदर भाग की त्वचा लिफ्ट। थाइमस के ऊपर एक छोटा सा चीरा (0.5-1.0 सेमी) एक छुरी का उपयोग करऔर ध्यान से पेशी श्वासनली बेनकाब करने के लिए काटना।
    1. एक 27 जी सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग, धीरे-धीरे 0.05 मिलीलीटर हवा, धारा 1 या एक नियंत्रण के रूप में खारा से प्राप्त 0.05 मिलीलीटर NTHi द्वारा पीछा किया, एक और 0.05 मिलीग्राम हवा के द्वारा पीछा इंजेक्षन। पशु लगभग 1 मिनट के लिए खड़ी रखें।
  5. शल्य गोंद के साथ चीरा बंद करें। माउस laterally लेटा हुआ और लगभग 10 मिनट के लिए गर्म रखें।

3. BALF संग्रह

  1. संक्रमण के बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था 24 घंटा से माउस बलिदान।
  2. संरचनात्मक कैंची के साथ माउस के उदर गुहा खोलें और खून करने के उदर महाधमनी काटा। फेफड़ों के उदर भाग को बेनकाब।
  3. श्वासनली बेनकाब और एक 20 गेज कैथेटर के साथ यह intubate। BALF बफर के 0.8 मिलीलीटर (1x पीबीएस, 0.1% डेक्सट्रोज, 10 यू / एमएल हेपरिन) टपकाना और कोमल आकांक्षा से पानी से धोना इकट्ठा। यह प्रक्रिया तीन बार दोहराएँ।
  4. गणना की कुल एक hemocyto का उपयोग कर BALF निलंबन के 100 μl में कोशिकाओं की संख्याTrypan ब्लू धुंधला के साथ 10X बढ़ाई के तहत मीटर।
  5. संशोधित Giemsa धुंधला के लिए स्लाइड तैयार करें। अशेष 100 5 मिनट के लिए 500 XG पर cytospin और सेंट्रीफ्यूज की उचित कुओं में BALF के μl। 10 मिनट के लिए स्लाइड सूखी और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार संशोधित Giemsa दाग का उपयोग कोशिकाओं दाग।
  6. ऐसे पुष्पन सक्रिय सेल छँटाई (FACS), confocal माइक्रोस्कोपी, जीन अभिव्यक्ति और पश्चिमी धब्बा 11-13 के रूप में बाद के विश्लेषण के लिए शेष कोशिकाओं का उपयोग करें।

4. हिस्तोपैथोलोजी तैयारी

  1. ऊतकविकृतिविज्ञानी विश्लेषण के लिए, NTHi के साथ चूहों 2.4 चरण में वर्णित के रूप में संक्रमित। संक्रमण के 24 घंटे के बाद, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से जानवरों के बलिदान। संरचनात्मक कैंची फेफड़े और श्वासनली के रूप में पहले उल्लेख किया बेनकाब करने के साथ वक्ष गुहा खोलने कट। फिर, श्वासनली में 20 गेज कैथेटर डालने।
  2. 2% agarose गर्म 4% formalin में तैयार समाधान के साथ फेफड़ों भरें। एक बारफेफड़ों पूरी तरह से फेफड़ों के शीर्ष पर फुलाया जाता है, जगह बर्फ agarose समाधान जमना।
  3. फिर, ध्यान से वक्ष प्लग हटा दें और 1x पीबीएस में 4% formalin के एक 50 मिलीलीटर समाधान में डाल दिया जब तक यह hematoxylin और eosin (एच एंड ई) वर्गों के लिए कार्रवाई की है।

