Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Photostable जाती रंगों का उपयोग करके वेवलेंथ बदलने वाले डीएनए संकरण जांच के संश्लेषण

Published: July 6, 2016 doi: 10.3791/54121
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Institute of Organic Chemistry, Karlsruhe Institute of Technology
* These authors contributed equally

Abstract

इस प्रोटोकॉल में, हम 2'-alkyne के संश्लेषण के लिए एक विधि के मानक phosphoramidite रसायन विज्ञान का उपयोग कर संशोधित स्वचालित ठोस चरण संश्लेषण द्वारा deoxyribonucleic एसिड (डीएनए) किस्में प्रदर्शित करता है। Oligonucleotides के बाद कृत्रिम दो नए photostable जाती तांबा उत्प्रेरित क्लिक रसायन विज्ञान का उपयोग रंगों द्वारा चिह्नित कर रहे हैं। दोनों दाता और स्वीकर्ता डाई के संश्लेषण वर्णन किया गया है और लगातार तीन चरणों में किया जाता है। आसपास के वास्तुकला के रूप में डीएनए के साथ, इन दो रंगों के एक ऊर्जा हस्तांतरण से गुजरना जब वे संकरण से करीब निकटता में लाया जाता है। इसलिए, दो एकल असहाय डीएनए किस्में के annealing प्रतिदीप्ति रंग का एक परिवर्तन से कल्पना की है। यह रंग बदलने प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी के द्वारा होती है, लेकिन यह भी सीधे एक हाथ में पराबैंगनी (यूवी) दीपक का उपयोग करके देखा जा सकता है। एक दोहरी प्रतिदीप्ति रंग readout की अवधारणा इन oligonucleotide जांच आणविक इमेजिंग खासकर जब वर्णित फोटो के लिए उत्कृष्ट उपकरण बना देता हैtostable रंगों का इस्तेमाल किया जाता है। इस प्रकार, इमेजिंग जांच की photobleaching रोका जाता है, और जैविक प्रक्रियाओं एक लंबे समय अवधि के लिए वास्तविक समय में देखा जा सकता है।

Introduction

आण्विक इमेजिंग जीवित कोशिकाओं के भीतर जैविक प्रक्रियाओं को समझने के लिए एक बुनियादी तकनीक का प्रतिनिधित्व करता है। 1-3 ऐसे रासायनिक जैविक अनुप्रयोगों के लिए फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड आधारित जांच के विकास के एक विस्तार अनुसंधान के क्षेत्र बन गया है। ये फ्लोरोसेंट जांच में कुछ आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए सेल इमेजिंग के लिए उपयुक्त उपकरण बनने की जरूरत है। सबसे पहले, लागू रंगों उच्च मात्रा पैदावार के साथ प्रतिदीप्ति प्रदर्शन करना चाहिए, बड़े स्टोक्स 'परिवर्तन और, सबसे महत्वपूर्ण बात, उच्च photostabilities vivo इमेजिंग में लंबी अवधि की अनुमति है। और दूसरी बात, वे एक विश्वसनीय प्रतिदीप्ति readout दिखाना चाहिए। परम्परागत क्रोमोफोर-पीने की वस्तु-सिस्टम प्रतिदीप्ति तीव्रता में साधारण परिवर्तन द्वारा एक एकल प्रतिदीप्ति रंग के readout पर आधारित हैं। 4 यह दृष्टिकोण intracellular घटकों या कम संकेत करने वाली शोर अनुपात के autofluorescence के कारण झूठी सकारात्मक या नकारात्मक झूठी परिणामों का जोखिम भालू अन्य कॉम से अवांछित शमन के कारणघटकों। 4

हमने हाल ही में "डीएनए ट्रैफिक लाइट" है कि दो अलग अलग chromophores का उपयोग करके दोहरी प्रतिदीप्ति रंग readouts दिखाने की अवधारणा को सूचना दी। 5-6 अवधारणा ऊर्जा हस्तांतरण (ईटी) दाता डाई से स्वीकर्ता डाई जो प्रतिदीप्ति परिवर्तन करने पर आधारित है रंग (चित्रा 1 देखें)। यह एक अधिक विश्वसनीय readout की अनुमति देता है और इस तरह फ्लोरोसेंट इमेजिंग जांच के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है। फ्लोरोसेंट रंगों के साथ oligonucleotides की लेबलिंग दो अलग अलग दृष्टिकोण से प्राप्त किया जा सकता है। रंगों तदनुसार संशोधित phosphoramidite इमारत ब्लॉकों का उपयोग करके एक ठोस चरण पर रासायनिक डीएनए संश्लेषण के दौरान शामिल किया जा सकता है। इस विधि 7 रंगों कि मानक phosphoramidite और deprotection की शर्तों के तहत स्थिर रहे तक सीमित है। एक विकल्प के रूप में, के बाद सिंथेटिक संशोधन के तरीके oligonucleotide रसायन शास्त्र में स्थापित किए गए थे। यहाँ, हम अपने नए तस्वीरों में से एक के संश्लेषण का प्रदर्शनतालिका ऊर्जा हस्तांतरण जोड़े 8,9 और azides और alkynes (CuAAC) के बीच तांबा उत्प्रेरित 1,3-cycloaddition का उपयोग करके डीएनए के बाद सिंथेटिक लेबलिंग। 10

