Introduction
ويتحقق وضع حاليا الخلايا واحدة على حدة في فضاء الثقافة عادة باستخدام الحد من التخفيف أو مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS). بالنسبة لكثير من المختبرات، والحد من التخفيف هو وسيلة مريحة، لأنه يتطلب فقط ماصة والأنسجة لوحات الثقافة، والتي هي متاحة بسهولة. في هذه الحالة، يتم المخفف تعليق خلية متسلسل إلى كثافة الخلية المناسبة، ومن ثم وضعها في آبار الثقافة باستخدام ماصة اليدوية. ثم يتم استخدام هذه الخلايا وحيدة compartmented لتحليل الخلايا، مثل التباين الجيني فحص (1) ومستعمرة تشكيل 2. ومع ذلك، وهذه الطريقة منخفضة الإنتاجية والعمالة الكثيفة، دون اللجوء إلى استخدام ذراع روبوتية لمساعدة، لأن طبيعة توزيع بواسون من طريقة التخفيف الحد من تقيد الأحداث وحيدة الخلية إلى احتمال الحد الأقصى من 37٪ 3. يمكن آلات FACS مع الذراع الروبوتية متكامل التغلب على الحد من توزيع بواسون التي كتبها بدقة PLACجي خلية واحدة في الثقافة بشكل جيد في وقت 4. ومع ذلك، فإن ارتفاع إجهاد القص الميكانيكية (وبالتالي، خفضت بقاء الخلية) 5 وشراء آلة والتكاليف التشغيلية محدودة استخدامه في العديد من المختبرات.
للتغلب على القيود المذكورة أعلاه، تم وضع أجهزة الميكروسكيل لبكفاءة عالية تحميل الخلايا وحيدة في microwells 6. ومع ذلك، فإن microwells لا توفر مساحة كافية للخلايا تحميل لتتكاثر، وذلك بسبب الحاجة إلى جعل حجم كل microwell قريب من خلية واحدة لتحقيق أقصى قدر من وحيد الخلية احتمال التحميل. كما يطلب فحوصات الثقافة في العديد من التطبيقات المستندة إلى خلية (على سبيل المثال، فحص مولد الرمع 7)، microwells أكبر (90-650 ميكرون في القطر أو في طول الجانب) كما تم استخدامها للسماح للثقافات خلية طويلة. ومع ذلك، مثل طريقة التخفيف الحد، فإنها تمتلك أيضا منخفضة وحيدة الخلية الكفاءات تحميل، تتراوح بين 10 - 30٪ 89
سابقا، قمنا بتطوير منصة عالية الإنتاجية ميكروفلويديك لعزل الخلايا وحيدة في microwells الفردية وإظهار تطبيقه في فحص مولد الرمع للخلايا معزولة. وقدم 10 على الجهاز مع بولي dimethylsiloxane (PDMS)، وتضم مجموعتين من صفائف microwell مع أحجام microwell المختلفة، التي يمكن أن تحسن إلى حد كبير كفاءة في تحميل خلية واحدة في microwell له حجم أكبر بكثير من الخلايا. والجدير بالذكر أن يسمح هذا "ثنائي جيد" مفهوم حجم منطقة ثقافة لتعديلها بمرونة دون التأثير على كفاءة القبض على خلية واحدة، مما يجعلها واضحة لضبط تصميم الجهاز لتناسب أنواع مختلفة من الخلايا والتطبيقات. وينبغي أن تكون هذه الطريقة ذات الكفاءة العالية ومفيدة لتجارب زراعة الخلايا على المدى الطويل للدراسات خلية التجانس وحيدة النسيلة إنشاء خط الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تم وضع التصاميم الضوئية الرئيسية لدينا تصنيع الجهاز ميكروفلويديك باستخدام التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD) والبرمجيات. ثم تم استخدامها في التصاميم لافتعال photomasks الكروم باستخدام خدمة تجارية. وقدمت الأجهزة PDMS باستخدام تقنيات الطباعة الحجرية الناعمة. 11
1. تصنيع قوالب ماستر بواسطة الطباعة الحجرية
- قبل عملية ضوئيه 12، استخدام رقائق السليكون 4 بوصة باعتبارها الركيزة ويذوى رقائق في الفرن التقليدي عند 120 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- تنظيف رقائق السليكون المجففة باستخدام الأكسجين العلاج البلازما في 100 واط لمدة 30 ثانية في نظافة البلازما.
