Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento e la coltura di singole cellule con una piattaforma microfluidica, che utilizza un nuovo concetto di progettazione di micropozzetti per consentire l'isolamento di singole cellule ad alta efficienza e la coltura clonale a lungo termine.
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Articolo metodologico
Una piattaforma Microfluidic per l'isolamento Single-cell high-throughput e cultura
In questo articolo
Sommario
Abstract
Studiare l'eterogeneità delle singole cellule è fondamentale per molte questioni biologiche, ma è tecnicamente difficile. Pertanto, c'è bisogno di un metodo semplice, ma ad alto rendimento, per eseguire esperimenti di coltura di singole cellule. Qui, riportiamo una strategia basata su chip microfluidico per l'isolamento di singole cellule ad alta efficienza (~77%) e dimostriamo la sua capacità di eseguire colture di singole cellule a lungo termine (fino a 7 giorni) e analisi di eterogeneità cellulare utilizzando il saggio clonogenico. Queste applicazioni sono state dimostrate con cellule staminali neurali di topo KT98 e cellule tumorali umane A549 e MDA-MB-435. L'elevata efficienza di isolamento di una singola cellula e la capacità di coltura a lungo termine si ottengono utilizzando micropozzetti di diverse dimensioni sulla parte superiore e inferiore del canale microfluidico. L'array di micropozzetti piccoli è progettato per isolare con precisione singole cellule, mentre l'array di micropozzetti grande viene utilizzato per la coltura clonale di singole cellule nel chip microfluidico. Questa piattaforma microfluidica costituisce un approccio interessante per le applicazioni di coltura di singole cellule, grazie alla sua flessibilità di spazi di coltura cellulare regolabili per diverse strategie di coltura, senza diminuire l'efficienza di isolamento.
Introduzione
Attualmente posizionando le celle singole singolarmente in uno spazio culturale è comunemente raggiunto utilizzando la diluizione limitando o cella a fluorescenza-attivato (FACS). Per molti laboratori, diluizione limite è un metodo conveniente, in quanto richiede solo una pipetta e piastre di coltura di tessuto, che sono prontamente disponibili. In questo caso, una sospensione cellulare viene diluito serialmente ad una densità cellulare appropriata, e quindi posto in pozzetti di coltura utilizzando una pipetta manuale. Queste cellule singoli compartimenti sono poi utilizzati per l'analisi delle cellule, come ad esempio lo screening eterogeneità genetica 1
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Protocollo
Nota: I disegni fotomaschere per la nostra fabbricazione di dispositivi microfluidica sono stati elaborati utilizzando un software di progettazione assistita da computer (CAD). I disegni sono stati poi utilizzati per fabbricare fotomaschere Chrome con un servizio commerciale. I dispositivi PDMS sono state effettuate utilizzando tecniche di litografia morbide. 11
1. Realizzazione di Maestro Stampi per litografia
- Prima che il processo di fotolitografia 12, utilizzare i wafer di silicio da 4 pollici come substrato e disidratare i wafer in un forno convenzionale a 120 ° C per 10 min.
- Pulire i wafer d....
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Risultati
La piattaforma microfluidica per l'isolamento e la coltura singola cella comprende un microcanale (200 micron di altezza) con due serie di matrici di micropozzetti (Figura 2A). Le due serie di array di pozzetti sono definiti come la cattura-bene (25 micron di diametro e 27 micron di profondità) e la cultura-bene (285 micron di diametro e 300 micron di profondità) per l'isolamento a cella singola e cultura, rispettivamente, e ogni cattura-well è posizionata al cen.......
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Discussione
Sistemi di dispositivi di pozzetti a base di 6,14 sono stati utilizzati per la manipolazione a cella singola e di analisi, come ad esempio su larga scala singola cellula intrappolando 6 e la proliferazione delle cellule staminali ematopoietiche singolo 15. Sebbene dimensioni ben, il numero e la forma può essere regolata per applicazioni specifiche, l'efficienza di isolamento singola cella è sempre compromessa quando si aumenta la dimensione del pozzo. 9,15
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del National Health Research Institutes (03-A1 BNMP11-014).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Software AutoCAD | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Codice 057C1-74A111-1001 |
| Wafer di silicone | SPE0039 | Eltech corperation | |
| YEONG-SHIN company | ovp45 | ||
| Pulitore al plasma | Nordson | AP-300 | Sistema di trattamento al plasma da banco |
| SU-8 50 fotoresist negativo | MicroChem | Y131269 | |
| SU-8 100 fotoresist negativo | MicroChem | Y131273 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2 "~ 6" | |
| Piastra riscaldante | YOTEC azienda | YS-300S | |
| Msak allineatore | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| SU-8 sviluppatore | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Glicole propilenico monometil etere acetato |
| Profilometro laser a scansione | KEYENCE | VK-X 100 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetraidroottil. Rischioso. Corrosivo per le vie respiratorie, reagisce violentemente con l'acqua. |
| Essiccatore | Bel-Art Products | F42020-0000 | Essiccatore sottovuoto salvaspazio 190 mm base bianca |
| Kit polidimetilsilossano (PDMS) | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Harris Uni-Core perforatore | Ted Pella Inc. | 15072 | con diametro interno di 0,75 mm |
| Nastro rimovibile | 3M Company | Scotch Nastro rimovibile 811 | |
| Stereomicroscopio | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Tecnologia Bersing | ALB001.500 | |
| DMEM terreno basale | Gibco | 12800-017 | |
| Siero fetale bovino | Thermo Hyclone | SH30071.03HI | |
| Antibiotici | Biowest | L0014-100 | Glutammina-Penicillina-Streptomicina |
| Miscela enzimatica ricombinante | Tecnologia cellulare innovativa | AM-105 | Accumax |
| DiIC12 (3) colorante a membrana cellulare | BD Biosciences | 354218 | Utilizzato come tracker cellulare |
| Pompa a siringa | Harvard Apparecchio | 703007 | |
| siringa (1 ml) | BD Biosciences | 309659 | |
| aghi smussati calibro 23 | Ever Sharp Technology, Inc. | TD21 | |
| Tubo in politetrafluoroetilene (PTFE) | Ever Sharp Technology, Inc. | Diametro interno TFT-23T | , 0,51 millimetro; diametro esterno, 0,82 millimetro |
Riferimenti
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. P Natl Acad Sci USA
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Ristampe e permessi