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सावधानी: उपयोग करने से पहले कृपया सभी प्रासंगिक सामग्री सुरक्षा डाटा शीट (MSDS) से परामर्श करें। इन syntheses में प्रयुक्त रसायनों के कई विषैले और कैंसर हो। सभी उचित सुरक्षा प्रथाओं कि आम तौर पर इस तरह के, एक प्रयोगशाला कोट पहने हुए सुरक्षा चश्मे और दस्ताने के रूप में जैविक रसायन विज्ञान प्रयोगशालाओं, में आवश्यक हैं का उपयोग करें।

1. रंगों का संश्लेषण

नोट: दोनों रंगों प्रतिक्रिया का एक ही प्रकार के द्वारा संश्लेषित किया जा सकता चित्रा 2 इन प्रतिक्रियाओं के एक सिंहावलोकन पता चलता है।।

  1. 1- (3-azidopropyl) के संश्लेषण -4 (2- (1-मिथाइल-1H-indol-3-YL) विनाइल) pyridin-1-IUM आयोडाइड (डाई 1)
    1. 1- (3-iodopropyl) -4-methylpyridin-1-IUM आयोडाइड का संश्लेषण (चित्रा 2A, कदम एक)
      1. भंग 466 मिलीग्राम 4-picoline और 5.91 छ एक 20 मिलीलीटर दौर से गुजर शीशी में acetonitrile के 10 मिलीलीटर में 1,3-diiodopropane और एक पट टोपी से कसकर सील।
      2. 16 घंटे के लिए 85 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्मी।
      3. आरटी को शांत करने के लिए है, तो एक घूमनेवाला बाष्पीकरण का उपयोग कर कम दबाव के तहत विलायक हटाने की अनुमति दें।
      4. अवशिष्ट तेल के लिए एथिल एसीटेट के 20 मिलीलीटर जोड़ें और 3 मिनट के लिए एक 120 डब्ल्यू अल्ट्रासोनिक स्नान में मिश्रण का इलाज।
      5. निस्पंदन द्वारा गठित वेग लीजिए और एथिल एसीटेट के साथ पांच बार धो लें। वैक्यूम हे / एन के तहत ठोस उत्पाद सूखी।
    2. 1- (3-azidopropyl) -4-methylpyridin-1-IUM के संश्लेषण (चित्रा 2A, कदम ख)
      1. 900 मिलीग्राम 1- (3-iodopropyl) एक 20 मिलीलीटर दौर से गुजर शीशी में acetonitrile की 12 मिलीलीटर में -4-methylpyridin-1-IUM आयोडाइड भंग सोडियम azide की 376 मिलीग्राम जोड़ने के लिए, और एक पट टोपी से कसकर सील।
      2. 16 घंटे के लिए 85 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्मी।
      3. आरटी को शांत करने के लिए है, तो एक रोटरी बाष्पीकरण का उपयोग कर कम दबाव के तहत विलायक हटाने की अनुमति दें।
      4. अवशेषों को क्लोराइड के 15 मिलीलीटर जोड़ें।
      5. बंद फ़िल्टर और जिसके परिणामस्वरूप वेग त्यागें।
      6. कम दबाव के तहत विलायक हटाये एक सड़ांध का उपयोग करआरे बाष्पीकरण भूरे रंग के तेल के रूप में उत्पाद प्राप्त करने के लिए।
    3. 1-मिथाइल-1H-इण्डोल-3- carbaldehyde के संश्लेषण (चित्रा 2A, कदम ग)
      1. अक्रिय गैस (आर्गन) के तहत, एक 50 मिलीलीटर दौर तली एक भाटा कंडेनसर के साथ सुसज्जित फ्लास्क में 10 मिलीलीटर पूर्ण dimethylformamide में भंग 1.45 छ इण्डोल-3- carbaldehyde, 1.52 छ पोटेशियम कार्बोनेट और 2.70 छ डाइमिथाइल कार्बोनेट।
      2. 19 घंटे के लिए 130 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण हिलाओ।
      3. आरटी को शांत करने के लिए, तो बर्फ पर मिश्रण डालना अनुमति दें।
      4. जलीय परत 150 मिलीलीटर एथिल एसीटेट के साथ तीन बार निकालें।
      5. जैविक परतों का मिश्रण है, उन्हें पानी से धो लें, सोडियम सल्फेट पर उन्हें सूखी और एक रोटरी बाष्पीकरण का उपयोग कर कम दबाव के तहत 50 डिग्री सेल्सियस पर विलायक हटा दें।
    4. युग्मन के लिए 1- (3-azidopropyl) -4 (2- (1-मिथाइल-1H-indol-3-YL) विनाइल) pyridin-1-IUM आयोडाइड (डाई 1) (2A चित्रा, कदम घ)
      1. आर्गन के तहत और नमी के बहिष्कार के तहत काम करते हैं। Dissolएक 20 मिलीलीटर दौर तली एक भाटा कंडेनसर के साथ सुसज्जित फ्लास्क में 4 मिलीलीटर इथेनॉल में 90 मिलीग्राम 1- (3-azidopropyl) -4-methylpyridin-1-IUM और 48 मिलीग्राम 1-मिथाइल-1H-इण्डोल-3- carbaldehyde किया है।
      2. 4 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस के लिए 0.07 मिलीलीटर piperidine और गर्मी जोड़ें।
