Una piattaforma Microfluidic per l'isolamento Single-cell high-throughput e cultura

L'obiettivo generale di questo protocollo è dimostrare la fabbricazione e il funzionamento di un chip microfluidico, che permette l'isolamento e la coltura ad alta efficienza di singole cellule. Questo metodo fornisce uno strumento utile per qualsiasi settore che possa trarre vantaggio dall'isolamento e dalla coltura di singole cellule. Il principale vantaggio di questa tecnica è la sua elevata efficienza nel caricare singole cellule in array di micropozzetti di grandi dimensioni.

Inoltre, per far funzionare il dispositivo vengono utilizzati esclusivamente un flusso delicato e la forza di gravità, il che minimizza il danno cellulare. L'applicazione di questa tecnica è rivolta alla diagnosi finale di malattie umane come il cancro, in cui l'eterogeneità cellulare influisce sulla risposta della cellula; abbiamo avuto l'idea di sviluppare questo metodo mentre stavamo stabilendo una linea cellulare in micropozzetti, poiché il metodo di diluizione limite risultava molto lungo e inefficiente. Oggi questo metodo può fornire informazioni dettagliate sull'analisi della singola cellula.

È inoltre applicabile ad altre applicazioni, come la definizione e il controllo temporale dell'osservazione del percorso e del comportamento di singole cellule. Per iniziare, preparare stampi master silanizzati sia per lo strato di isolamento delle singole cellule sia per lo strato di coltura in micropozzetti, utilizzando la fotolitografia standard come descritto nel protocollo testuale allegato. Per ciascuno stampo master, mescolare 16 grammi di base PDMS con 1,6 grammi di agente indurente in un bicchiere monouso, e agitare le miscele fino a completo amalgama.

Quindi, posizionare gli stampi master in piatti di Petri da 150 millimetri e versare il PDMS sopra gli stampi. Posizionare i piatti di Petri in un essiccatore e applicare il vuoto per un'ora per rimuovere le bolle d'aria dal PDMS. Dopo un'ora, rimuovere i piatti dall'essiccatore e collocarli in un forno tradizionale a 65 gradi Celsius per tre-sei ore per polimerizzare il PDMS.

Quindi, rimuovere le piastre dal forno e lasciarle raffreddare a temperatura ambiente. Una volta raffreddate, staccare l'array di pozzetti di cattura in PDMS reticolato e l'array di coltura a micropozzetti dagli stampi principali e tagliare i dispositivi utilizzando una lametta. Successivamente, utilizzare un punzone da 0,75 millimetri per creare un foro a ciascuna estremità del microcanale sul livello dell'array di pozzetti di cattura.

Utilizzare del nastro per pulire la superficie che diventerà la faccia interna del dispositivo, quindi posizionare i singoli strati con le superfici interne rivolte verso l'alto in un pulitore al plasma per un breve trattamento al plasma di ossigeno. Al termine, rimuovere gli strati in PDMS dal pulitore al plasma e utilizzare un microscopio stereoscopico per allineare e unire gli strati superiore e inferiore del dispositivo. Posizionare il dispositivo allineato in un forno a 65 gradi Celsius per 24 ore per creare un legame permanente tra gli strati in PDMS.

Successivamente, posizionare il dispositivo in PDMS legato in acqua deionizzata e mettere il contenitore in un essiccatore sotto vuoto per 15 minuti, al fine di rimuovere l'aria dal microcanale del dispositivo. Dopo aver rimosso completamente l'aria dal dispositivo, posizionare il dispositivo in PDMS in una cappa a flusso laminare per colture cellulari e utilizzare la luce UV per sterilizzare la superficie del dispositivo per 30 minuti. Successivamente, sostituire l'acqua deionizzata nel dispositivo con albumina sierica bovina al 5% in PBS e incubare il dispositivo a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Questo bloccherà la superficie e migliorerà l'efficienza di trasferimento delle cellule isolate dai pozzetti di cattura ai pozzetti di coltura. Dopo 30 minuti, sostituire la soluzione di blocco nel dispositivo con PBS sterile. Preparare una sospensione di singole cellule con 2,5 milioni di cellule per millilitro e caricare una pipetta con 50 microlitri della sospensione.

