Name: Una piattaforma Microfluidic per lisolamento Single-cell high-throughput e cultura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Scopri l'isolamento single-cell ad alta efficienza con una piattaforma microfluidica che utilizza flusso delicato e forza gravitazionale. Questo metodo minimizza i danni cellulari e permette la coltura a lungo termine per studiare l'eterogeneità cellulare.

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Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del National Health Research Institutes (03-A1 BNMP11-014).

Nota: I disegni fotomaschere per la nostra fabbricazione di dispositivi microfluidica sono stati elaborati utilizzando un software di progettazione assistita da computer (CAD). I disegni sono stati poi utilizzati per fabbricare fotomaschere Chrome con un servizio commerciale. I dispositivi PDMS sono state effettuate utilizzando tecniche di litografia morbide. 11 1. Realizzazione di Maestro Stampi per litografia <ol><li> Prima che il processo di fotolitografia 12, utilizzare i wafer di silicio da 4 pollici come substrato e disidratare i wafer in un forno convenzionale a 120 ° C per 10 min. </li><li> Pulire i wafer di silicio disidratati mediante trattamento al plasma di ossigeno a 100 watt per 30 secondi in un pulitore plasma. </li><li> Preriscaldare due piastre a 65 ° C e 95 ° C, rispettivamente, per il seguente processo di cottura. </li><li> Cappotto 5 g di photoresist negativo (PR) sui wafer di silicio pulite da un dispositivo a induzione di spin; centrifuga a 1200 rpm (SU-8 50) per 30 sec per produrre lo strato di microcanali. </li><li> Posizionare il PRrivestito wafer su una piastra preriscaldato a 65 ° C per 12 min e trasferirlo in un&#39;altra piastra preriscaldato a 95 ° C per 33 min (per 100 micron di spessore modelli) per eseguire un processo di cottura morbida. </li><li> Dopo la cottura, posizionare il wafer di silicio rivestito PR sul supporto di una maschera allineatore semi-automatico e allinearlo a una trasparenza fotomaschera 25.400 dpi di risoluzione. </li><li> Esporre il rivestito PR wafer di silicio a luce UV (365 nm) ad una dose di 500 mJ / cm 2 per creare il modello PR sul wafer di silicio. </li><li> Rimuovere il wafer dal allineatore e posizionarlo su una piastra per la post-cottura a 95 ° C per 12 min. </li><li> Mettere a bagno i wafer di SU-8 sviluppatore della soluzione (glicole propilenico monometiletere acetato, PGMEA) per lavare via PR non reticolato per 12 min e asciugare delicatamente con azoto per esporre i segni di allineamento. </li><li> Ancora una volta, cappotto 5 g di fotoresist negativo sui wafer da un coater centrifuga; centrifuga a 700 rpm (SU-8 100) per 30 sec e 1.200 rpm (SU-8 10) per 30 sec per 300 &amp;# 181; m modello di spessore e 27 micron modello di spessore, rispettivamente, per rendere lo strato micropozzetto. </li><li> Posizionare il wafer PR rivestito su una piastra riscaldante a 65 ° C per 4 min ed a 95 ° C per 8 min (per 27 micron strato profondo cattura-well); ed a 65 ° C per 40 minuti ea 95 ° C per 110 min (per 300 micron strato profondo cultura-well). </li><li> Dopo raffreddamento, posizionare il wafer di silicio rivestito PR sul allineatore maschera dotata di luce UV. </li><li> Esporre il rivestito PR wafer di silicio alla luce UV (365 nm) ad una dose di 250 mJ / cm 2 (per 27 micron di spessore pattern) e 700 mJ / cm 2 (per 300 micron di spessore pattern). </li><li> Cuocere i wafer a 95 ° C per 5 min (27 micron di spessore pattern) e 30 min (300 micron di spessore pattern), rispettivamente. </li><li> Lavare il PR non reticolato dal PGMEA per 6 min (27 micron di spessore pattern) e 25 min (300 micron di spessore pattern), rispettivamente, e poi asciugare con azoto. </li><li> Misurare l&#39;altezza del modello dispone suil wafer con un profilometro scansione laser posizionando il wafer sul xy fase di un profilometro laser a scansione. <ol><li> Regolare il piano focale per mostrare chiaramente il modello presenta sul wafer utilizzando la modalità di osservazione &quot;telecamera&quot; sotto una lente obiettivo 20X. </li><li> Cambiare la modalità di osservazione da &quot;telecamera&quot; a &quot;vista laser&quot;, e impostare le posizioni superiori ed inferiori delle caratteristiche. </li><li> Impostare la modalità di misurazione, zona, la qualità, e Z-passo fino a trasparente (in alto), 1 linea (1.024 x 1), ad alta precisione e 0,5 micron, rispettivamente, e quindi premere il fondo di partenza per iniziare la misurazione. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione di dispositivi PDMS per l&#39;isolamento Single-cell <ol><li> Prima di PDMS casting, silanizzare gli stampi di perfezionamento con triclorosilano per creare una superficie idrofobica, che rende più facile per staccare il PDMS repliche dagli stampi maestri. <ol><li> Mettere gli stampi master e una barca ponderazione contenente200 ml di triclorosilano in essiccatore e applicare il vuoto (-85 kPa) per 15 min. </li><li> Arrestare il vuoto e poi lasciare gli stampi di master in un essiccatore per silanizzare gli stampi maestri a temperatura ambiente per almeno 1 ora. </li><li> Rimuovere gli stampi maestri dal essiccatore e posizionare ogni stampo master in un 10 centimetri Petri. </li></ol></li><li> Mescolare un totale di 17,6 g di polimero kit PDMS contenente una base e un agente indurente in un rapporto di 10: 1, e quindi versare il PDMS sullo stampo master nel piatto Petri. </li><li> Posizionare la piastra di Petri in un essiccatore e applicare il vuoto (-85 kPa) per 1 ora per rimuovere le bolle d&#39;aria nei PDMS. </li><li> Rimuovere la piastra di Petri dal essiccatore e metterla in un forno tradizionale a 65 ° C per 3-6 ore per curare il PDMS. </li><li> Rimuovere le repliche PDMS indurito dagli stampi master e perforare due fori come un ingresso e una uscita alle due estremità del microcanale sull&#39;array PDMS replica capture-bene da un perforatore con interno-diametro di 0.75 mm per il canale fluidica (Figura 2A). </li><li> Utilizzare nastro per pulire la superficie delle repliche PDMS, e quindi posizionare le repliche PDMS un detersivo plasma per breve trattamento al plasma di ossigeno (100 watt per 14 sec). </li><li> Rimuovere le repliche PDMS dalla macchina plasma di ossigeno. </li><li> Allineare un top (contenente i pozzetti di cattura) e un PDMS fondo (che contengono i pozzetti di coltura) replica a mano allo stereomicroscopio e metterli in contatto. </li><li> Posizionare i PDMS repliche allineate in un forno a 65 ° C per 24 ore per ottenere l&#39;unione permanente tra le PDMS repliche per formare il dispositivo finale. </li><li> Bagnare il dispositivo PDMS in un deionizzata (DI) -acqua contenitore riempito e posizionare il contenitore in un essiccatore sotto vuoto (-85 kPa) per 15 minuti per eliminare l&#39;aria dalla microcanali del dispositivo PDMS. </li><li> Posizionare il dispositivo PDMS piena d&#39;acqua DI in una cappa coltura tissutale e utilizzando luce UV (lunghezza d&#39;onda: 254 nm) per sterilizzare il dispositivo per 30 min. </li><li> Sostituire l&#39;acqua deionizzata nel dispositivo PDMS con un siero albumina bovina 5% (BSA) in soluzione PBS 1x e incubare a 37 ° C per 30 minuti per impedire alle cellule di attaccarsi alla superficie PDMS. Nota: Il rivestimento BSA è essenziale per migliorare l&#39;efficienza di trasferimento di cellule isolate dalla cattura pozzetti per coltura pozzetti. </li><li> Sostituire la soluzione BSA 5% nel dispositivo PDMS con una soluzione di PBS 1x sterilizzata. </li></ol> 3. Preparazione di cella singola sospensione <ol><li> Culture Neural staminali KT98 cella e A549 cellule di carcinoma umano MDA-MB-435 che in piastra di Petri in coltura cellulare convenzionale incubatore (37 ° C, 5% di CO 2, e 95% di umidità) per preparare le cellule per l&#39;esperimento PDMS cella periferica . </li><li> Rimuovere e scartare il terreno di coltura esaurito (DMEM medio basale in dotazione con il 10% di siero fetale bovino e 1% di antibiotici) dal piatto di coltura con cellule coltivate a 70 - 80% di confluenza. </li><li> Lavare delicatamente le cellule con sterilizzati PBS per tre volte. &lt;/ Li&gt; <li> Rimuovere e scartare il PBS e aggiungere 2 ml di una miscela di enzimi proteolitici ricombinante con, collagenolitica, e le attività di DNasi (si veda l&#39;elenco dei materiali per le informazioni dettagliate). </li><li> Incubare il piatto cultura a temperatura ambiente per 5 minuti, quindi toccare il piatto cultura per facilitare il distacco delle cellule. </li><li> Aggiungere 4 ml di PBS sterile per disperdere le cellule, e poi trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml. </li><li> Centrifugare la provetta a 300 xg per 3 min e rimuovere il surnatante. </li><li> Risospendere delicatamente il pellet di cellule in 1 ml sterilizzati PBS e contare il numero di cellulare dal vivo con il metodo standard di esclusione Trypan Blue 13. Nota: questo passaggio