5. FACS BALF में कोशिकाओं धुंधला

  1. एक 96 अच्छी तरह से वी के नीचे माइक्रो अनुमापांक थाली में BALF तरल पदार्थ से 1 एक्स 10 5 कोशिकाओं रखो।
  2. कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 4000 XG पर 300 स्पिन ठंड 1x पीबीएस के μl और साथ धोएं।
  3. (1: 1,000 कमजोर पड़ने) 100 μl 1x पीबीएस में सेल दाग समाधान के साथ कोशिकाओं दाग और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखें।
  4. कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 4000 XG पर ठंड 1x पीबीएस के 300 μl के साथ धोएं।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 100 पतला एफसी-ब्लॉक: FACS धो बफर [धो बफर (1x पीबीएस, 2% FBS, 1 मिमी EDTA, 0.1% सोडियम azide] 1 से युक्त के 100 μl में कोशिकाओं रखें।
  6. 3 मिनट के लिए और समर्थन त्यागने 4000 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओंernatant।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए FACS धो बफर में: (100 कमजोर पड़ने 1) 100 μl सतह धुंधला कॉकटेल के साथ दाग कोशिकाओं।
  8. कोशिकाओं में तीन बार 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 4000 XG पर FACS धो बफर के 300 μl के साथ धोएं।
  9. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde के 100 μl में कोशिकाओं को ठीक करें।
  10. कोशिकाओं में दो बार 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 400 XG पर पीबीएस 1x 300 μl से धोएं और FACS धो बफर के 300 μl में फिर से निलंबित।
  11. एकल रंग धुंधला मोती प्रवाह cytometry का उपयोग नियंत्रण करें।
    1. मोतियों की एक बूंद 96 वी-नीचे microliter थाली में जोड़ें और पीबीएस 1x 200 μl से धो लें।
    2. पीबीएस और मोती 1x 100 μl को धुंधला एंटीबॉडी के 1 μl जोड़ें और 5 मिनट के लिए कमरे में अस्थायी पर सेते हैं।
    3. मोती पीबीएस 1x 300 μl के साथ दो बार धोएं।
  12. 14 प्रवाह cytometry द्वारा एकल दाग नियंत्रण और कोशिकाओं का विश्लेषण।

6. फेफड़े के ऊतकों के homogenization शाही सेना को अलग करने के लिए

  1. संक्रमण के बाद, फेफड़ों (20-40 मिलीग्राम) का एक छोटा सा टुकड़ा इकट्ठा करने और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर अभिकर्मक शाही सेना में इसे रख लो। फिर, अगले चरण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर दुकान।
  2. आरएनए स्थिरीकरण अभिकर्मक से छुटकारा पाने के लिए ठंड 1x पीबीएस में फेफड़े के ऊतकों को धो लें।
  3. ऊतक एक 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब युक्त lysis बफर (1 मिलीलीटर lysis बफर + 10 μl β-mercaptoethanol) में रखें।
  4. बताया कैंची का उपयोग कर छोटे टुकड़ों में काट लें और ऊतक 20-40 सेकंड के लिए एक ताररहित मोटर गोली मूसल का उपयोग homogenize।
  5. 5 मिनट के लिए बर्फ पर lysate रखें और कदम 7.1 के साथ आगे बढ़ें।

7. फेफड़े से शाही सेना अलगाव

  1. 3 मिनट के लिए 18,000 XG पर lysate अपकेंद्रित्र। pipetting द्वारा तैरनेवाला निकालें और ध्यान से एक नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण।
  2. 70% इथेनॉल के 1 मात्रा lysate में जोड़े। pipetting द्वारा तुरंत मिलाएं और 2-4 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें।
  3. एक स्पिन स्तंभ रखा lysate के 700 μl को हस्तांतरणएक 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में।
  4. 15 सेकंड के लिए 9,600 XG पर अपकेंद्रित्र और प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
  5. 350 μl 15 सेकंड के लिए 9,600 XG पर कड़े धो बफर और सेंट्रीफ्यूज जोड़ें। प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
  6. 80 μl DNase मैं सीधे स्पिन स्तंभ झिल्ली को जोड़ें और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इसे रख लो।
  7. 15 सेकंड के लिए 9,600 XG पर स्पिन स्तंभ और सेंट्रीफ्यूज के लिए 350 μl कड़े धो बफर जोड़ें। प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
  8. 15 सेकंड के लिए 9,600 XG पर 500 μl आरएनए धो बफर और सेंट्रीफ्यूज जोड़ें। प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
  9. 2 मिनट के लिए 9600 XG पर 500 μl आरएनए धो बफर और स्पिन जोड़ें। प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
  10. 1 मिनट के लिए 9600 XG पर एक नया 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब और अपकेंद्रित्र में स्पिन स्तंभ रखें। प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
  11. 30-50 μl RNase मुक्त पानी में 1 मिनट के लिए 9600 XG पर स्पिन स्तंभ और सेंट्रीफ्यूज के लिए सीधे जोड़ें। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर आरएनए।
  12. RNAseq विश्लेषण 14 प्रदर्शन करना।

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Representative Results

इंट्रा-सांस की नली टपकाना BALF (चित्रा 1 ए, बाएं पैनल) खारा के साथ स्थापना की तुलना में ल्यूकोसाइट्स की एक उल्लेखनीय वृद्धि हुई संख्या में हुई। ल्यूकोसाइट्स का अंतर स्पष्ट रूप से वृद्धि हुई गिनती विश्लेषण न्यूट्रोफिल घुसपैठ (चित्रा 1, सही पैनल) से पता चला है। BALF में कोशिकाओं की FACS विश्लेषण आगे न्यूट्रोफिल की संख्या में वृद्धि (चित्रा 1 बी) की पुष्टि की। फेफड़े के ऊतकों के एच ई-दाग वर्गों के histological विश्लेषण airway सूजन (चित्रा 1 सी) में वृद्धि हुई है दिखाया। ये आंकड़े बताते हैं कि सामूहिक रूप से इंट्रा-सांस की नली टपकाना चूहों में airway सूजन लाती है। संकेत दे रास्ते कि एयरवे रोगजनन को विनियमित के अध्ययन के लिए इस दृष्टिकोण के उपयोग का समर्थन करने के लिए, हम चूहों कि E3 यूबीक्यूटिन ligase खुजली के लिए कमी कर रहे हैं प्रयोग किया जाता है। खुजली भड़काऊ सिगनल को विनियमित करने के लिए रास्ते में शामिल किया 15 में जाना जाता है। हम टीकाउम्र और सेक्स से मिलान जंगली प्रकार C57BL / 6 नियंत्रण और खुजली - / - NTHi के साथ चूहों। / - - हम नियंत्रण गुम्मट और खुजली के फेफड़े के ऊतकों से शाही सेना पृथक चूहों और पूरे transcriptome अनुक्रमण प्रदर्शन भड़काऊ जीन है कि विभिन्न व्यक्त कर रहे हैं की पहचान करने के लिए। चित्रा 2 में दिखाया गया है, खुजली की कमी कई जीनों की अभिव्यक्ति अंतर में हुई। यह पता चलता है कि इंट्रा-सांस की नली टपकाना फेफड़ों की सूजन, जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल और संकेत दे रास्ते जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1: NTHi की इंट्रा-सांस की नली टीका चूहों में फेफड़ों की सूजन लाती चूहे NTHi (10 6 CFU / माउस) या खारा नियंत्रण के साथ inoculated थे।। टीका के बाद 24 घंटे, चूहों बलिदान किया गया (ए) BALF एकत्र किया गया था। कुल ल्यूकोसाइट, एककेंद्रकश्वेतकोशिका और न्युट्रोफिल संख्या निर्धारित किया गया है। डेटा प्रस्तुत कर रहे हैंके रूप में ± SEM मतलब है। एन = 4 चूहों / समूह। * खारा इलाज चूहों की तुलना में पी <0.05 इंगित करता है। (बी) BALF में कोशिकाओं विरोधी Gr1 एंटीबॉडी के साथ दाग और FACS द्वारा विश्लेषण किया गया। (सी) एच एंड ई दाग ल्युकोसैट घुसपैठ और सूजन दिखा फेफड़ों वर्गों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: WT और खुजली के फेफड़ों में अंतर जीन अभिव्यक्ति - / - निम्न इंट्रा-सांस की नली NTHi टीका NTHi टीका के बाद 24 घंटे, आरएनए दो गुम्मट के फेफड़ों से पृथक किया गया चूहों (1, 2) और दो ​​खुजली - / -। (1, 2) चूहों। (ए) आरएनए गुणवत्ता एक bioanalyzer का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था। (बी) गर्मी नक्शा दिखा जेड स्कोर (एसडी से दूर के एक उपाय के रूप में व्याख्या कीमाध्य) प्रति दस लाख लॉग गिनती के लिए 2 (लॉग 172 विभिन्न व्यक्त खुजली में Edger का उपयोग कर पहचाना जीन की 2 सीपीएम) - / -। WT चूहों की तुलना में यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