      3. आरटी को शांत करने की अनुमति दें।
      4. निस्पंदन द्वारा परिणामस्वरूप वेग लीजिए और diethylether के साथ तीन बार धोएं।
      5. सतह पर तैरनेवाला को diethylether जोड़ें और निस्पंदन द्वारा परिणामस्वरूप वेग इकट्ठा। diethylether के साथ तीन बार धोएं।
      6. अवक्षेप जुडा है।
  2. 1- (3-azidopropyl) के संश्लेषण -4 (2- (1-मिथाइल-2-फिनाइल-1H-indol-3-YL) विनाइल) quinolin-1-IUM आयोडाइड (डाई 2)
    1. 1- (3-iodopropyl) -4-methylquinolin-1-IUM आयोडाइड का संश्लेषण (चित्रा 2 बी, कदम एक)
      1. भंग 715 मिलीग्राम 4-methylquinoline और 5.91 छ एक 20 मिलीलीटर दौर से गुजर शीशी में acetonitrile के 10 मिलीलीटर में 1,3-diiodopropane और एक पट टोपी से कसकर सील।
      2. गर्मी16 घंटे के लिए 85 डिग्री सेल्सियस के लिए।
      3. आरटी को शांत करने के लिए है, तो एक रोटरी बाष्पीकरण का उपयोग कर कम दबाव के तहत विलायक हटाने की अनुमति दें।
      4. शेष तेल के लिए एथिल एसीटेट के 20 मिलीलीटर जोड़ें और 3 मिनट के लिए एक 120 डब्ल्यू अल्ट्रासोनिक स्नान में मिश्रण का इलाज।
      5. निस्पंदन द्वारा गठित वेग लीजिए और एथिल एसीटेट के साथ पांच बार धो लें। वैक्यूम हे / एन के तहत ठोस उत्पाद सूखी।
    2. 1- (3-azidopropyl) -4-methylquinolin-1-IUM के संश्लेषण (चित्रा 2 बी, कदम ख)
      1. 900 मिलीग्राम 1- (3-iodopropyl) एक 20 मिलीलीटर दौर से गुजर शीशी में acetonitrile की 12 मिलीलीटर में -4-methylquinolin-1-IUM आयोडाइड भंग सोडियम azide की 333 मिलीग्राम जोड़ने के लिए, और एक पट टोपी से कसकर सील।
      2. 16 घंटे के लिए 85 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्मी।
      3. आरटी को शांत करने के लिए है, तो एक रोटरी बाष्पीकरण का उपयोग कर कम दबाव के तहत विलायक हटाने की अनुमति दें।
      4. अवशेषों को क्लोराइड के 15 मिलीलीटर जोड़ें।
      5. बंद फ़िल्टर और जिसके परिणामस्वरूप वेग त्यागें।
      6. विलायक यू हटायेnder भूरे रंग के तेल के रूप में उत्पाद प्राप्त करने के लिए एक रोटरी बाष्पीकरण का उपयोग कर दबाव कम हो।
    3. 1-मिथाइल-2-फिनाइल-1H-इण्डोल-3- carbaldehyde के संश्लेषण (चित्रा 2 बी, चरण c)
      1. अक्रिय गैस (आर्गन) के तहत, एक 50 मिलीलीटर दौर तली एक भाटा कंडेनसर के साथ सुसज्जित फ्लास्क में 10 मिलीलीटर पूर्ण dimethylformamide में भंग 1.45 जी 2-फिनाइल-1H-इण्डोल-3- carbaldehyde, 0.996 ग्राम पोटेशियम कार्बोनेट और 1.77 छ डाइमिथाइल कार्बोनेट।
      2. 19 घंटे के लिए 130 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण हिलाओ।
      3. आरटी को शांत करने के लिए, तो बर्फ पर मिश्रण डालना अनुमति दें।
      4. जलीय परत 150 मिलीलीटर एथिल एसीटेट के साथ तीन बार निकालें।
      5. जैविक परतों का मिश्रण है, उन्हें पानी से धो लें, सोडियम सल्फेट पर उन्हें सूखी और रोटरी बाष्पीकरण का उपयोग कर कम दबाव के तहत विलायक हटा दें।
    4. 1- (3-azidopropyl) युग्मन -4 (2- (1-मिथाइल-2-Phe Nyl-1H-indol-3-YL) विनाइल) quinolin-1-IUM आयोडाइड (चित्रा 2 बी, कदम घ)
      1. ARG के तहत कामपर और नमी के बहिष्कार के तहत। एक 20 मिलीलीटर दौर तली फ्लास्क के साथ सुसज्जित में 90 मिलीग्राम 1- (3-azidopropyl) -4-methylquinolin-1-IUM और 59.7 4 मिलीलीटर इथेनॉल में मिलीग्राम 1-मिथाइल-2-फिनाइल-1H-इण्डोल-3- carbaldehyde भंग रीफ़्लक्स संघनित्र।
      2. 4 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस के लिए 0.06 मिलीलीटर piperidine और गर्मी जोड़ें।
      3. आरटी को शांत करने की अनुमति दें।
      4. निस्पंदन द्वारा परिणामस्वरूप वेग लीजिए और diethylether तीन बार से धो लें।
      5. सतह पर तैरनेवाला को diethylether जोड़ें और निस्पंदन द्वारा परिणामस्वरूप वेग इकट्ठा। diethylether के साथ तीन बार धोएं।
      6. अवक्षेप जुडा है।