risospensione è fondamentale per la preparazione di ben dissociato-cella singola sospensione per migliorare l&#39;efficienza di isolamento cella singola. </li></ol> 4. Isolamento Single-cell e cultura clonale <ol><li> Carico 50 ml di sospensione cellulare ad una concentrazione di 2,2 - 2.5 x10 <sup&gt; 6 cellule / ml nel microcanali del dispositivo PDMS tramite foro di uscita del dispositivo con una pipetta palmare. Nota: Il caricamento della pipetta sospensione cellulare deve essere fermato e tenuto alla prima posizione di arresto per evitare l&#39;introduzione di bolle d&#39;aria nel microcanali. </li><li> Caricare altri 50 ml di sospensione cellulare attraverso il foro di ingresso per riempire in modo uniforme l&#39;intero microcanali con cellule. </li><li> Sigillare il foro di uscita con un tappo (a lunghezza 3 mm, 1 mm di diametro nylon taglio lenza) per evitare il flusso indotto dalla pressione idrostatica dalle goccioline di fori di ingresso e di uscita. Nota: le spine erano UV sterilizzato all&#39;interno di una cappa coltura tissutale prima dell&#39;uso. </li><li> Riempire una siringa da 1 ml sterile con terreno di coltura, espellere le bolle d&#39;aria da esso, e impostarlo su una pompa a siringa. </li><li> Collegare il supporto caricato siringa al foro di ingresso del dispositivo PDMS tramite un ago G smussata 23 ed una poli-tetrafluoroethene tubazione (PTFE). </li><li> Togliere la spina dalla presa di corrente e tutto il foro diow un intervallo di tempo di 2 minuti per consentire alle cellule di stabilirsi nella cella singola cattura-pozzi di forza gravitazionale. </li><li> Lavare via le cellule non catturate con 300 ml di terreno di coltura ad una portata di 600 ml / min spinto dalla pompa a siringa. </li><li> Attendere 2 minuti per stabilizzare il dispositivo, e sigillare i fori di ingresso e di uscita con spine per formare un sistema di coltura chiuso. </li><li> Capovolgere il dispositivo a mano per trasferire i catturati singole cellule ai pozzetti di coltura. </li><li> Posizionare il dispositivo PDMS in un piatto di coltura di tessuti da 100 mm, e aggiungere 10 ml di PBS sterile intorno al dispositivo per evitare l&#39;evaporazione cultura media dal microcanali. </li><li> Spostare il piatto cultura di un incubatore tradizionale coltura cellulare (37 ° C, 5% di CO 2, e 95% di umidità) per la cultura clonale delle singole cellule. </li></ol> 5. terreno di coltura Replenishment <ol><li> Dopo 1 d della cultura, sostituire il terreno di coltura nel dispositivo PDMS con terreno fresco per migliorare pr celluleoliferation. </li><li> Inserire due gocce di mezzo di coltura sulla parte superiore del dispositivo PDMS vicino alle aree fori di ingresso e di uscita per evitare l&#39;introduzione di bolle d&#39;aria nel microcanale durante l&#39;esecuzione della fase successiva. </li><li> Punch due fori dalla parte superiore del dispositivo PDMS prossimità delle due estremità del microcanale come un ingresso e un&#39;uscita per il microcanali. Nota: non perforare attraverso l&#39;intero due strati del dispositivo PDMS; invece, proprio pugno attraverso lo strato superiore delle PDMS. </li><li> Collegare una siringa di plastica da 1 ml contenente mezzo fresco per l&#39;ingresso attraverso un ago G smussata 23 e tubi in PTFE. </li><li> Portata media 120 microlitri fresca nel dispositivo per 5 minuti per sostituire il vecchio mezzo. </li><li> Inserire due tappi per sigillare entrata e uscita fori, e restituire il dispositivo per l&#39;incubatore di coltura cellulare. </li><li> Aggiornare il terreno di coltura ogni 2 d durante il periodo di coltura rimuovendo le spine di tenuta, seguito ripetendo i punti 5.4 al 5.5. </li></ol>

<ol><li>Meacham, C. E., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+heterogeneity+and+cancer+cell+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity.</a> Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).</li>
<li>Vermeulen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+cloning+of+colon+cancer+stem+cells+reveals+a+multi-lineage+differentiation+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity.</a> P Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).</li>
<li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShapiro%2C+HM+%22Practical+flow+cytometry%22">Practical flow cytometry</a>. , John Wiley & Sons. (2005).</li>
<li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+prostate+from+a+single+adult+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a prostate from a single adult stem cell.</a> Nature. 456 (7223), 804-808 (2008).</li>
