Summary
Målet med detta protokoll är att icke-invasivt bedöma hjärt strukturella och funktionella förändringar i en musmodell av hjärtsjukdomar som skapats av tvärgående aorta sammandragning, med hjälp av B- och M-mode ekokardiografi och färg / puls våg Doppler avbildning.
Protocol
Protokollet följer riktlinjerna i Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Washington.
1. kirurgiska ingrepp och Förberedelse för Imaging
- Ämne C57BL / 6-möss till TAC eller sham operation som tidigare beskrivits 10.
- En vecka efter TAC eller skenkirurgi, söva musen i induktionskammare med 2% isofluran blandas med ett L / min O 2. Bekräfta korrekt anesthetization av okänslighet till tå eller svans nypa. Använd veterinär salva på ögonen för att förhindra torrhet under narkos. Ta bort brösthår genom att tillämpa hårborttagningskräm. Desinficera mushud med 70% etanol.
- Fäst musen till ett djur-hanteringsplattform i ryggläge. För att upprätthålla en jämn nivå av anestesi, använder en noskon för att leverera 0,5-1% isofluran blandat med ett L / min O2.
- Applicera elektrodgel till tassarna på musen och tejpa dem till elektrodplattan.
- Sätt en rektal sond för att övervaka kroppstemperaturen. Hålla kroppstemperaturen vid 37 ° C via en värmedyna eller lampa.
- Applicera ett skikt av förvärmda ultraljudsgel till musen bröstet, i huvudsak det område som ligger över hjärtat. Obs: ta ultraljud gel och torka musen med steril gasbinda efter avbildningsproceduren.
2. I aortabågen View, Använd B-mode och Doppler Imaging att utvärdera tvärgående Aorta Förträngning
- Använd inställningen B-läge för att få aortabågen vyn för att visualisera aorta, stora arteriella grenarna, och förträngningen platsen.
- Luta vänster sida av plattformen så långt som möjligt att rotera musen till vänster trycksår position. Håll ultraljudgivaren genom stand i vertikalt läge och placera den på bröstet längs den högra parasternal linje med skåran pekande mot hakan på musen. Obs: inte komprimera musen bröstkorgen när sänka transdUCER; minimal mängd tryck erfordras.
- Luta upp givaren i nivå med skulderbladet och rotera något medurs tills aortabågen kommer i sikte. Observera den tvärgående aorta sammandragning sida, som är belägen mellan förgreningen av Innominate artär (IA) och vänstra gemensamma halsartären (LCCA) (Figur 1).
Obs: Ingen sammandragning detekteras i skenopererade mus.
- Klicka på "färgdoppler" -knappen på arbetsstationen för att byta till färgdoppler läge för att övervaka riktning och hastighet av blodflödet över strypningen plats. Förvärva och lagra bilder genom att klicka på "cine store" -knappen.
- Klicka på knappen "PW Doppler" för att växla till puls våg Doppler läge och plats provvolym (den streckade markörboxen) omedelbart distalt förträngningen platsen för att söka efter den stenotiska jet med högsta hastighet, klicka sedan på "PW Doppler" -knappen för erhållande av vågformer för aorta flow och mät topphastigheten (Figur 2).
- Beräkna tryckgradient över strypningen site användning av den modifierade Bernoullis ekvation: tryckgradient = 4 x V max 2. inkluderar endast möss med en tryckgradient som sträcker sig från 40 till 80 mmHg för vidare analys.
3. I parasternal Long Axis View, Använd B-mode och M-mode scanning för att bedöma Hjärtat Mått och Kontraktilitet
- Med musen liggande i ryggläge på plattformen, håll givaren i vertikalt sätt med skåran som pekar på musens huvud. Sänk givaren på bröstkorgen parallellt till vänster parasternal linje och rotera 30 ° moturs.
- Använd B-mode scanning för att erhålla en fullständig längdaxel "sagittal" av hjärtat. Justera vinkeln på givaren och fokusera djup att visualisera vänstra kammaren, den intraventrikulära septal vägg, och en liten del av den högra ventrikulära väggen. Save bilderna för senare mätningar av hjärtväggtjocklek och kammardimension. Använda "hjärt paket", väljer parametrar såsom IVS eller LVAW, LVID och LVPW, och sedan klicka på bilden för att rita motsvarande linjer för varje parameter för att erhålla mätningarna.
- Observera hjärtväggen rörelsemönster och kontrollera eventuella rörelse avvikelser, inklusive akinesi, hypokinesi, och omvandlare.