- سخن اثنين سخانات عند 65 درجة مئوية و 95 درجة مئوية، على التوالي، لعملية الخبز التالية.
- معطف 5 غرام من مقاومة للضوء سلبي (PR) على رقائق السليكون تنظيفها من قبل المغطي تدور. تدور في 1200 دورة في الدقيقة (SU-8 50) لمدة 30 ثانية لإنتاج طبقة متناهية.
- وضع العلاقات العامةالمغلفة رقاقة على موقد محمى على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة وتحويلها إلى موقد مسخن آخر في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 33 دقيقة (100 ميكرون أنماط سميكة) لتنفيذ عملية خبز لينة.
- بعد الخبز، ووضع العلاقات العامة المغلفة رقاقة السيليكون على حامل من اليجنر مؤتمتة شبه قناع ومحاذاته إلى 25400 نقطة لكل بوصة الدقة الشفافية الضوئية الرئيسية.
- فضح العلاقات العامة المغلفة رقاقة السيليكون لضوء الأشعة فوق البنفسجية (365 نانومتر) بجرعة 500 ميغا جول / سم 2 لإنشاء نمط العلاقات العامة على رقاقة السيليكون.
- إزالة الرقاقة من اليجنر ووضعه على موقد لمرحلة ما بعد الخبز في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة.
- نقع رقائق في SU-8 مطور حل (البروبيلين جليكول monomethyl الأثير خلات، PGMEA) ليغسل العلاقات العامة uncrosslinked لمدة 12 دقيقة والجافة بلطف مع غاز النيتروجين لفضح علامات المحاذاة.
- مرة أخرى، ومعطف 5 غرام من مقاومة للضوء سلبي على رقائق من قبل المغطي تدور. تدور في 700 دورة في الدقيقة (SU-8 100) لمدة 30 ثانية و 1،200 دورة في الدقيقة (SU-8 10) لمدة 30 ثانية لمدة 300 &# 181؛ م نمط سميكة و 27 ميكرون نمط سميكة على التوالي لجعل طبقة microwell.
- وضع رقاقة العلاقات العامة المغلفة على موقد عند 65 درجة مئوية لمدة 4 دقائق وعلى 95 درجة مئوية لمدة 8 دقائق (27 ميكرون عميقة القبض جيدا طبقة)؛ وعند 65 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة وعند درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 110 دقيقة (300 ميكرون طبقة ثقافة بئر عميقة).
- بعد التبريد، ووضع العلاقات العامة المغلفة رقاقة السيليكون على اليجنر قناع مجهزة للأشعة فوق البنفسجية.
- فضح العلاقات العامة المغلفة رقاقة السيليكون لضوء الأشعة فوق البنفسجية (365 نانومتر) بجرعة 250 ميغا جول / سم 2 (27 ميكرون نمط سميكة) و 700 ميغا جول / سم 2 (300 ميكرون نمط سميك).
- خبز رقاق في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق (27 ميكرون نمط سميكة) و 30 دقيقة (300 ميكرون نمط سميك)، على التوالي.
- يغسل العلاقات العامة uncrosslinked من قبل PGMEA لمدة 6 دقائق (27 ميكرون نمط سميكة) و 25 دقيقة (300 ميكرون نمط سميك)، على التوالي، ومن ثم تجفيفها مع غاز النيتروجين.
- قياس ارتفاع نمط يتميز علىرقاقة مع profilometer المسح بالليزر عن طريق وضع رقاقة على مرحلة س ص من profilometer المسح بالليزر.
- ضبط البؤري لتظهر بوضوح ملامح نمط على الرقاقة باستخدام "عرض الكاميرا" واسطة المراقبة تحت 20X عدسة الهدف.