<li>Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing-based+technologies+will+revolutionize+whole-organism+science%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science.</a> Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).</li>
<li>Rettig, J. R., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+single-cell+trapping+and+imaging+using+microwell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Large-scale single-cell trapping and imaging using microwell arrays.</a> Anal. Chem. 77 (17), 5628-5634 (2005).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+fibrin+gels+promote+selection+and+growth+of+tumorigenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Soft fibrin gels promote selection and growth of tumorigenic cells.</a> Nat Mater. 11 (8), 734-741 (2012).</li>
<li>Charnley, M., Textor, M., Khademhosseini, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+column%3A+microwell+arrays+for+mammalian+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integration column: microwell arrays for mammalian cell culture.</a> Integr. Biol. 1 (11-12), 11-12 (2009).</li>
<li>Lindstrom, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+microwell+chip+for+culture+and+analysis+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High-density microwell chip for culture and analysis of stem cells.</a> PloS one. 4 (9), e6997(2009).</li>
<li>Lin, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+dual-well+device+for+high-throughput+single-cell+capture+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic dual-well device for high-throughput single-cell capture and culture.</a> Lab Chip. 15 (14), 2928-2938 (2015).</li>
<li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Soft lithography.</a> Angew Chem Int Edit. 37 (5), 550-575 (1998).</li>
<li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).</li>
<li>Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturization+of+biological+assays+-+Overview+on+microwell+devices+for+single-cell+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Bba-Gen+Subjects%22%5BJournal%5D)">Miniaturization of biological assays - Overview on microwell devices for single-cell analyses.</a> Bba-Gen Subjects. 1810 (3), 308-316 (2011).</li>
<li>Lecault, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+single+hematopoietic+stem+cell+proliferation+in+microfluidic+cell+culture+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of single hematopoietic stem cell proliferation in microfluidic cell culture arrays.</a> Nat Methods. 8 (7), 581-593 (2011).</li>
<li>Park, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+trapping+in+larger+microwells+capable+of+supporting+cell+spreading+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Single cell trapping in larger microwells capable of supporting cell spreading and proliferation.</a> Microfluid Nanofluid. 8 (2), 263-268 (2010).</li>
<li>Tirino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+in+solid+tumors%3A+an+overview+and+new+approaches+for+their+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization.</a> FASEB J. 27 (1), 13-24 (2013).</li>
<li>Chen, P. C., Huang, Y. Y., Juang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEMS+microwell+and+microcolumn+arrays%3A+novel+methods+for+high-throughput+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">MEMS microwell and microcolumn arrays: novel methods for high-throughput cell-based assays.</a> Lab Chip. 11 (21), 3619-3625 (2011).</li>
<li>Liang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+Screening+Using+a+Library+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+Reveals+Disease-Specific+Patterns+of+Cardiotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Drug Screening Using a Library of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Reveals Disease-Specific Patterns of Cardiotoxicity.</a> Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Sistemi di dispositivi di pozzetti a base di 6,14 sono stati utilizzati per la manipolazione a cella singola e di analisi, come ad esempio su larga scala singola cellula intrappolando 6 e la proliferazione delle cellule staminali ematopoietiche singolo 15. Sebbene dimensioni ben, il numero e la forma può essere regolata per applicazioni specifiche, l&#39;efficienza di isolamento singola cella è sempre compromessa quando si aumenta la dimensione del pozzo. 9,15 <p class="jo...

Attualmente posizionando le celle singole singolarmente in uno spazio culturale è comunemente raggiunto utilizzando la diluizione limitando o cella a fluorescenza-attivato (FACS). Per molti laboratori, diluizione limite è un metodo conveniente, in quanto richiede solo una pipetta e piastre di coltura di tessuto, che sono prontamente disponibili. In questo caso, una sospensione cellulare viene diluito serialmente ad una densità cellulare appropriata, e quindi posto in pozzetti di coltura utilizzando una pipetta manuale. Queste cellule singoli compartimenti sono poi utilizzati per l&#39;analisi delle cellule, come ad esempio lo screening eterogeneità genetica 1 e colonia di formazione 2. Tuttavia, questo metodo è basso throughput e intensità di lavoro, senza utilizzare un braccio robotico per l&#39;assistenza, perché la natura distribuzione di Poisson del metodo di diluizione limitante limita eventi monocellulari ad una probabilità massima del 37% 3. macchine FACS con un braccio robotico integrato in grado di superare la limitazione della distribuzione di Poisson con precisione placing una singola cella in una cultura ben alla volta 4. Tuttavia, l&#39;elevato sforzo di taglio meccanico (quindi abbassato vitalità cellulare) 5 ed acquisto della macchina e dei costi operativi hanno limitato il suo utilizzo in molti laboratori. Per superare le limitazioni di cui sopra, i dispositivi microscala sono stati sviluppati per caricare altamente efficiente singole cellule nei pozzetti 6. Tuttavia, i pozzetti non forniscono spazio sufficiente per le cellule caricate a proliferare, a causa della necessità di rendere le dimensioni di ciascun pozzetto vicino a quello di una singola cella di massimizzare il carico probabilità cella singola. Come test di cultura sono necessari in molte applicazioni basati su celle (ad esempio, test clonogenica 7), pozzetti più grandi (90-650 micron di diametro o in lunghezza del lato) sono stati utilizzati per consentire colture cellulari estesi. Tuttavia, come il metodo di diluizione limitante, possiedono anche bassi singole efficienze di carico delle cellule, che vanno da 10 -. 30% 8, 9 In precedenza, abbiamo sviluppato una piattaforma microfluidica high-throughput per isolare singole cellule nei singoli pozzetti e dimostrare la sua applicazione nel saggio clonogenica delle cellule isolate. 10 Il dispositivo è stato realizzato con poli-dimetilsiloxano (PDMS), e comprende due serie di array di pozzetti con differenti formati micropozzetti, che può sostanzialmente migliorare l&#39;efficienza nel caricare una singola cella in un micropozzetto cui dimensione è significativamente più grande della cella. In particolare, questo concetto &quot;dual-well&quot; permette la dimensione dell&#39;area culturale di regolare in modo flessibile senza compromettere l&#39;efficienza di cattura cella singola, rendendo semplice per regolare la progettazione del dispositivo per soddisfare diversi tipi di cellule e applicazioni. Questo metodo ad alta efficienza dovrebbe essere utile per esperimenti di coltura cellulare a lungo termine per gli studi eterogeneità delle cellule e monoclonale stabilimento linea cellulare.