Notera: akinesi och hypokinesi beteckna fullständig och partiell förlust av rörelse av hjärtväggen, respektive. Omvandlare betecknar oregelbunden, okoordinerade hjärtväggen rörelse. - Växla till M-mode, plats M-mode markören vinkelrätt mot LV väggarna i nivå med papillärmuskeln, och få bilder för senare mätning av hjärt dimensioner och fraktionerad förkortning (Figur 3).
4. I parasternal kort axel View, Använd B-mode och M-mode Imaging att bedöma hjärt morfologi och funktion
- FrOm den parasternal längdaxel uppfattning erhålla parasternal kort axel uppfattning genom att vrida givaren 90 ° medurs. Justera givaren för att ge en horisontell tvärsnittsvy "tvärgående" vy av hjärtat i B-mode, med båda papillarmusklerna klart synliga och befinner sig till höger (den 2 och 4:00 position).
- Växla till M-mode och placera M-mode axeln vid mittnivån hos den vänstra ventrikeln. Förvärva och lagra bilder för senare mätningar av hjärtväggtjocklek, kammardimension, och fraktionsförkortning (Figur 4). Använda "hjärt paket", väljer parametrar i SAX (kort axel) inklusive IVS eller LVAW, LVID och LVPW och klicka på bilden rita motsvarande linjer för varje parameter för att erhålla mätningarna.
Obs: Mätningar erhållna här bör nära korrelerar med de som erhölls i parasternal längdaxel view (Figur 5).
5. I den apikala fyra kammar View, AnvändDoppler Imaging att bedöma systoliskt och diastoliskt Funktion
- Erhålla den apikala fyra-kammar syfte att visualisera både vänster och höger ventriklar med atrierna längst ner på skärmen. I B-läge, från den korta axeln uppfattning luta övre vänstra hörnet av plattformen till vinkeln musens huvud och orientera givaren mot höger axel med musen. Detta är i huvudsak för att uppnå en "frontal" bild av hjärtat tittar upp mot toppen.
- Visualisera mitralisklaffen i B-mode, och växla till färgdoppler läge, placera provvolymen (den streckade markörboxen) vid spetsen av mitralisklaffen.
- Växla till PW Doppler läge att bedöma flödesmönster över mitralisklaffen. Rikta in dopplersonden markören parallellt med riktningen för mitral blodflödet. Använd en sond vinkel mindre än 20 ° för att bestämma topphastigheten (figur 6).
- Spara bilderna för senare mätningar. Använd "hjärt paket" och välj "MV flöde. "Klicka på varje parameter och rita motsvarande linjer för att erhålla mätningarna tillgängliga mätningar inkluderar:. Topp E-hastighet (tidigt fyllning med aktiv kammar avkoppling), topp en hastighet (sen fylla med förmakssammandragning), mitral Isovolumetrisk avkoppling och kontraktion gånger (IVRT och IVCT respektive), och utstötningstiden (ET).
- Beräkna myokardial prestanda index (MPI) av MPI = (IVCT + IVRT) / ET.
6. Post-procedur Behandling av djur
- Ge smärtlindring och / eller steril saltlösning intraperitonealt till kirurgiska djur vid behov.
- Göra det möjligt för djuret att återhämta på en värmedyna i framstupa läge. Lämna inte ett djur utan tillsyn tills den har återfått tillräcklig medvetenhet för att upprätthålla sternala VILA. Skicka inte tillbaka ett djur som har genomgått det förfarande som sällskap med andra djur tills återhämtat sig helt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar B-mode bilder av aortabågen vy av mushjärta kastades simulerad (Figur 1A) eller TAC kirurgi (Figur 1B). Aortabågen, Innominate artär, vänstra gemensamma halsartären, och vänster arteria subclavia visas. Observera att aorta sammandragning syns tydligt i TAC men inte hyckla hjärta. Color Doppler bilder från aorta vy visas i figur 2A. Vågformerna för aortaflöde över strypningen platsen fångades av PW Doppler imaging (Figur 2B). Framgångsrik TAC kommer att leda till en signifikant ökad flödeshastighet nedströms förträngningen stället (typiskt ~ 4 m / sek i TAC-möss). Tryckgradienten över strypningen har beräknats baserat på toppflödeshastighet, enligt den modifierade Bernoullis ekvation (figur 2C).