- تبديل وضع المراقبة من "وجهة نظر الكاميرا" إلى "عرض الليزر"، وتعيين المناصب العليا والسفلى من الميزات.
- ضبط وضع قياس، منطقة، والجودة، وض الملعب حتى شفاف (أعلى)، 1 خط (1،024 × 1)، عالية الدقة و 0.5 ميكرون، على التوالي، ثم اضغط على أسفل بداية لبدء القياس.
2. إعداد الأجهزة PDMS لعزل وحيدة الخلية
- قبل PDMS الصب، silanize القوالب رئيسية مع trichlorosilane لخلق سطح مسعور، مما يجعل من الاسهل لتقشر PDMS النسخ المتماثلة من القوالب الرئيسية.
- وضع القوالب الرئيسية وقارب الترجيح التي تحتوي على200 ميكرولتر من trichlorosilane في مجفف، وتطبيق فراغ (-85 كيلو باسكال) لمدة 15 دقيقة.
- وقف فراغ ثم تترك القوالب الرئيسية في مجفف لsilanize القوالب الماجستير في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على الأقل.
- إزالة القوالب الرئيسية من المجفف ووضع كل القالب الرئيسي في 10 سم طبق بتري.
- مزيج بمبلغ إجمالي قدره 17.6 غرام عدة PDMS البوليمر تحتوي على قاعدة وكيل علاج في نسبة 10: 1، ثم صب PDMS على القالب الرئيسي في طبق بيتري.
- وضع طبق بتري في مجفف وتطبيق فراغ (-85 كيلو باسكال) لمدة 1 ساعة لإزالة فقاعات الهواء في PDMS.
- إزالة طبق بيتري من المجفف ووضعه في الفرن التقليدي عند 65 درجة مئوية لمدة 3-6 ساعة لعلاج PDMS.
- إزالة PDMS المقلدة الشفاء من القوالب الرئيسية ولكمة اثنين من الثقوب بمثابة مدخل ومخرج على طرفي متناهية على مجموعة PDMS متماثلة القبض جيدا من قبل الناخس مع الداخلية-قطر 0.75 ملم لقناة الموائعية (الشكل 2A).
- استخدام شريط لتنظيف السطح من النسخ المتماثلة PDMS، ثم قم بوضع النسخ المتماثلة PDMS في نظافة البلازما لوجيزة علاج الأوكسجين البلازما (100 واط لمدة 14 ثانية).
- إزالة النسخ المتماثلة PDMS من آلة الأكسجين البلازما.
- محاذاة أعلى (التي تحتوي على microwells القبض) وPDMS القاع (التي تحتوي على microwells الثقافة) نسخة باليد تحت مجهر تشريحي وتقديمهم إلى الاتصال.
- ضع PDMS المقلدة الانحياز في الفرن على 65 درجة مئوية لمدة 24 ساعة لتحقيق الترابط الدائم بين النسخ المتماثلة PDMS لتشكيل الجهاز النهائي.
- نقع الجهاز PDMS في منزوع الأيونات (DI) حاوية مملوءة للمياه ووضع الحاويات في مجفف تحت فراغ (-85 كيلو باسكال) لمدة 15 دقيقة لإزالة الهواء من متناهية من الجهاز PDMS.
- وضع الجهاز PDMS مملوءة بالماء DI في نسيج الثقافة هود واستخدام الأشعة فوق البنفسجية (الطول الموجي للضوء: 254 نانومتر) لتعقيم الجهاز لمدة 30 ميلن.
- استبدال الماء DI في الجهاز PDMS مع 5٪ مصل بقري الزلال (BSA) في حل برنامج تلفزيوني 1X واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لمنع الخلايا من الالتصاق على سطح PDMS.
ملاحظة: طلاء BSA أمر بالغ الأهمية لتحسين كفاءة نقل الخلايا المعزولة من التقاط تماما لثقافة جيدا. - استبدال حل BSA 5٪ في الجهاز PDMS مع تعقيمها حل برنامج تلفزيوني 1X.