2. डीएनए किस्में के संश्लेषण

नोट: डीएनए किस्में के संश्लेषण के रूप में एक डीएनए सिंथेसाइज़र पर एम Caruthers 11 से वर्णित है, एक ठोस चरण पर phosphoramidite विधि का उपयोग किया जाता है। सिंथेसाइज़र के कामकाज सिंथेटिक प्रक्रिया से पहले परीक्षण किया है, और अभिकर्मकों यदि नए सिरे से कर रहे हैंज़रूरी।

  1. Prearrangements
    1. amidite मंदक (अतिरिक्त सूखी acetonitrile) के 1.2 मिलीलीटर में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 2'-ओ-propargyl-deoxyuridinephosphoramidite (मुद्रा) भंग। एक सिंथेसाइज़र शीशी शीशी में समाधान ले जाएँ और सिंथेसाइज़र में पेंच।
    2. सुनिश्चित करें कि कोई आर्गन गैस रिसाव से मौजूद है बनाने के लिए (निर्माता के निर्देशों के अनुसार) एक "रिसाव परीक्षण" प्रदर्शन करना। "रिसाव परीक्षण" विफल रहता है, और अधिक मजबूती से शीशी में पेंच।
    3. ट्यूब ठोस चरण संश्लेषण चैम्बर के लिए जोड़ता है भरने के द्वारा प्रधानमंत्री घन के समाधान।
    4. acetonitrile के साथ सभी लाइनों को धो लें।
  2. डीएनए किस्में के संश्लेषण
    1. डीएनए अनुक्रम और युग्मन विधि प्रवेश करने के लिए लॉग इन कंप्यूटर का उपयोग, निर्माता प्रोटोकॉल से संकेतों का पालन। घन के निर्माण खंड के युग्मन कदम (प्रत्येक नाड़ी 16 μl) कर रहे हैं 7 दालों के साथ 168 सेकंड लेता है एक पारंपरिक के लिए 7 दालों के साथ 40 सेकंड की तुलनाब्लॉकों इमारत के रूप phosphoramidite।
    2. सीपीजी (नियंत्रित ताकना ग्लास) ठोस चरण के रूप में पहली बार है कि आधार के 1 μmol के साथ संशोधित किया गया है जिसमें स्तंभ माउंट सिंथेसाइज़र में (डीएनए संश्लेषण 3 से 5 के लिए 'किया जाता है)।
    3. डीएनए सिंथेसाइज़र 11 पर संश्लेषण की शुरुआत करें।
  3. संश्लेषित डीएनए किस्में के workup
    1. वैक्यूम हे / एन के तहत संश्लेषित डीएनए किस्में के साथ स्तंभों सूखी।
    2. स्तंभ खोलने के लिए और एक प्रतिक्रिया शीशी में सीपीजी जारी करने के लिए एक pincer का प्रयोग करें। oligonucleotide deprotect और सीपीजी से डीएनए किनारा जारी करने के लिए केंद्रित जलीय अमोनिया समाधान के 700 μl जोड़ें।
    3. 18 घंटे के लिए बंद करो और यह शीशी फोड़ से रोकने के लिए प्रतिक्रिया पोत पर एक सुरक्षा ढक्कन लागू होते हैं, और गर्मी 50 डिग्री सेल्सियस के लिए।
    4. 30 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर कम दबाव (100 मिलीबार) के तहत centrifugation द्वारा अमोनिया निकालें।
    5. 11,000 XG पर अपकेंद्रित्र के लिए पोत: सीपीजी से छानने का काम शुरूआर 3 मिनट। सतह पर तैरनेवाला ले लो और 0.45 माइक्रोन के एक छेद के आकार के साथ एक केन्द्रापसारक डिवाइस में हस्तांतरण। 4 मिनट के लिए 1,000 XG पर अपकेंद्रित्र।
    6. इस बीच दोहरा आसुत जल के 300 μl 3 मिनट के लिए 11,000 XG पर 20 सेकंड और सेंट्रीफ्यूज के लिए सीपीजी, भंवर में जोड़ें। 4 मिनट के लिए 1,000 XG पर केन्द्रापसारक डिवाइस और सेंट्रीफ्यूज में सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण। इस कपड़े धोने की प्रक्रिया दो बार दोहराएँ।
    7. 0.1 मिलीबार और 25 डिग्री सीओ / एन पर centrifuging द्वारा संयुक्त जलीय समाधान से पानी निकाल दें।

3. "क्लिक" प्रक्रिया

  1. 50 μl दोगुना आसुत जल, एक सोडियम ascorbate समाधान के 25 μl (पानी में 0.4 मीटर), 34 μl Tris जोड़ें - [(1-लोबान-1H-1,2,3-triazol-4-YL) मिथाइल] अमाइन (0.1 DMSO में एम / tBuOH 3: 1), azide के 114 μl (DMSO में 0.01 एम / tBuOH 3: 1) और एक tetrakis के 17 μl (acetonitrile) कॉपर (आई) Hexafluorophosphate समाधान (DMSO में 0.1 एम / tBuOH 3: 1) lyophilized alkyne संशोधित डीएनए नमूने लिए। 1.5 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर नमूना सेते हैं।
  2. आरटी शांत।
  3. 150 μl ना 2 EDTA (पानी में 0.05 एम) और 450 μl सोडियम एसीटेट (पानी में 0.3 एम) डीएनए नमूने और एक 10 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण करने के लिए जोड़ें।
  4. 10 मिलीलीटर इथेनॉल (100%) जोड़े और 16 घंटे के लिए -32 डिग्री सेल्सियस पर रहते हैं।
  5. 1,000 XG पर 15 मिनट के लिए और सतह पर तैरनेवाला हटाने के लिए अपकेंद्रित्र पोत।
  6. 2 मिलीलीटर ठंड इथेनॉल (80%) के साथ धो डीएनए गोली।
  7. कम दबाव के तहत सूखी गोली।