Quindi, trasferire le cellule nel dispositivo attraverso il foro di uscita del dispositivo. Caricare altri 50 microlitri della sospensione cellulare e trasferirli nel dispositivo attraverso il foro di ingresso, in modo da riempire uniformemente l'intero microcanale con le cellule. Una volta caricato, utilizzare un tappo sterile realizzato con filo da pesca in nylon del diametro di un millimetro per sigillare il foro di uscita del dispositivo.

Quindi, riempire una siringa sterile da un millilitro con mezzo di coltura, espellere eventuali bolle d'aria residue e inserirla nella pompa per siringa. Collegare un ago smussato da 23 gauge alla siringa e utilizzare un tubo in politetrafluoroetilene per connettere l'ago all'ingresso del dispositivo. Dopo aver collegato il tubo, rimuovere il tappo dal foro di uscita e attendere due minuti mentre le cellule si depositano nei pozzetti di cattura singola per forza di gravità.

Successivamente, impostare la pompa per siringa a 600 microlitri al minuto. Rimuovere il tappo di uscita e lavare via le cellule non catturate per 30 secondi. Attendere due minuti per permettere al pressione di stabilizzarsi.

Quindi rimuovere il tubo dall'ingresso del dispositivo e sigillare sia i fori di ingresso che di uscita con tappi per formare un sistema di coltura chiuso. Ora capovolgere il dispositivo manualmente per trasferire le singole cellule catturate nelle micropozzette di coltura sull'altro lato del dispositivo. Successivamente, posizionare il dispositivo in una piastra di coltura tessutale da 100 millimetri, aggiungere 10 millilitri di PBS sterilizzato attorno al dispositivo e inserire la piastra in un incubatore.

Per sostituire il mezzo di coltura, posizionare prima due gocce di mezzo di coltura sulla parte superiore del dispositivo in PDMS vicino all'ingresso e all'uscita, per evitare di introdurre bolle d'aria nel microcanale. Successivamente, utilizzare una punta da biopsia da 0,75 millimetri per praticare due fori sulla parte superiore del dispositivo in PDMS, in prossimità delle estremità del microcanale. Accertarsi di perforare soltanto lo strato superiore del dispositivo.

Successivamente, riempire una siringa di plastica da un millilitro contenente mezzo fresco preriscaldato ed utilizzare un ago ottuso da 23 gauge e un tubo in PTFE per collegarla al nuovo porto di ingresso. Far affluire lentamente circa 120 microlitri di mezzo fresco nel dispositivo nell'arco di cinque minuti per sostituire il mezzo vecchio. Al termine, sigillare i porti di ingresso e di uscita utilizzando due tappi ed inserire nuovamente il dispositivo nell'incubatrice per colture cellulari.

Il numero di cellule che finiscono nelle camere di cattura varia dal circa 68% all'85%, a seconda del tipo di cellula. Inoltre, la maggior parte delle camere di cattura contiene una sola cellula, per tutti e tre i tipi cellulari. Dopo il trasferimento delle cellule KT98 catturate nelle camere di coltura, circa il 77% delle camere presentava una sola cellula, il 16% non aveva cellule, il 6% conteneva due cellule e meno dell'1% delle camere aveva tre o più cellule.

Nel corso di sette giorni, le singole cellule isolate hanno mostrato pattern di crescita eterogenei. Mentre alcune cellule si sono moltiplicate, altre no. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa 20 minuti se effettuata correttamente.

Dopo aver guardato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare questa piattaforma ad alto rendimento per l'isolamento di singole cellule e la coltura endocrina per aumentare la produttività dei propri esperimenti su singole cellule. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di evitare che bolle d'aria entrino nel microcanale e di prevenire l'aggregazione delle cellule nel tempo.