3. إعداد وحيدة الخلية تعليق
- ثقافة العصبية الجذعية KT98 الخلية، وسرطان البشري A549 خلية وMDA-MB-435 نحن في طبق بتري في حاضنة الثقافة الخلية التقليدية (37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2، و 95٪ رطوبة) لإعداد الخلايا لتجربة خلية جهاز PDMS .
- إزالة والتخلص من ثقافة المتوسط قضى (DMEM المتوسطة القاعدية المتوفرة مع 10٪ الجنين مصل بقري و 1٪ المضادات الحيوية) من الطبق الثقافة مع الخلايا المزروعة إلى 70-80٪ التقاء.
- يغسل بلطف الخلايا مع تعقيمها برنامج تلفزيوني ثلاث مرات. </ لى>
- إزالة والتخلص من برنامج تلفزيوني، وإضافة 2 مل من مزيج انزيم المؤتلف مع بروتين، حال الكولاجين، والأنشطة الدناز (يرجى الاطلاع على قائمة المواد للحصول على معلومات مفصلة).
- احتضان الطبق الثقافة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق، ثم اضغط على طبق ثقافة لتسهيل مفرزة الخلية.
- إضافة 4 مل من برنامج تلفزيوني تعقيمها لتفريق الخلايا، ومن ثم نقل تعليق خلية إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
- أنبوب الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 3 دقائق وإزالة طاف.
- resuspend بلطف بيليه خلية في 1 مل تعقيمها برنامج تلفزيوني وحساب عدد الخلايا الحية باستخدام معيار التريبان الأزرق طريقة استبعاد 13.
ملاحظة: هذه الخطوة إعادة تعليق أمر بالغ الأهمية لإعداد فصل جيدا تعليق وحيد الخلية إلى تحسين كفاءة العزل وحيدة الخلية.
4. عزل وحيدة الخلية والثقافة نسيلي
- تحميل 50 ميكرولتر من تعليق الخلية بتركيز 2،2-2،5 X10
- تحميل 50 ميكرولتر آخر من تعليق الخلية من خلال ثقب مدخل لملء بالتساوي حتى متناهية كاملة مع الخلايا.
- اغلاق فتحة منفذ مع المكونات (أ، 1 مم قطع النايلون خط الصيد 3 مم طويل) لتجنب تدفق الناجم عن الضغط الهيدروليكي من قطرات على مدخل ومخرج الثقوب.
ملاحظة: كانت المقابس الأشعة فوق البنفسجية تعقيم داخل الثقافة غطاء محرك السيارة الأنسجة قبل استخدامها. - تملأ 1 مل محقنة معقمة مع مستنبت، إخراج فقاعات الهواء منها، وإعداده على ضخ حقنة.
- ربط المتوسطة تحميل الحقنة لثقب مدخل الجهاز PDMS عبر 23 G إبرة حادة و(PTFE) أنابيب البولي tetrafluoroethene.
- إزالة المكونات من ثقب منفذ وجميعآه فترة زمنية 2-دقيقة للسماح للخلايا ليستقر في خلية واحدة القبض على الآبار بواسطة قوة الجاذبية.
- يغسل خلايا uncaptured مع 300 ميكرولتر من مستنبت بمعدل تدفق 600 ميكرولتر / دقيقة يقودها ضخ حقنة.
- الانتظار لمدة 2 دقيقة لتحقيق الاستقرار في الجهاز، وختم مدخل ومخرج الثقوب بسدادات لتشكيل نظام الاستزراع المغلق.
- الوجه الجهاز باليد إلى نقل الخلايا وحيدة القبض على microwells الثقافة.
- وضع الجهاز PDMS في صحن زراعة الأنسجة 100 ملم، وإضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني تعقيم حول الجهاز لتجنب ثقافة تبخر المتوسط من متناهية.
- نقل الطبق الثقافة الحاضنة التقليدية الثقافة الخلية (37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2، و 95٪ الرطوبة) للثقافة نسيلي من الخلايا واحدة.