4. एचपीएलसी शोधन

नोट: अलग करने से पहले डीएनए किस्में सुनिश्चित करें कि एचपीएलसी ठीक से काम कर रहा है, पर्याप्त विलायक उपलब्ध है और कॉलम साफ है। बफर / acetonitrile के शुरू एकाग्रता के साथ स्तंभ कुल्ला।

  1. एक एचपीएलसी शीशी को दोगुना आसुत जल और हस्तांतरण के 250 μl में कच्चे तेल की डीएनए गोली भंग।
  2. डाई 1 और एक gradi के लिए acetonitrile के 15% करने के लिए 0% acetonitrile की एक ढाल के साथ 45 मिनट की एचपीएलसी रन शुरू डाई 2. acetonitrile का 17% करने के लिए 0% acetonitrile के ईएनटी 260 एनएम (डीएनए अवशोषण) और 459 एनएम (डाई 1) या 542 एनएम (डाई 2) की जाँच करके रन की निगरानी। उन अंशों कि दोनों तरंगदैर्ध्य चैनलों में अवशोषण दिखा लीजिए।
  3. मैट्रिक्स सहायता प्रदान की लेजर desorption आयनीकरण (MALDI) मास स्पेक्ट्रोमेट्री 3-hydroxypicolinic एसिड (3HPA) और diammoniumhydrogencitrate से मिलकर एक मैट्रिक्स का उपयोग करके सही जन के लिए एकत्र भिन्न जाँच करें।
    1. acetonitrile और पानी में एक diammoniumhydrogencitrate समाधान (100 ग्राम / एल) के 100 μl के साथ पानी की 1-मिश्रण: 1 में एक संतृप्त 3-HPA समाधान के 900 μl मिश्रण से मैट्रिक्स तैयार करें।
    2. लक्ष्य पर डीएनए जांच के 1-2 μl पिपेट और यह हवा पर सूखी।
    3. नमूने के लिए 3-HPA / diammoniumhydrogencitrate मैट्रिक्स के 0.2 μl जोड़ें और मिश्रण जब तक यह क्रिस्टलीकृत।
    4. MALDI मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रदर्शन करना।
    5. उन एचपीएलसी अंशों सही है कि बड़े पैमाने पर प्रदर्शन कर जुडा है।
_title "> 5। एकाग्रता का निर्धारण

नोट: एकाग्रता 260 एनएम पर अवशोषण को मापने के एक यूवी / विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर डीएनए कुर्सियां ​​और डाई के विलुप्त होने के गुणांक (260 ε) पर आधारित का उपयोग कर, द्वारा निर्धारित किया जाता है।

  1. 200 μl दोगुना आसुत जल - 100 में डीएनए भंग।
  2. यूवी / विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर डीएनए समाधान के 1 μl लागू करें।
  3. 260 एनएम पर अवशोषण को मापने। तीन बार दोहराएँ।
  4. समाधान की एकाग्रता की गणना के लिए औसत मान ले। विलुप्त होने के गुणांक की गणना के लिए, पूरे डीएनए किनारा के ε 260nm प्राप्त करने के लिए चार प्राकृतिक ठिकानों 12 के ε 260nm और खरीदे निर्माण खंड घन की ε 260nm (प्राकृतिक uridine के रूप में माना जाता है) 12 का उपयोग करें। के लिए डाई 1, उपयोग ε 260nm = 10,200 एल * मोल -1 * सेमी -1 और 2 के लिए डाई, उपयोग ε 260nm = 13,100 एल * मोल <sup> -1 * सेमी -1। विलुप्त होने के गुणांक और मापा absorbances पर आधारित लैम्बर्ट-बीयर्स 'कानून का पालन समाधान की एकाग्रता की गणना। 13