<table><tbody><tr><td>Software AutoCAD</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD LT 2011</td><td>Codice 057C1-74A111-1001</td></tr><tr><td>Wafer di silicone&nbsp;</td>Forno convenzionale <td>SPE0039</td><td></td> <td>Eltech corperation</td></tr><tr><td></td><td>YEONG-SHIN company</td><td>ovp45</td><td></td></tr><tr><td>Pulitore al plasma</td><td>Nordson</td><td>AP-300</td><td>Sistema di trattamento al plasma da banco</td></tr><tr><td>SU-8 50 fotoresist negativo</td><td>MicroChem</td><td>Y131269</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 100 fotoresist negativo</td><td>MicroChem</td><td>Y131273</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Synrex Co., Ltd.</td><td>SC-HMI 2 "~ 6"</td><td></td></tr> <tr><td>Piastra riscaldante</td><td>YOTEC azienda</td><td>YS-300S</td><td></td></tr><tr><td>Msak allineatore</td><td>Deya Optronic CO.</td><td>A1K-5-MDA</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 sviluppatore</td><td>Grand Chemical Companies</td><td>GP5002-000000-72GC</td><td>Glicole propilenico monometil etere acetato</td></tr><tr><td>Profilometro laser a scansione</td><td>KEYENCE</td><td>VK-X 100</td><td></td></tr><tr><td>Trichlorosilane</td><td>Gelest, Inc</td><td>SIT8174.0</td><td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetraidroottil. Rischioso. Corrosivo per le vie respiratorie, reagisce violentemente con l'acqua.</td></tr><tr><td>Essiccatore</td><td>Bel-Art Products</td><td>F42020-0000</td><td>Essiccatore sottovuoto salvaspazio 190&nbsp; mm base bianca</td></tr><tr><td>Kit polidimetilsilossano (PDMS)</td><td>Dow corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Harris Uni-Core perforatore</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>15072</td><td>con diametro interno di 0,75 mm</td></tr><tr><td>Nastro rimovibile</td><td>3M Company</td><td>Scotch Nastro rimovibile 811</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica E24</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Tecnologia Bersing</td><td>ALB001.500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM terreno basale</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Thermo Hyclone</td><td>SH30071.03HI</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotici</td><td>Biowest</td><td>L0014-100</td><td>Glutammina-Penicillina-Streptomicina</td></tr><tr><td>Miscela enzimatica ricombinante</td><td>Tecnologia cellulare innovativa</td><td>AM-105</td><td>Accumax</td></tr><tr><td>DiIC12 (3) colorante a membrana cellulare</td><td>BD Biosciences</td><td>354218</td><td>Utilizzato come tracker cellulare</td></tr><tr><td>Pompa a siringa</td><td>Harvard Apparecchio</td><td>703007</td><td></td></tr> plastica <tr><td> siringa (1 ml)</td><td>BD Biosciences</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>aghi smussati calibro 23</td><td>Ever Sharp Technology, Inc.</td><td>TD21</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in politetrafluoroetilene (PTFE)</td><td>Ever Sharp Technology, Inc.</td><td>Diametro interno TFT-23T</td><td>, 0,51&nbsp; millimetro; diametro esterno, 0,82&nbsp; millimetro</td></tr></tbody></table>

una piattaforma microfluidic per l&#39;isolamento single-cell high-throughput e cultura

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studiare l'eterogeneità delle singole cellule è fondamentale per molte questioni biologiche, ma è tecnicamente difficile. Pertanto, c'è bisogno di un metodo semplice, ma ad alto rendimento, per eseguire esperimenti di coltura di singole cellule. Qui, riportiamo una strategia basata su chip microfluidico per l'isolamento di singole cellule ad alta efficienza (~77%) e dimostriamo la sua capacità di eseguire colture di singole cellule a lungo termine (fino a 7 giorni) e analisi di eterogeneità cellulare utilizzando il saggio clonogenico. Queste applicazioni sono state dimostrate con cellule staminali neurali di topo KT98 e cellule tumorali umane A549 e MDA-MB-435. L'elevata efficienza di isolamento di una singola cellula e la capacità di coltura a lungo termine si ottengono utilizzando micropozzetti di diverse dimensioni sulla parte superiore e inferiore del canale microfluidico. L'array di micropozzetti piccoli è progettato per isolare con precisione singole cellule, mentre l'array di micropozzetti grande viene utilizzato per la coltura clonale di singole cellule nel chip microfluidico. Questa piattaforma microfluidica costituisce un approccio interessante per le applicazioni di coltura di singole cellule, grazie alla sua flessibilità di spazi di coltura cellulare regolabili per diverse strategie di coltura, senza diminuire l'efficienza di isolamento.

La piattaforma microfluidica per l&#39;isolamento e la coltura singola cella comprende un microcanale (200 micron di altezza) con due serie di matrici di micropozzetti (Figura 2A). Le due serie di array di pozzetti sono definiti come la cattura-bene (25 micron di diametro e 27 micron di profondità) e la cultura-bene (285 micron di diametro e 300 micron di profondità) per l&#39;isolamento a cella singola e cultura, rispettivamente, e ogni cattura-well è posizionata al cen...

Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento e la coltura di singole cellule con una piattaforma microfluidica, che utilizza un nuovo concetto di progettazione di micropozzetti per consentire l'isolamento di singole cellule ad alta efficienza e la coltura clonale a lungo termine.

Una piattaforma Microfluidic per l&#39;isolamento Single-cell high-throughput e cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è dimostrare la fabbricazione e il funzionamento di un chip microfluidico, che permette l'isolamento e la coltura ad alta efficienza di singole cellule. Questo metodo fornisce uno strumento utile per qualsiasi settore che possa trarre vantaggio dall'isolamento e dalla coltura di singole cellule. Il principale vantaggio di questa tecnica è la sua elevata efficienza nel caricare singole cellule in array di micropozzetti di grandi dimensioni.Inoltre, per far funzionare il dispositivo vengono utilizzati esclusivamente un flusso delicato e la forza di gravità, il che minimizza il danno cellulare. L'applicazione di questa tecnica è rivolta alla diagnosi finale di malattie umane come il cancro, in cui l'eterogeneità cellulare influisce sulla risposta della cellula; abbiamo avuto l'idea di sviluppare questo metodo mentre stavamo stabilendo una linea cellulare in micropozzetti, poiché il metodo di diluizione limite risultava molto lungo e inefficiente. Oggi questo metodo può fornire informazioni dettagliate sull'analisi della singola cellula.È inoltre applicabile ad altre applicazioni, come la definizione e il controllo temporale dell'osservazione del percorso e del comportamento di singole cellule. Per iniziare, preparare stampi master silanizzati sia per lo strato di isolamento delle singole cellule sia per lo strato di coltura in micropozzetti, utilizzando la fotolitografia standard come descritto nel protocollo testuale allegato. Per ciascuno stampo master, mescolare 16 grammi di base PDMS con 1,6 grammi di agente indurente in un bicchiere monouso, e agitare le miscele fino a completo amalgama.Quindi, posizionare gli stampi master in piatti di Petri da 150 millimetri e versare il PDMS sopra gli stampi. Posizionare i piatti di Petri in un essiccatore e applicare il vuoto per un'ora per rimuovere le bolle d'aria dal PDMS. Dopo un'ora, rimuovere i piatti dall'essiccatore e collocarli in un forno tradizionale a 65 gradi Celsius per tre-sei ore per polimerizzare il PDMS.Quindi, rimuovere le piastre dal forno e lasciarle raffreddare a temperatura ambiente. Una volta raffreddate, staccare l'array di pozzetti di cattura in PDMS reticolato e l'array di coltura a micropozzetti dagli stampi principali e tagliare i dispositivi utilizzando una lametta. Successivamente, utilizzare un punzone da 0,75 millimetri per creare un foro a ciascuna estremità del microcanale sul livello dell'array di pozzetti di cattura.Utilizzare del nastro per pulire la superficie che diventerà la faccia interna del dispositivo, quindi posizionare i singoli strati con le superfici interne rivolte verso l'alto in un pulitore al plasma per un breve trattamento al plasma di ossigeno. Al termine, rimuovere gli strati in PDMS dal pulitore al plasma e utilizzare un microscopio stereoscopico per allineare e unire gli strati superiore e inferiore del dispositivo. Posizionare il dispositivo allineato in un forno a 65 gradi Celsius per 24 ore per creare un legame permanente tra gli strati in PDMS.Successivamente, posizionare il dispositivo in PDMS legato in acqua deionizzata e mettere il contenitore in un essiccatore sotto vuoto per 15 minuti, al fine di rimuovere l'aria dal microcanale del dispositivo. Dopo aver rimosso completamente l'aria dal dispositivo, posizionare il dispositivo in PDMS in una cappa a flusso laminare per colture cellulari e utilizzare la luce UV per sterilizzare la superficie del dispositivo per 30 