5. الثقافة المتوسطة التجديد
- بعد 1 د الثقافة واستبدال مستنبت في الجهاز PDMS مع متوسطة جديدة لتحسين العلاقات العامة خليةoliferation.
- وضع اثنين من قطرات من مستنبت على رأس الجهاز PDMS بالقرب من المناطق مدخل ومخرج الثقوب لتجنب إدخال فقاعات الهواء إلى متناهية أثناء تنفيذ الخطوة التالية.
- لكمة اثنين من الثقوب من الجزء العلوي من الجهاز PDMS بالقرب من طرفي متناهية بمثابة مدخل ومخرج للمتناهية.
ملاحظة: لا لكمة من خلال بأكملها طبقتين من الجهاز PDMS. بدلا من ذلك، فقط لكمة من خلال الطبقة العليا من PDMS. - توصيل حقنة بلاستيكية 1 مل يحتوي متوسطة جديدة إلى مدخل طريق 23 G إبرة حادة وPTFE الأنابيب.
- تدفق المتوسطة 120 ميكرولتر جديدة في الجهاز لمدة 5 دقائق ليحل محل المتوسطة من العمر.
- إدراج اثنين من المقابس لاغلاق مدخل ومخرج الثقوب، ويعود الجهاز إلى حاضنة الثقافة الخلية.
- تحديث مستنبت كل د 2 خلال الفترة الثقافة عن طريق إزالة المقابس الختم، تليها بتكرار الخطوات 5،4-5،5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتضم منصة ميكروفلويديك لعزل وحيدة الخلية وثقافة متناهية (200 ميكرومتر في الطول) مع مجموعتين من صفائف microwell (الشكل 2A). ويطلق على مجموعتين من صفائف microwell كما القبض جيدا (25 ميكرون في القطر و 27 ميكرون في العمق) والثقافة بشكل جيد (285 ميكرون في القطر و 300 ميكرومتر في العمق) لعزل وحيدة الخلية والثقافة، على التوالي، ولكل يتم وضع التقاط جيدا في مركز ثقافة جيدا عندما ينظر إليها من أعلى إلى عرض (الشكل 2B). لتشغيل الجهاز (ويتضح تدفق عملية التخطيطي في الشكل 1)، والمعدات المطلوبة (ضخ حقنة، حاضنة زراعة الأنسجة، والمجاهر) واللوازم (حقنة، ماصة، والأنابيب) تتوفر عادة في المختبرات البيولوجية. وعلاوة على ذلك، سمحت قابلية وشفافية منصة الخلايا ما يمكن ملاحظته بسهولة وتحليلها في جهاز مع convenالمجهر tional خلال تجربة زراعة الخلايا.
كفاءة التقاط الخلايا في القبض على الآبار بعد النطاقات غسل خطوة من 67.80 ± 11.38٪ إلى 85.16 ± 1.91٪ (اعتمادا على نوع من الخلايا) (الشكل 3A). وعلاوة على ذلك، فإن معظم أسر الآبار تحتوي فقط على خلية واحدة لجميع أنواع ثلاثة الخلية (89.89٪ - 92.98٪)، وهو ما أكده تحليل عدد من خلايا محملة في الثقافة الآبار (الشكل 3B). كانت وحيدة الخلية كفاءة العزلة النهائية في الثقافة الآبار أكثر من 76٪ لKT98 وMDA-MB-435 الخلايا، ولكن 61٪ فقط للخلايا A549 بسبب الخلافات حجم الخلية بين أنواع الخلايا التي تم اختبارها.
لأبحاث السرطان، فحص مولد الرمع للخلايا وحيدة يمكن استخدامها لاختبار مقاومة العقاقير ومعدلات انتشار المستعمرات خلية فردية. ثقافة الخلية وفحص مولد الرمع من الخلايا وحيدة معزولة في موقعنا عأجريت latform عن طريق تحديث مستنبت كل د 2. هذه التظاهرة تسلط الضوء على تطبيق هذا الجهاز لدراسة التباين الخلوية على مستوى خلية واحدة عن طريق قياس الفروق في بقاء الخلية ومعدلات انتشار الخلايا الفردية.