6. नमूना तैयार करना और स्पेक्ट्रोस्कोपी

  1. भी कतरा नमूनों की तैयारी
    1. संशोधित DNA1 और 200 मिमी NaCl, 50 मिमी झपकी मैं बफर में DNA2 में से प्रत्येक के 2.5 माइक्रोन के समाधान के लिए अलग से 1 मिलीलीटर, पीएच = 7 तैयार करें।
  2. डबल कतरा नमूनों की तैयारी
    1. एक समाधान के लिए एक प्रतिक्रिया पोत में 200 मिमी NaCl, 50 मिमी झपकी मैं बफर, पीएच = 7 में DNA1 के 2.5 माइक्रोन के और 2.5 माइक्रोन के DNA2 की युक्त 1 मिलीलीटर की तैयारी।
    2. 10 मिनट के लिए एक सुरक्षा टोपी और 90 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्मी के साथ ढक्कन सुरक्षित। फिर हीटिंग बंद कर देते हैं और आरटी हे / एन को शांत करने के लिए अनुमति देते हैं।
  3. अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी
    नोट: प्रतिदीप्ति कल्पना के लिए उत्तेजना तरंगदैर्ध्य निर्धारित करने के लिएtroscopy अवशोषण स्पेक्ट्रा दर्ज हैं।
    1. भी कतरा माप
      1. केवल 200 मिमी NaCl, 50 मिमी झपकी मैं बफर, पीएच = 7 युक्त एक रिक्त माप रिकॉर्ड।
      2. एक 1 सेमी क्वार्ट्ज गिलास क्युवेट में DNA1 के लिए तैयार समाधान स्थानांतरण और अवशोषण रिकॉर्ड है। खाली डेटा के खिलाफ माप सही। डाई अवशोषण के अधिकतम मूल्य निर्धारित करते हैं।
      3. DNA2 के लिए दोहराएँ।
  4. प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी
    1. भी कतरा माप
      1. केवल 200 मिमी NaCl, 50 मिमी झपकी मैं बफर युक्त एक रिक्त माप रिकॉर्ड, पीएच = 7; डाई 1 की उत्तेजना तरंगदैर्ध्य का उपयोग कर।
      2. एक 1 सेमी क्वार्ट्ज गिलास क्युवेट में DNA1 समाधान स्थानांतरण।
      3. प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम रिकॉर्ड।
    2. डबल कतरा माप
      1. एक क्वार्ट्ज गिलास क्युवेट में डबल कतरा समाधान स्थानांतरण। डाई 1 की उत्तेजना तरंगदैर्ध्य का उपयोग कर प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम रिकॉर्ड।
  5. दृश्य प्रयोगों
    सावधानी: उचित नेत्र सुरक्षा आँखों के लिए यूवी क्षति से बचने के लिए पहना जाना चाहिए!
    1. क्या दर्ज स्पेक्ट्रा दिखा रहे हैं की एक बेहतर समझ हासिल करने के लिए, हाथ में यूवी लैंप (चित्रा 5) के साथ cuvettes चमकाना। डबल असहाय डीएनए के लिए एक से प्रतिदीप्ति रंग में परिवर्तन का निरीक्षण करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

के रूप में चित्रा 4 में दिखाया गया सिंगल और डबल असहाय डीएनए के अवशोषण और प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा दर्ज हैं।

दर्ज की गई अवशोषण स्पेक्ट्रा (चित्रा 4 दाएं) शो अवशोषण Maxima λ 465 एनएम पर एकल असहाय DNA1 (डाई 1) और एकल असहाय DNA2 (डाई 2) के लिए 546 एनएम के लिए मैक्स। annealed DNA1_2 (डाई 1 & डाई 2) दोनों 469 एनएम और 567 एनएम पर Maxima पता चलता है। दोनों अवशोषण Maxima एक bathochromic पारी, डाई 1 के लिए 4 एनएम और 21 एनएम डाई 2. इन छोटे स्पेक्ट्रोस्कोपी परिवर्तन डबल पेचदार डीएनए संरचना के भीतर रंगों के बीच excitonic बातचीत के परिणाम दिखा रहे हैं।

इसी प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा (चित्रा 4 बाएं) प्रदर्शनी Maxima λ मैक्स, एकल असहाय DNA1 (डाई 1, 435 एनएम पर उत्तेजना) के लिए 537 एनएम पर, एकल के लिए 607 एनएम पर-stranded DNA2 (डाई 2, 535 एनएम पर उत्तेजना) और annealed DNA1_2 के लिए 615 एनएम (डाई 1 और 435 एनएम पर 2, उत्तेजना डाई)। DNA1_2 पूरी तरह डाई 2 के उत्सर्जन को अधिकतम पता चलता हालांकि डाई 1 चुनिंदा उत्साहित जो सबूत हैं कि ऊर्जा हस्तांतरण डाई 1 से कुशलता से होता है डाई करने के लिए 2. इस 1:57 के एक उत्सर्जन विपरीत अनुपात देता है।

सिंगल और डबल कतरा के बीच का अंतर एक मानक यूवी दीपक के साथ उत्तेजना के दौरान क्युवेट में उत्सर्जन रंग की तुलना द्वारा स्पष्ट रूप में चित्रा 5 में दिखाया गया है।

