Una piattaforma Microfluidic per l'isolamento Single-cell high-throughput e cultura

L'obiettivo generale di questo protocollo è dimostrare la fabbricazione e il funzionamento di un chip microfluidico, che consente l'isolamento e la coltura di singole cellule ad alta efficienza. Questo metodo fornisce uno strumento utile per qualsiasi area che trarrebbe vantaggio dall'isolamento e dalla coltura di singole cellule. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è altamente efficiente nel caricare singole celle in grandi array di micropozzetti.

Inoltre, per far funzionare il dispositivo vengono utilizzati solo un flusso delicato e la forza gravitazionale, il che riduce al minimo il danno cellulare. L'implicazione di questa tecnica è rivolta verso la diagnosi finale di malattie umane come il cancro, in cui l'eterogeneità cellulare influisce sulla risposta della cellula, quindi ci è venuta l'idea di sviluppare questo metodo quando stavamo creando una linea cellulare a micropozzetti, perché il metodo di diluizione limite richiedeva molto tempo ed era inefficiente. Ora questo metodo può fornire informazioni sull'analisi delle singole cellule.

Può anche essere applicato ad altre applicazioni come la definizione e la tempistica dell'osservazione del decorso e del comportamento delle singole cellule. Per iniziare, fabbricare stampi master silanizzati sia per lo strato di isolamento a singola cellula che per lo strato di coltura a micropozzetti, utilizzando la fotolitografia standard come descritto nel protocollo di testo allegato. Per ogni stampo master, unire 16 grammi di base PDMS con 1,6 grammi di un agente indurente in una tazza usa e getta e mescolare le miscele fino a quando non saranno ben amalgamate.

Quindi, posizionare gli stampi master in piastre di Petri da 150 millimetri e versare il PDMS sopra gli stampi. Posizionare le piastre di Petri in un essiccatore e applicare il vuoto per un'ora per rimuovere le bolle d'aria dal PDMS. Dopo un'ora, togliete i piatti dall'essiccatore e metteteli in un forno convenzionale a 65 gradi Celsius per tre-sei ore per polimerizzare il PDMS.

Quindi, togliete le pirofile dal forno e lasciatele raffreddare a temperatura ambiente. Una volta raffreddato, staccare l'array di pozzetti di cattura PDMS polimerizzato e l'array di coltura a micropozzetti dagli stampi master e ritagliare i dispositivi utilizzando una lama di rasoio. Quindi, utilizzare un punzone da 0,75 millimetri per creare un foro a ciascuna estremità del microcanale sullo strato dell'array del pozzetto di cattura.

Utilizzare del nastro adesivo per pulire quella che diventerà la superficie interna del dispositivo, quindi posizionare i singoli strati con le superfici interne rivolte verso l'alto in un pulitore al plasma per un breve trattamento al plasma di ossigeno. Al termine, rimuovere gli strati PDMS dal pulitore al plasma e utilizzare uno stereomicroscopio per allineare e collegare gli strati superiore e inferiore del dispositivo. Posizionare il dispositivo allineato in un forno a 65 gradi Celsius per 24 ore per creare un legame permanente tra gli strati PDMS.

Quindi, immergere il dispositivo PDMS incollato in acqua deionizzata e posizionare il contenitore in un essiccatore sottovuoto per 15 minuti, in modo da rimuovere l'aria dal microcanale del dispositivo. Con tutta l'aria ora rimossa dal dispositivo, posizionare il dispositivo PDMS in una cappa di coltura tissutale e utilizzare la luce UV per sterilizzare la superficie del dispositivo per 30 minuti. Quindi, sostituire l'acqua deionizzata nel dispositivo con il 5% di albumina sierica bovina in PBS e incubare il dispositivo a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Ciò bloccherà la superficie e migliorerà l'efficienza di trasferimento delle cellule isolate dai pozzetti di cattura ai pozzetti di coltura. Dopo 30 minuti, sostituire la soluzione bloccante nel dispositivo con PBS sterile. Preparare una sospensione a cellula singola con 2,5 milioni di cellule per millilitro e caricare una pipetta con 50 microlitri di sospensione.