minuti. Successivamente, sostituire l'acqua deionizzata nel dispositivo con albumina sierica bovina al 5% in PBS e incubare il dispositivo a 37 gradi Celsius per 30 minuti.Questo bloccherà la superficie e migliorerà l'efficienza di trasferimento delle cellule isolate dai pozzetti di cattura ai pozzetti di coltura. Dopo 30 minuti, sostituire la soluzione di blocco nel dispositivo con PBS sterile. Preparare una sospensione di singole cellule con 2,5 milioni di cellule per millilitro e caricare una pipetta con 50 microlitri della sospensione.Quindi, trasferire le cellule nel dispositivo attraverso il foro di uscita del dispositivo. Caricare altri 50 microlitri della sospensione cellulare e trasferirli nel dispositivo attraverso il foro di ingresso, in modo da riempire uniformemente l'intero microcanale con le cellule. Una volta caricato, utilizzare un tappo sterile realizzato con filo da pesca in nylon del diametro di un millimetro per sigillare il foro di uscita del dispositivo.Quindi, riempire una siringa sterile da un millilitro con mezzo di coltura, espellere eventuali bolle d'aria residue e inserirla nella pompa per siringa. Collegare un ago smussato da 23 gauge alla siringa e utilizzare un tubo in politetrafluoroetilene per connettere l'ago all'ingresso del dispositivo. Dopo aver collegato il tubo, rimuovere il tappo dal foro di uscita e attendere due minuti mentre le cellule si depositano nei pozzetti di cattura singola per forza di gravità.Successivamente, impostare la pompa per siringa a 600 microlitri al minuto. Rimuovere il tappo di uscita e lavare via le cellule non catturate per 30 secondi. Attendere due minuti per permettere al pressione di stabilizzarsi.Quindi rimuovere il tubo dall'ingresso del dispositivo e sigillare sia i fori di ingresso che di uscita con tappi per formare un sistema di coltura chiuso. Ora capovolgere il dispositivo manualmente per trasferire le singole cellule catturate nelle micropozzette di coltura sull'altro lato del dispositivo. Successivamente, posizionare il dispositivo in una piastra di coltura tessutale da 100 millimetri, aggiungere 10 millilitri di PBS sterilizzato attorno al dispositivo e inserire la piastra in un incubatore.Per sostituire il mezzo di coltura, posizionare prima due gocce di mezzo di coltura sulla parte superiore del dispositivo in PDMS vicino all'ingresso e all'uscita, per evitare di introdurre bolle d'aria nel microcanale. Successivamente, utilizzare una punta da biopsia da 0,75 millimetri per praticare due fori sulla parte superiore del dispositivo in PDMS, in prossimità delle estremità del microcanale. Accertarsi di perforare soltanto lo strato superiore del dispositivo.Successivamente, riempire una siringa di plastica da un millilitro contenente mezzo fresco preriscaldato ed utilizzare un ago ottuso da 23 gauge e un tubo in PTFE per collegarla al nuovo porto di ingresso. Far affluire lentamente circa 120 microlitri di mezzo fresco nel dispositivo nell'arco di cinque minuti per sostituire il mezzo vecchio. Al termine, sigillare i porti di ingresso e di uscita utilizzando due tappi ed inserire nuovamente il dispositivo nell'incubatrice per colture cellulari.Il numero di cellule che finiscono nelle camere di cattura varia dal circa 68% all'85%, a seconda del tipo di cellula. Inoltre, la maggior parte delle camere di cattura contiene una sola cellula, per tutti e tre i tipi cellulari. Dopo il trasferimento delle cellule KT98 catturate nelle camere di coltura, circa il 77% delle camere presentava una sola cellula, il 16% non aveva cellule, il 6% conteneva due cellule e meno dell'1% delle camere aveva tre o più cellule.Nel corso di sette giorni, le singole cellule isolate hanno mostrato pattern di crescita eterogenei. Mentre alcune cellule si sono moltiplicate, altre no. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa 20 minuti se effettuata correttamente.Dopo aver guardato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare questa piattaforma ad alto rendimento per l'isolamento di singole cellule e la coltura endocrina per aumentare la produttività dei propri esperimenti su singole cellule. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di evitare che bolle d'aria entrino nel microcanale e di prevenire l'aggregazione delle cellule nel tempo.

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