आकृति 1
चित्रा 1. डीएनए में एक ऊर्जा हस्तांतरण की मूल अवधारणा। दाता संशोधित डीएनए किनारा (हरा) 435 एनएम पर विकिरण पर 535 एनएम पर प्रतिदीप्ति पता चलता है। यह स्वीकर्ता संशोधित काउंटर किनारा (लाल) जिसके परिणामस्वरूप डबल कतरा एस के साथ संकरित किया जाता है तो610 एनएम पर स्वीकर्ता डाई का केवल लाल प्रतिदीप्ति hows। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. संश्लेषण की डाई 1 और डाई 2. दो जाती रंगों 1 (ए) के 2 (बी) के संश्लेषण और अवलोकन लगातार तीन चरणों में किया जाता है। 9 (ए) क) 1,3-diiodopropane, सीएच 3 सीएन, 85 डिग्री सेल्सियस, 16 घंटा, 94%; ख) Nan 3, सीएच 3 सीएन, 85 डिग्री सेल्सियस, 16 घंटा, 87%; ग) कश्मीर 2 3 सीओ, डाइमिथाइल कार्बोनेट, DMF, 130 डिग्री सेल्सियस, 19 घंटा, 89%; घ) piperidine, EtOH, 80 डिग्री सेल्सियस, 4 घंटा, 80%। (बी) क) 1,3-diiodopropane, सीएच 3 सीएन, 85 डिग्री सेल्सियस, 16 घंटा, 49%; ख) Nan 3, सीएच 3 सीएन, 85 डिग्री सेल्सियस, 16 घंटा, 93%; सी) कश्मीर 2 3 सीओ, डाइमिथाइल कार्बोनेट, DMF, 130 डिग्री सेल्सियस, 19 घंटा, 98%; घ) piperidine, EtOH, 80 डिग्री सेल्सियस, 4 घंटा, 44%। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. घन निर्माण खंड की संरचना, रंग 1 और 2 और DNA1 और DNA2 के दृश्यों। रंगों 1 और 2 DNA1 और DNA2 के दिए गए दृश्यों के भीतर एक triazole लिंकर द्वारा राइबोज़ के 2 'की स्थिति से जुड़ी हैं। 9 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. Fluoसिंगल और डबल असहाय डीएनए किस्में (बाएं) और सिंगल और डबल असहाय डीएनए किस्में (दाएं)। DNA1 का उत्सर्जन स्पेक्ट्रा (काला) 464 एनएम, DNA2 (लाल) में उत्साहित है, उत्साहित 535 एनएम और 435 एनएम (गुलाबी के अवशोषण की rescence ), और DNA1_DNA2 संकर (नीला), 435 एनएम पर उत्साहित दिखाई जाती हैं। एकल असहाय DNA1 (काला), DNA2 (लाल), और संकरित डबल कतरा DNA1_DNA2 (नीला) के अवशोषण स्पेक्ट्रा दाईं ओर शो पर दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
एक यूवी दीपक द्वारा उत्तेजना के दौरान दाता डाई (बाएं) और दाता और स्वीकर्ता डाई (दाएं) के साथ डबल असहाय डीएनए के साथ एकल असहाय डीएनए की चित्रा 5. उत्सर्जन रंग। एकल असहाय DNA1 युक्त क्युवेट की छवि (LEFटी पक्ष) चमकीले हरे रंग की रोशनी दिखाता है, और डबल असहाय DNA1_DNA2 (दाईं ओर) की छवि को 366 एनएम पर एक हाथ में यूवी दीपक द्वारा उत्तेजना के दौरान लाल प्रतिदीप्ति पता चलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस प्रोटोकॉल azide संशोधित फ्लोरोसेंट रंगों से CuAAC के माध्यम से लेबल करने के लिए डीएनए के बाद कृत्रिम पूरी प्रक्रिया से पता चलता है। यह रंग और alkyne संशोधित डीएनए के संश्लेषण के रूप में अच्छी तरह से लेबलिंग प्रक्रिया भी शामिल है।

रंगों के संश्लेषण के चार चरणों के बाद। सभी उत्पादों को उनके सकारात्मक चार्ज के कारण एक नहीं बल्कि साधारण वर्षा द्वारा प्राप्त किया जा सकता है और कोई समय लेने वाली कॉलम क्रोमैटोग्राफी की जरूरत है। केंद्रीय युग्मन कदम से पहले azide कार्यक्षमताओं की शुरूआत चार के बजाय लगातार पांच प्रतिक्रिया कदम को रंगों के syntheses shortens। 1,3-diiodopropane बजाय alkylation कदम है, अपेल प्रतिक्रिया और निम्न फिंकेलस्टाइन प्रतिक्रियाओं iodo कार्यक्षमताओं में हाइड्रॉक्सिल समारोह में परिवर्तित करने के लिए 3-iodopropanol के आवेदन से परहेज कर रहे थे। प्रकाशित प्रक्रियाओं की तुलना में ये परिवर्तन हमें बड़ा तराजू और समय की छोटी अवधि में रंगों के संश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं।

(जैसे, पोटेशियम कार्बोनेट के साथ deprotection)। यह एक काफी अधिक महंगा विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है और डीएनए ब्लॉकों का निर्माण या ठोस समर्थन (ऑन-मनका) पर लेबलिंग के रूप में इसी डाई संशोधित phosphoramidites के संश्लेषण की आवश्यकता है।

DNA1 डाई 2, स्वीकर्ता डाई द्वारा डाई 1, दाता डाई, और DNA2 द्वारा लेबल है। जब DNA1 और DNA2 annealed हैं दोनों रंगों के करीब निकटता में मिलता है। जब डाई 1 उत्साहित है एक कुशल ऊर्जा हस्तांतरण मनाया जाता है। प्रिंसिपल में, दोनों रंगों के बीच बातचीत excitonic एक कुशल ऊर्जा हस्तांतरण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं क्योंकि बाद प्रक्रिया uncoupled की आवश्यकता है और उत्तेजितडी डाई 1 और मिलकर रंगों के uncoupled डाई 2. उत्तेजना अलग photophysical रास्ते आरंभ होता है। 14 हमारे पिछले अध्ययनों से पता चला है कि 9,15 लागू किया रंगों के 3'-5'-विकर्ण व्यवस्था के बीच केवल थोड़ा excitonic बातचीत के लिए संरचनात्मक आधार प्रदान करता है रंगों और कुशल ऊर्जा हस्तांतरण।