Quindi, trasferire le celle nel dispositivo attraverso il foro di uscita del dispositivo. Caricare altri 50 microlitri della sospensione cellulare e trasferirla nel dispositivo attraverso il foro di ingresso per riempire uniformemente l'intero microcanale con le celle. Una volta caricato, utilizzare un tappo sterile ricavato da una lenza in nylon di diametro millimetrico per sigillare il foro di uscita del dispositivo.

Quindi, riempire una siringa sterile da un millilitro con terreno di coltura, espellere eventuali bolle d'aria residue e inserirla nella pompa a siringa. Collegare un ago smussato calibro 23 alla siringa e utilizzare un tubo in politetrafluoroetilene per collegare l'ago all'ingresso del dispositivo. Dopo aver collegato il tubo, rimuovere il tappo dal foro di uscita e attendere due minuti mentre le celle si depositano nei pozzetti di cattura delle singole celle per forza gravitazionale.

Quindi, impostare la pompa a siringa a 600 microlitri al minuto. Rimuovere il tappo di uscita e lavare via le celle non catturate per 30 secondi. Attendere due minuti affinché la pressione si stabilizzi.

Quindi rimuovere il tubo dall'ingresso del dispositivo e sigillare sia i fori di ingresso che quelli di uscita con tappi per formare un sistema di coltura chiuso. Ora capovolgi il dispositivo a mano per trasferire le singole cellule catturate nei micropozzetti di coltura sull'altro lato del dispositivo. Quindi, posizionare il dispositivo in una piastra di coltura tissutale da 100 millimetri, aggiungere 10 millilitri di PBS sterilizzato attorno al dispositivo e posizionare la piastra in un'incubatrice.

Per sostituire il terreno di coltura, posizionare prima due goccioline di terreno di coltura sopra il dispositivo PDMS vicino all'ingresso e all'uscita per evitare l'introduzione di bolle d'aria nel microcanale. Quindi, utilizzare un perforatore per biopsia da 0,75 millimetri per praticare due fori dalla parte superiore del dispositivo PDMS vicino alle estremità del microcanale. Assicurati di perforare solo lo strato superiore del dispositivo.

Quindi, riempire una siringa di plastica da un millilitro contenente un terreno fresco preriscaldato e utilizzare un ago smussato calibro 23 e un tubo in PTFE per collegarla alla porta di ingresso appena creata. Far scorrere lentamente circa 120 microlitri di terreno fresco nel dispositivo in cinque minuti per sostituire il vecchio terreno. Al termine, sigillare le porte di ingresso e uscita utilizzando due tappi e rimettere il dispositivo nell'incubatore per colture cellulari.

Il numero di cellule che finiscono nei pozzetti di cattura varia da circa il 68% all'85% a seconda del tipo di cellula. Inoltre, la maggior parte dei pozzetti di cattura contiene una sola cellula, per tutti e tre i tipi di cellule. Dopo il trasferimento delle cellule KT98 catturate ai pozzetti di coltura, circa il 77% dei pozzetti aveva una sola cellula, il 16% non aveva cellule, il 6% aveva due cellule e meno dell'1% dei pozzetti aveva tre o più cellule.

Nel corso di sette giorni, singole cellule isolate hanno mostrato modelli di crescita eterogenei. Mentre alcune cellule si sono moltiplicate, altre no. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa 20 minuti se eseguita correttamente.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare questa piattaforma di coltura endocrina con isolamento di singole cellule ad alto rendimento per aumentare la produttività dei tuoi esperimenti su singola cellula. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di evitare che le bolle d'aria entrino nel microcanale e di evitare che le cellule si aggreghino con il passare del tempo.