تم تحليل التباين وانتشار معدل الخلوي للخلايا معزولة من الصور المكتسبة يوميا. وأظهرت النتائج أن الخلايا وحيدة معزولة يمكن تربيتها لمدة 7 د وعرضت أنماط النمو المختلفة. على سبيل المثال، كان 13٪ من خلايا معزولة لا انقسام الخلايا وظلت كما خلية واحدة (الشكل 4B)، في حين أن 17.5٪ من الخلايا تنقسم إلى أكثر من 15 الخلايا ومستعمرات الخلايا شكلت الشكل (4A) خلال الثقافة. ومما يدل على عدم التجانس الخلوية بين الخلايا المتكاثرة أيضا أنماط النمو المختلفة من تشكيل خليتين (4.3٪)، ثلاث خلايا (2.5٪)، و4-14 خلايا(15٪) في تجربة زراعة الخلايا (الشكل 4C).
وأشارت هذه النتائج إلى أن منصة يمكن استخدامها للثقافة على المدى الطويل الخلية، المقايسات مولد الرمع، والدراسات عدم التجانس الخلوية. وجود عدد كبير من المستعمرات الخلية الفردية التي تزرع في منطقة حجم صغير يجعل أيضا تحليل مجهري للخلايا أسهل.
ويتضمن الشكل 1. توضيح تخطيطي لتدفق العملية لعزل وحيدة الخلية عالية الإنتاجية والثقافة في منصة ميكروفلويديك إجراء عملية لعزل وحيدة الخلية والثقافة نسيلي 4 خطوات:. ط) خلايا الحمل في متناهية من قبل طرف البلاستيك و ماصة يدوي. ب) يغسل خلايا uncaptured مع مستنبت الطازجة يقودها ضخ حقنة. ج) بعد اغلاق مدخل ومخرج فتحات مع المقابس، وغيرتم نقل خلايا olated من القبض على الآبار للثقافة الآبار عن طريق التقليب الجهاز. والرابع) أداء ثقافة نسيلي (فحص مولد الرمع) في الثقافة الآبار. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. تصوير والصور ووزارة شؤون المرأة من عزلتها وحيدة الخلية والثقافة ميكروفلويديك منصة. (A) منصة ميكروفلويديك محملة الصبغة الحمراء التي تظهر متناهية وmicrowell هياكل للثقافة وحيدة الخلية. (ب) صورة الممثلة المأخوذة من جهاز قطع، والتي تبين-عرض الجانب من ثلاثة العزلة وثقافة نسيلي وحدة وحيدة الخلية في منصة ميكروفلويديك. شريط مقياس: 100 ميكرون. الصور ووزارة شؤون المرأة للثقافة وحيدة الخلية (C) والقبض على (D الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. KT98، A549، وMDA-MB-435 وحيدة الخلية كفاءة العزل في منصة ميكروفلويديك. (أ) كفاءة KT98، A549، والخلايا 435 MDA-MB-المأسورة في القبض على الآبار بعد تجرف الخلايا uncaptured . وكانت كفاءة القبض على خلايا من 67.80٪ إلى 85.16٪ في أنواع الخلايا الثلاث. كان (ب) نسبة وحيدة الخلية في إجمالي ثقافة الآبار (شريط مائل) أكثر من 76٪ لKT98 وMDA-MB-435، ولكن 61.63٪ لA549. (C) صورة تمثيلية من KT98 فرد خلايا وحيدة(الأحمر والملون مع خلية تعقب) معزولة الى حد كبير ثقافة الآبار للثقافة نسيلي. شريط مقياس: 300 ميكرون. (D) عدد الخلايا في خلية المحتلة ثقافة الآبار من طراز خلية KT98. كانت نسبة ثقافة الآبار 77.3٪ مع وحيدة الخلية، 16.31٪ مع عدم وجود الخلايا، 5.96٪ مع خليتين، و 0.43٪ مع أكثر من ثلاث خلايا. تمثل أشرطة الخطأ كما ± SD. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. خلية ثقافة، فحص مولد الرمع، ودراسة التجانس الخلوية من خلايا A549 المعزولة في منصة ميكروفلويديك لمدة 7 د. (A) نمت هناك وحيدة الخلية معزولة وانتشرت إلى مستعمرة خلية في ثقافة جيدا. (ب) نجا من خلية واحدة معزولة، ولكن لم تقسم بعد 7 أيامالثقافة. شريط مقياس: 100 ميكرون. (ج) خلايا وحيدة منعزلة عرضت أنماط نمو غير متجانسة بعد أن تربيتها لمدة 7 أيام. تمثل أشرطة الخطأ كما ± SD. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نظم جهاز المستندة إلى Microwell استخدمت 6،14 للتلاعب وحيدة الخلية والتحليل، مثل خلية واحدة على نطاق واسع لظاهرة الاحتباس 6 واحد الجذعية المكونة للدم تكاثر الخلايا 15. وعلى الرغم من حجم جيد والعدد والشكل يمكن تعديلها لتطبيقات محددة، ودائما يؤثر سلبا على كفاءة العزل وحيدة الخلية عندما يتم زيادة حجم البئر. 9،15
للتغلب على هذا القيد، ذكرت بارك آخرون شريحة ميكروفلويديك مع microwells الثلاثي التي لديها عالية وحيدة الخلية محاصرة معدل (58.34٪)، في حين يتم تكبير حجم microwell للسماح لنشر الخلايا والنمو. ومع ذلك، يمكن للmicrowells (مع طول الجانب ~ 50 ميكرون) فقط دعم انتشار الخلايا لمدة تصل إلى 2 د. تتيح 16 استراتيجيتنا ثنائي جيد تحميل وحيدة الخلية في microwells الكبيرة ألا تكون محدودة بسبب احتمال بواسون اجه التوزيع في الحد diluطرق نشوئها وأنظمة جيدا مفتوحة 3، كما يتبين من خلال توفير كفاءة عالية العزلة وحيدة الخلية (أكثر من 75٪) في microwells الكبيرة التي كانت كافية للتكاثر الخلايا للا يقل عن 7 د (الشكل 4A) الحجم. نظرا لقدرتها على أداء بكفاءة عالية العزلة وحيدة الخلية والثقافة نسيلي مع جهاز بسيط والإجراءات العملية، ونحن نتصور أن لدينا منصة الموائع الدقيقة يمكن أن تشكل أداة مفيدة لمجموعة واسعة من التطبيقات، بما في ذلك السرطان الجذعية تحديد الخلية عن طريق فحص مولد الرمع 17 والإنتاجية العالية فحص cardiotoxicity المخدرات 18،19.
العيوب الرئيسية لللدينا وحيدة الخلية العزلة وثقافة منصة هو أنه لا يشكل مغلقة بشكل فردي ثقافة الآبار لمنع تداخل الإشارات بين الخلايا مثقف في الثقافة الآبار. ولذلك، فإن سلوك الخلايا قد تتأثر إفراز نظير الصماوي من الخلايا وحيدة معزولة أخرى في الجهاز ميكروفلويديك. وبعد التمديدالحد لها من برنامجنا هو الحاجة إلى إعداد نسبيا تعليق خلية ذات الكثافة العالية لكفاءة عالية العزلة وحيدة الخلية. هذا الاستهلاك خلية عالية يمكن أن تحد من التطبيقات من العزلة خلية نادرة والثقافة، مثل خلايا الخلط المائي.