प्रदर्शन ऊर्जा हस्तांतरण की उच्च क्षमता इन विट्रो में और इन विवो प्रयोगों में सटीक प्रतिदीप्ति readout सक्षम बनाता है। यह न्यूक्लिक एसिड आधारित aptamers के साथ-साथ छोटे दखल शाही सेना (siRNA) की अखंडता के दृश्य कोशिकाओं के अंदर में लक्ष्य अणुओं के बंधन, आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला है, आणविक बीकन में डीएनए संकरण के दृश्य शामिल है। प्रमुख सीमा आवश्यकता दोनों डीएनए किस्में लेबल करने के लिए है। भविष्य में हम एक कतरा में दोनों रंगों असर दोगुना लेबल oligonucleotide जांच के विकास पर ध्यान केंद्रित करने के लिए हमारे काम करना है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG, वा 1386 / 17-1), द्वारा वित्तीय सहायता अनुसंधान प्रशिक्षण समूह GRK 2039 (DFG द्वारा वित्त पोषित) और किट कृतज्ञता स्वीकार किया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
synthesis
4-Picoline Sigma Aldrich 239615
1,3-Diiodopropane Sigma Aldrich 238414
Acetonitrile Fisher Scientific 10660131 HPLC grade
Ethyl acetate Fisher Scientific 10456870 technical grade
Sodium azide Sigma Aldrich 71290 p.a. grade
Dichloromethane Fisher Scientific 10626642 technical grade
Indole-3-carboxaldehyde; 98% ABCR AB112969
Potassium carbonate, 99+% Acros 424081000
dimethylcarbonate Sigma Aldrich 517127
N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve Acros 348435000
Sodium sulfate Bernd Kraft 12623.46
Ethanol, 99.5% Acros 397690010
Piperidine, 99% Acros 147181000
Diethylether Fisher Scientific 10407830 technical grade
2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97% ABCR AB125050
4-Methylquinoline ABCR AB117222
DNA synthesis
Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer Applied Biosystems  -
DMT-dA(bz) Phosphoramidite Sigma Aldrich A111081
DMT-dT Phosphoramidite Sigma Aldrich T111081
DMT-dG(dmf) Phosphoramidite Sigma Aldrich G11508
DMT-dC(bz) Phosphoramidite Sigma Aldrich C11108
Amidite Diluent for DNA synthesis Sigma Aldrich L010010
Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis Sigma Aldrich L010400
Cap A Sigma Aldrich L840000
Cap B Sigma Aldrich L850000
CPG dT Column 1.0 µmole Proligo Reagents T461010
CPG dA(bz) Column 1.0 µmole Proligo Reagents A461010
CPG dG(ib) Column 1.0 µmole Proligo Reagents G461010
CPG dC(bz) Column 1.0 µmole Proligo Reagents C461010
ammonia (aqueous solution)  Fluka Analytical 318612
centrifugal devices nanosep 0.45 µm Pall ODGHPC34
5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator) Sigma Aldrich 75666
2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite Chem Genes ANP-7754
workup
vacuum concentrator Christ
clicking procedure
Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate Sigma Aldrich 346276
Sodium acetate Sigma Aldrich S2889
(+)-Sodium L-ascorbate Sigma Aldrich A7631
EDTA disodium salt Sigma Aldrich E5134
TBTA-ligand  -  - synthesized according to a literature procedure1
HPLC
HPLC-system Shimadzu
MALDI-Biflex-IV spectrometer Bruker Daltonics
LC-318 C18 column Supelcosil via Sigma Aldrich 58368
determination of concentration
ND 1000 Spectrophotometer nanodrop
sample preparation and spectroscopy
Cary 100 Bio Varian
Fluoromax-3 fluorimeter Jobin-Yvon
1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P. L., Urano, Y. New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging. Chem Rev. 110 (5), 2620-2640 (2010).
  2. Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging. Chem. Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).
  3. Lee, J. S., Vendrell, M., Chang, Y. T. Diversity-oriented optical imaging probe development. Curr. Opin. Chem. Biol. 15 (6), 760-767 (2011).
  4. Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat. Biotechnol. 16 (1), 49-53 (1998).
  5. Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. #34;DNA Traffic Lights": Concept of Wavelength-Shifting DNA Probes and Application in an Aptasensor. ChemBioChem. 13 (8), 1136-1138 (2012).
  6. Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. DNA and RNA "Traffic Lights": Synthetic Wavelength-Shifting Fluorescent Probes Based on Nucleic Acid Base Substitutes for Molecular Imaging. J. Org. Chem. 78 (15), 7373-7379 (2013).
  7. Berndl, S., Wagenknecht, H. A. Fluorescent Color Readout of DNA Hybridization with Thiazole Orange as an Artificial DNA Base. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (13), 2418-2421 (2009).
  8. Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Synthesis of a Photostable Energy-Transfer Pair for "DNA Traffic Lights". Eur. J. Org. Chem. 34, 7547-7551 (2014).
  9. Walter, H. K., Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Development of a Wavelength-Shifting Fluorescent Module for the Adenosine Aptamer Using Photostable Cyanine Dyes. ChemistryOpen. 4 (2), 92-96 (2015).
  10. Gierlich, J., Burley, G. A., Gramlicj, P. M. E., Hammond, D. M., Carell, T. Click chemistry as a reliable method for the high-density postsynthetic functionalization of alkyne-modified DNA. Org. Lett. 8 (17), 3639-3642 (2006).
  11. Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. Synthesis of deoxyoligonucleotides on a polymer support. J. Am. Chem. Soc. 103 (11), 3185-3191 (1981).
  12. Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Volume 1: Nucleic Acids. