Una piattaforma Microfluidic per l'isolamento Single-cell high-throughput e cultura

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento e la coltura di singole cellule con una piattaforma microfluidica, che utilizza un nuovo concetto di progettazione di micropozzetti per consentire l'isolamento di singole cellule ad alta efficienza e la coltura clonale a lungo termine.

Abstract

Studiare l'eterogeneità delle singole cellule è fondamentale per molte questioni biologiche, ma è tecnicamente difficile. Pertanto, c'è bisogno di un metodo semplice, ma ad alto rendimento, per eseguire esperimenti di coltura di singole cellule. Qui, riportiamo una strategia basata su chip microfluidico per l'isolamento di singole cellule ad alta efficienza (~77%) e dimostriamo la sua capacità di eseguire colture di singole cellule a lungo termine (fino a 7 giorni) e analisi di eterogeneità cellulare utilizzando il saggio clonogenico. Queste applicazioni sono state dimostrate con cellule staminali neurali di topo KT98 e cellule tumorali umane A549 e MDA-MB-435. L'elevata efficienza di isolamento di una singola cellula e la capacità di coltura a lungo termine si ottengono utilizzando micropozzetti di diverse dimensioni sulla parte superiore e inferiore del canale microfluidico. L'array di micropozzetti piccoli è progettato per isolare con precisione singole cellule, mentre l'array di micropozzetti grande viene utilizzato per la coltura clonale di singole cellule nel chip microfluidico. Questa piattaforma microfluidica costituisce un approccio interessante per le applicazioni di coltura di singole cellule, grazie alla sua flessibilità di spazi di coltura cellulare regolabili per diverse strategie di coltura, senza diminuire l'efficienza di isolamento.

Introduction

Attualmente posizionando le celle singole singolarmente in uno spazio culturale è comunemente raggiunto utilizzando la diluizione limitando o cella a fluorescenza-attivato (FACS). Per molti laboratori, diluizione limite è un metodo conveniente, in quanto richiede solo una pipetta e piastre di coltura di tessuto, che sono prontamente disponibili. In questo caso, una sospensione cellulare viene diluito serialmente ad una densità cellulare appropriata, e quindi posto in pozzetti di coltura utilizzando una pipetta manuale. Queste cellule singoli compartimenti sono poi utilizzati per l'analisi delle cellule, come ad esempio lo screening eterogeneità genetica ¹

Protocol

Nota: I disegni fotomaschere per la nostra fabbricazione di dispositivi microfluidica sono stati elaborati utilizzando un software di progettazione assistita da computer (CAD). I disegni sono stati poi utilizzati per fabbricare fotomaschere Chrome con un servizio commerciale. I dispositivi PDMS sono state effettuate utilizzando tecniche di litografia morbide. ¹¹

1. Realizzazione di Maestro Stampi per litografia

1. Prima che il processo di fotolitografia ^12, utilizzare i wafer di silicio da 4 pollici come substrato e disidratare i wafer in un forno convenzionale a 120 ° C per 10 min.
2. Pulire i wafer d....

Results

La piattaforma microfluidica per l'isolamento e la coltura singola cella comprende un microcanale (200 micron di altezza) con due serie di matrici di micropozzetti (Figura 2A). Le due serie di array di pozzetti sono definiti come la cattura-bene (25 micron di diametro e 27 micron di profondità) e la cultura-bene (285 micron di diametro e 300 micron di profondità) per l'isolamento a cella singola e cultura, rispettivamente, e ogni cattura-well è posizionata al centro di u.......

Discussion

Sistemi di dispositivi di pozzetti a base di ^6,14 sono stati utilizzati per la manipolazione a cella singola e di analisi, come ad esempio su larga scala singola cellula intrappolando ⁶ e la proliferazione delle cellule staminali ematopoietiche singolo ^15. Sebbene dimensioni ben, il numero e la forma può essere regolata per applicazioni specifiche, l'efficienza di isolamento singola cella è sempre compromessa quando si aumenta la dimensione del pozzo. ^9,15

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Software AutoCAD	Autodesk	AutoCAD LT 2011	Codice 057C1-74A111-1001
Wafer di silicone	SPE0039		Eltech corperation
	YEONG-SHIN company	ovp45
Pulitore al plasma	Nordson	AP-300	Sistema di trattamento al plasma da banco
SU-8 50 fotoresist negativo	MicroChem	Y131269
SU-8 100 fotoresist negativo	MicroChem	Y131273
Spin coater	Synrex Co., Ltd.	SC-HMI 2 "~ 6"
Piastra riscaldante	YOTEC azienda	YS-300S
Msak allineatore	Deya Optronic CO.	A1K-5-MDA
SU-8 sviluppatore	Grand Chemical Companies	GP5002-000000-72GC	Glicole propilenico monometil etere acetato
Profilometro laser a scansione	KEYENCE	VK-X 100
Trichlorosilane	Gelest, Inc	SIT8174.0	Tridecafluoro-1,1,2,2-tetraidroottil. Rischioso. Corrosivo per le vie respiratorie, reagisce violentemente con l'acqua.
Essiccatore	Bel-Art Products	F42020-0000	Essiccatore sottovuoto salvaspazio 190  mm base bianca
Kit polidimetilsilossano (PDMS)	Dow corning	Sylgard 184
Harris Uni-Core perforatore	Ted Pella Inc.	15072	con diametro interno di 0,75 mm
Nastro rimovibile	3M Company	Scotch Nastro rimovibile 811
Stereomicroscopio	Leica Microsystems	Leica E24
Albumina sierica bovina (BSA)	Tecnologia Bersing	ALB001.500
DMEM terreno basale	Gibco	12800-017
Siero fetale bovino	Thermo Hyclone	SH30071.03HI
Antibiotici	Biowest	L0014-100	Glutammina-Penicillina-Streptomicina
Miscela enzimatica ricombinante	Tecnologia cellulare innovativa	AM-105	Accumax
DiIC12 (3) colorante a membrana cellulare	BD Biosciences	354218	Utilizzato come tracker cellulare
Pompa a siringa	Harvard Apparecchio	703007
siringa (1 ml)	BD Biosciences	309659
aghi smussati calibro 23	Ever Sharp Technology, Inc.	TD21
Tubo in politetrafluoroetilene (PTFE)	Ever Sharp Technology, Inc.	Diametro interno TFT-23T	, 0,51  millimetro; diametro esterno, 0,82  millimetro