قبل العملية الجهاز، فإنه من المهم لحقن المياه DI من ثقب مدخل لملء متناهية وبعناية مراقبة أي تسرب السوائل من الجهاز PDMS المستعبدين. تسرب السوائل يؤثر على حالة التدفق في متناهية مما قد يؤثر سلبا على القبض على الخلية ونتيجة نقل. وبالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن لدينا نتائج الدراسة وحيدة الخلية كفاءة التحميل تظهر منخفضة جدا فقدان الخلية بعد نقل الخلايا المعزولة من القبض على الآبار للثقافة الآبار، مشيرا إلى أن معظم الخلايا يمكن نقلها على نحو فعال عن طريق التقليب الجهاز، وانخفاض كفاءة نقل إذا لم يتم تنفيذ المعطل خطوة BSA (2.12) بشكل صحيح. ويمكن للمستخدمين تعديل بروتوكول BSA حجب أو استخدام الطرق ternative تعديل السطح لاحتياجاتها الخاصة تجربة خلية (على سبيل المثال، زيادة BSA تركيز أو طلاء الوقت عند استخدام نوع من الخلايا أكثر تمسكا). أبعاد الخلية القبض على الآبار هي العوامل المهيمنة، والتي تحتاج إلى أن يكون الأمثل للحصول على أفضل كفاءة تحميل وحيدة الخلية في القبض على الآبار، وهذا يتوقف على حجم ونوع خلية معينة من الفائدة. عالية متعددة الخلايا، في التقاط جيدا ومن المقرر إلى وجود حجم القبض أيضا كبير جدا لنوع من الخلايا في المصالح الأحداث، في حين أن انخفاض كفاءة الخلايا تحميل في البئر التقاط تعتبر مؤشرا على حجم القبض على رفاهية صغيرة جدا. ومن المهم أيضا للحد من مجموعات الخلايا في تعليق خلية واحدة مستعدة، كما مجموعات الخلايا يمكن أن تقلل من كفاءة التحميل وحيدة الخلية في القبض على الآبار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| SU-8 50 negative photoresist | MicroChem | Y131269 | |
| SU-8 100 negative photoresist | MicroChem | Y131273 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Scanning laser profilometer | KEYENCE | VK-X 100 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water. |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Space saver vacuum desiccator 190 mm white base |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15072 | with 0.75 mm inner-diameter |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bersing Technology | ALB001.500 | |
| DMEM basal medium | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Hyclone | SH30071.03HI | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| Recombinant enzyme mixture | Innovative cell technology | AM-105 | Accumax |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Plastic syringe (1 ml) | BD Biosciences | 309659 | |
| 23 gauge blunt needles | Ever Sharp Technology, Inc. | TD21 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
References
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. P Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).
- Shapiro, H. M. Practical flow cytometry. , John Wiley & Sons. (2005).
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456 (7223), 804-808 (2008).
- Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science. Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).
- Rettig, J. R., Folch, A. Large-scale single-cell trapping and imaging using microwell arrays. Anal. Chem. 77 (17), 5628-5634 (2005).
- Liu, J., et al. Soft fibrin gels promote selection and growth of tumorigenic cells. Nat Mater. 11 (8), 734-741 (2012).
- Charnley, M., Textor, M., Khademhosseini, A., Lutolf, M. P. Integration column: microwell arrays for mammalian cell culture. Integr. Biol. 1 (11-12), 11-12 (2009).
- Lindstrom, S., et al. High-density microwell chip for culture and analysis of stem cells. PloS one. 4 (9), e6997 (2009).
- Lin, C. H., et al. A microfluidic dual-well device for high-throughput single-cell capture and culture. Lab Chip. 15 (14), 2928-2938 (2015).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M.
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).
- Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H. Miniaturization of biological assays - Overview on microwell devices for single-cell analyses. Bba-Gen Subjects. 1810 (3), 308-316 (2011).
- Lecault, V., et al. High-throughput analysis of single hematopoietic stem cell proliferation in microfluidic cell culture arrays. Nat Methods. 8 (7), 581-593 (2011).
- Park, J. Y., et al. Single cell trapping in larger microwells capable of supporting cell spreading and proliferation. Microfluid Nanofluid. 8 (2), 263-268 (2010).
- Tirino, V., et al. Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization. FASEB J. 27 (1), 13-24 (2013).
- Chen, P. C., Huang, Y. Y., Juang, J. L. MEMS microwell and microcolumn arrays: novel methods for high-throughput cell-based assays. Lab Chip. 11 (21), 3619-3625 (2011).
- Liang, P., et al. Drug Screening Using a Library of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Reveals Disease-Specific Patterns of Cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