Figur 3 (figur 3A) eller TAC hjärta (figur 3B). Det övre fältet visar de B-mode bilder av vänster kammare, kammarskiljeväggen, och en del av den högra ventrikeln från bluff eller TAC möss. Den nedre panelen visar M-mode kurvor av flera hjärtcykler från bluff eller TAC möss. Mätningarna av hjärt dimensioner visas, inklusive den vänstra kammar främre väggtjocklek (LVAW), vänsterkammar inre diameter (LVID), vänsterkammar bakre väggtjocklek (LVPW) i diastole och systole. Obs signifikant ökad väggtjocklek i mus hjärta utsatt för TAC jämfört med skenkirurgi.
Figur 4 visar bilder av den parasternala korta axeln vy av sham (Figur 4A) eller TAC hjärta (figur 4B). Den övre delen av varje panel visar den M-mode-axeln (den dotted linje) placeras i mitten av den vänstra kammaren. Den nedre delen av varje panel är den M-mode spårning med linjer som indikerar hjärt dimensioner som beskrivits ovan. Som en markör för hypertrofi, ventrikulära och septal väggtjocklek kan bestämmas noggrant. Möss som utsätts för TAC visade ökad väggtjocklek som bedömts av LVAWd och LVPWD, kammar dilatation som bedömts av LVISd och LVISs, minskad kontraktilitet enligt bedömning av LVFS och LVEF, och ökade LV massa (Figur 5).
Figur 6 visar B-mode apikala fyra-kammar vy (figur 6A, B) och PW Doppler bilder av transmitral flödesmönster (Figur 6C, D). Mätningar av topp E och en hastighet, IVCT, IVRT och ET visas. E / A-förhållande och MPI beräknas (Figur 6E - I). En frisk mus hjärta har en E / A-förhållandet ≥1 och MPI värde ≤0.5. I patologiska tillstånd med diaStolic eller systolisk hjärtdysfunktion, såsom i möss som utsatts för TAC, en minskad E / A-förhållande och / eller en ökad MPI värde typiskt observeras.
Figur 1. B-mode Bild av aortabågen Vy av Mouse Heart Utsatta för Sham Surgery (A) eller TAC (B). Större aorta grenar inklusive Innominate artär (IA), vänstra gemensamma halsartären (LCCA), och vänster arteria subclavia (LSA) visas. Notera att tvärgående aorta sammandragning (indikeras av den vita pilen) kan visualiseras i TAC men inte sken hjärta. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Färg / PW Doppler avbildning av TransveRSE Aorta Blood Fow från aortabågen View. färg (A) och PW (B) Doppler bilder bluff och TAC hjärtan visas. Topp aorta hastighet erhållen från PW Doppler imaging används för att beräkna tryckgradient enligt den modifierade Bernoullis ekvation (C). Dessa data bekräftar en framgångsrik TAC operation med tryckgradienten av ~ 70 mmHg. * P <0,05 vs. Bluff. Data uttrycks som medelvärde ± sem n = 15 för Sham och n = 13 för TAC. T-test användes för att bestämma statistisk signifikans. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. parasternal Long Axis (Plax) Vy över Mouse Heart utsattes för Sham kirurgi (A) eller TAC (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra .
Figur 4. parasternal kort axel (PSAX) Vy över Mouse Heart utsattes för Sham kirurgi (A) eller TAC (B). M-mode bilderna anger placeringen av provvolymen (prickade gula linjen i den övre panelen) och mätning av hjärt dimensioner i diastole och systole (blå linjer i det undre fältet). Asteriskerna anger papillarmuskler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. ekokardiografisk Bedömning av hjärt morfologiska och funktionella förändringar efter TAC. M-mode scanning i kort axel vy utfördes såsom i Figur 4. (A) LVAWd, vänsterkammar främre väggtjocklek i diastole. (B) LVPWD, vänsterkammar bakre väggtjocklek i diastole. (C) LVIDd, vänsterkammar inre diameter i diastole. (D) LVIDs, vänsterkammar inre diameter i systole. (E) LVFS, vänsterkammar fraktionerad förkortning. LVFS (%) = (LVIDd-LVIDs) / LVIDd x100%. (F) LVEF, vänsterkammarens ejektionsfraktion. LVEF (%) = (LVEDV-LVESV) / LVEDV x100%. LVEDV och LVESV beteckna vänsterkammar slutdiastoliska och slutslagvolym, respektive. LV volym och ejektionsfraktion är exakt bedömas av Simpso n: s metod. LV volym beräknas genom att montera ett flertal skivor i ventrikeln: Simpson volym = [område (1) + området (2) + ... + område (n)] x längd. Simpson området och längd erhålls genom att spåra den endokardiala gränsen av LV i den långa axeln och korta axeln vy. (G) LV (vänster kammar) massa. LV massa (mg) = 1,05 x [(LVIDd + LVPWD + IVSd) 3 - (LVIDd) 3]. Faktorn 1,05 representerar den specifika densiteten hos hjärtmuskeln. (H) HR, hjärtfrekvens. * P <0,05 vs. Bluff. Antalet möss som analyserats visas i stolpar i varje panel. Data uttrycks som medelvärde ± sem t-test användes för att bestämma statistisk signifikans. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
p_upload / 54101 / 54101fig6.jpg "/>
Figur 6. Bedömning av Transmitral blodflödet genom att Doppler Imaging. (A och B) B-mode apikala fyra-kammar vy av sham (A) eller TAC (B) hjärta. LV, vänster ventrikel; RV, höger ventrikel; MV, mitralisklaffen; TV, trikuspidalklaffen; LA, vänster förmak; RA, höger förmak. (C och D) PW Doppler vågform av trans mitral blodflöde i sham (C) eller TAC (D) hjärta. Relevanta mätningar visas. (E) E / A, peak E och A hastighetsförhållandet. (F) IVCT, Isovolumetrisk kontraktion tid. (G) IVRT, Isovolumetrisk relaxationstiden. (H) ET, utstötning tid. (I) MPI, hjärtinfarkt prestandaindex. * P <0,05 vs. Bluff. Antalet möss som analyserats visas i stolpar i varje panel. Data uttrycks som medelvärde77; sem t-test användes för att bestämma statistisk signifikans. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ekokardiografi har i stor utsträckning använts för att bedöma hjärtfunktionen i gnagarmodeller av hjärtsjukdom 2,6. Jämfört med invasiva eller terminal metoder såsom tryck volym loop mätning 11 och ex vivo arbets hjärta 12, ger ekokardiografi ett kraftfullt, icke-invasiv verktyg för att bedöma pågående hjärt strukturella och funktionella förändringar i levande djur. Att få tillförlitliga data är det viktigt att upprätthålla kroppstemperatur och hjärtfrekvens inom fysiologiska området 13 genom försiktig justering av värmningsapparaten och anestesinivå. Alla bilder bör fångas och analyseras konsekvent i enlighet med de standardiserade avbildningsförfaranden, för att underlätta jämförelsen mellan möss av annan stam eller genotyp.
TAC är vanligen används för att inducera hjärthypertrofi och hjärtsvikt hos möss 1. Icke-invasiv mätning av tryckgradienten över strypningen webbplats genom Doppleravbildning representerar en tillförlitlig bedömning av graden av övertryck i möss. Framgångsrik TAC producerar typiskt en tryckgradient ≥40 mmHg. Endast möss som utsätts för liknande grad av övertryck bör ingå för ytterligare analys, medan möss med en tryckgradient för lågt eller för högt bör uteslutas. Efter TAC möss förväntas utveckla hjärthypertrofi inom 1-2 veckor, och hjärtdilateringen efter 4 veckor, beroende på graden av övertryck och den genetiska bakgrunden hos möss som testades. tillförlitligt kan bedömas dynamiska hjärt ombyggnad och funktionella förändringar efter TAC ekokardiografisk avbildning som beskrivits ovan.
I motsats till sin ofta användning hos människor 14, färg / PW Doppler har bara varit nyligen tillgänglig i gnagare ultraljud 9. Även här vi beskrev tillämpningar av Doppler imaging att mäta tryckgradient samt systoliskt och diastoliskt prestanda. Mätaning av mitral och tricuspid blodflödet riktning och hastighet (dvs., E / A-förhållande, IVRT, IVCT, ET, och MPI) ger viktig information om hjärtfunktion. Således ekokardiografiska avbildning är ett viktigt verktyg för att studera hjärt fysiologi och patofysiologi i små djur.