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Discussion

इस के साथ साथ, हम एक जीवाणु फेफड़ों रोगज़नक़ के साथ चूहों के फेफड़ों टीका लगाना लिए एक अनूठा और न्यूनतम इनवेसिव प्रक्रिया का वर्णन है। हम जानते हैं कि इस प्रक्रिया चूहों कि भड़काऊ संकेत दे रास्ते के जीन में कमी कर रहे हैं का उपयोग कर विभिन्न जीनों के समारोह का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्रदर्शित करता है। यह प्रक्रिया भी वायरल और फंगल फेफड़ों में संक्रमण को भड़काऊ प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ऐसे intranasal या एयरोसोल साँस लेना के रूप में अन्य तरीकों पर इस प्रक्रिया के फायदे (1) इस प्रक्रिया में, रोगजनक inoculum सीधे निचले श्वसन तंत्र के लिए डाले है कर रहे हैं; (2) inoculum आकार को नियंत्रित करने की क्षमता; और (3) हैंडलर बैक्टीरियल जोखिम के जोखिम को कम किया।

शल्य चिकित्सा के लिए बैक्टीरिया पैदा श्वासनली का एक्सपोजर एक महत्वपूर्ण कदम है, जहां देखभाल आसपास के ऊतकों, विशेष रूप से रक्त वाहिकाओं को नुकसान हो सकता से बचने के लिए लिया जाना चाहिए।

श्वासनली श में बैक्टीरिया की टपकानाasphyxiation की वजह से चूहों की मृत्यु होने की संभावना से बचने के लिए सावधानी से किया जाना ould। यह सुझाव दिया है कि inoculum (लगभग 50 μl) धीरे-धीरे जारी किया और हवा से पहले और inoculum के बाद इंजेक्शन जा। माउस खड़ी रखते हुए थोड़ी देर के लिए टपकाना के बाद और उन्हें laterally लेटा हुआ रखते हुए तेजी से वसूली की सुविधा। इस प्रक्रिया का बड़ा नुकसान यह है कि समय की एक छोटी अवधि के भीतर कई जोखिम सर्जरी की आवश्यकता के कारण संभव नहीं हो रहा है। एक संभावित मुद्दा यह है कि अगर कैथेटर श्वसनी में भी गहरी रखा गया है, BALF कोशिकाओं की संख्या कम हो जाएगा। इस समस्या से थोड़ा ऊपर की ओर ट्यूब खींच कर हल किया जा सकता है।

चूंकि एयरवे भड़काऊ रोगों की घटनाओं को दुनिया भर में 3,16 बढ़ रही हैं, इन रोगों के pathophysiology समझने प्रधानमंत्री महत्व का है। प्रौद्योगिकियों इस अध्ययन में वर्णित कुंजी नियामक रास्ते की पहचान करने में मदद कर सकता है और विकास की सुविधा सकता हैनए उपचार के तौर तरीकों की।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chocolate agar plate Fisher Scientific CAS50-99-7
Dextrose Anhydrous Themo Scientific R01300
Heparin Hospira,Inc RL-3010
Deft quick solution Sigma GS500-500ML
Syringe needle 20/26G  BD (REF305115/175)
Iml syringe BD REF 309602
Catheter 20GA BD REF 381433
Dissecting Scissors, straight, 10 cm long kentscientific INS600393
Iris Forceps, serrated, 10cm long kentscientific INS650915
Tweezer #5 Stainless steel, 11cm long kentscientific INS600095
10% Formalin Fisher Scientific CAS 67-56-1
Agarose peqlab 35-1020
5ml polystyrene round-bottom tubes BD REF 352058
1.5 ml Microcentrifuge tubes Light Labs A-7001-R
Reasy Mini  kit  Qiagen 74104
Pellet pestile motor (Tissue homoginizer) Sigma Z359971-1EA
96 well microtiter plates V bottom Thermo 2605
1X PBS Gibco 10010-023
OneComp eBeads eBioscience 01-1111-42
CD45.2-APC eBioscience 17-0454-81 Working dilution 1:100
Ly-6G-eFlor 450 eBioscience 48-5931-82 Working dilution 1:100
BSA HyClone SH30574.03
RBC Lysis Buffer (10X) Biolegend 420301
Live/Dead fixable aqua dead cell stain kit Invitrogen L-34957
EDTA (0.5M) lifetechnologies 15575-020
CD16/CD32 FcBlock BD 553142
Facs tubes polystyrene round bottom tube BD 352052
Formaldehyde Polyscience 4018

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 109 सूजन, इंट्रा-सांस की नली श्वसन रोगज़नक़ जीन अभिव्यक्ति सेल संकेतन
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Venuprasad, K., Theivanthiran, B., Cantarel, B. Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation. J. Vis. Exp. (109), e53964, doi:10.3791/53964 (2016).

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