Begränsningen av hjärt ultraljud är relaterade till mätning variabilitet och reproducerbarhet. För att minska inter- och intra- operatör variabilitet, är det viktigt att standardisera hur bilder förvärvas och analyseras. Mätningarna bör utföras från flera akustiska fönster och lägen (B-mode, M-mode, och PW / färgdoppler) och minst 3 separata mätningar bör i genomsnitt att säkerställa noggrannhet och tillförlitlighet. Dessutom finns det begränsade akustiska fönster och bilder ibland låg kvalitet erhålls i små gnagare som utsätts för kirurgiska procedurer såsom TAC, på grund av vävnadssvullnad, kirurgiska ärr, och lungödem som stör ultraljudsbalkar. För Doppler imaging, är det ibland svårt att separat E och A-vågor och erhålla en fullständig vågform för mitral flöde, på grund av en relativt hög hjärtfrekvens i små gnagare, speciellt i möss som utsatts för TAC eller MI kirurgi. Sänkning av hjärtfrekvensen kan vara till hjälp för att få mätningar, men detta kommer att påverka värden som erhålls genom Doppler avbildning och därmed datatolknings.
Med de senaste tekniska framstegen, nyutgivna ultraljudssystem ger hög bildupplösning och ram / samplingsfrekvenser för att säkerställa korrekt kvantitativ mätning i små djur. Ny ekokardiografi teknik kommer också att förbättra känsligheten hos ekokardiografisk utvärdering av hjärtfunktion och möjliggöra tidig upptäckt av hjärt patologi. Exempelvis har speckle-tracking stam avbildning 15 använts för att exakt mäta regional hjärtmuskelfunktion. Ny givarteknik för närvarande under utveckling kommer att innebära i realtid, 3D eller 4Davbildning. Kontrast ekokardiografi som är i avancerad utveckling gör det möjligt för volymmätningar, vävnadsperfusion bedömningar, molekylär avbildning av hjärt-kärlsjukdom, och leverans av terapeutiska medel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia equipment | Harvard Apparatus, 84 October Hill Road Holliston, MA |
723015 | |
| Vevo 2100 Imaging System | VisualSonics Inc., 3080 Yonge Street Suite 6100, Box 66, Toronto, Ontario, Canada | Vevo 2100 | |
| Aquasonic ultrasound gel | Parker Laboratories, 286 Eldridge Rd, Fairfield, NJ | 03-50 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare, Inc, 3950 Schelden Circle Bethlehem, PA |
NDC 66794-017-25 | |
| F/air anesthesia gas filter unit | A.M. Bickford, Inc, 12318 Big Tree Rd, Wales Center, NY | 80120 |
References
- Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc Natl Acad Sci USA. 88 (18), 8277-8281 (1991).
- Tanaka, N., et al. Transthoracic echocardiography in models of cardiac disease in the mouse. Circulation. 94 (5), 1109-1117 (1996).
- Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure: development of novel therapies, past and present. Circ Heart Fail. 2 (2), 138-144 (2009).
- Heineke, J., Molkentin, J. D. Regulation of cardiac hypertrophy by intracellular signalling pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (8), 589-600 (2006).
- Oka, T., et al. Cardiac-specific deletion of Gata4 reveals its requirement for hypertrophy, compensation, and myocyte viability. Circ Res. 98 (6), 837-845 (2006).
- Gardin, J. M., Siri, F. M., Kitsis, R. N., Edwards, J. G., Leinwand, L. A. Echocardiographic assessment of left ventricular mass and systolic function in mice. Circ Res. 76 (5), 907-914 (1995).
- Respress, J. L., Wehrens, X. H.
- Pistner, A., Belmonte, S., Coulthard, T., Blaxall, B. Murine echocardiography and ultrasound imaging. J Vis Exp. (42), e2100 (2010).
- Patten, R. D., Aronovitz, M. J., Bridgman, P., Pandian, N. G. Use of pulse wave and color flow Doppler echocardiography in mouse models of human disease. J Am Soc Echocardiogr. 15 (7), 708-714 (2002).
- deAlmeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H.
- Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Bátkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc. 3 (9), 1422-1434 (2008).
- Larsen, T. S., et al. The isolated working mouse heart: methodological considerations. Pflugers Arch. 437 (6), 979-985 (1999).
- Roth, D. M., Swaney, J. S., Dalton, N. D., Gilpin, E. A., Ross, J. Jr Impact of anesthesia on cardiac function during echocardiography in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282 (6), H2134-H2140 (2002).
- Pearlman, A. S., Stevenson, J. G., Baker, D. W. Doppler echocardiography: applications, limitations and future directions. Am J Cardiol. 46 (7), 1256-1262 (1980).
- Bauer, M., et al. Echocardiographic speckle-tracking based strain imaging for rapid cardiovascular phenotyping in mice. Circ Res. 108 (8), 908-916 (2011).
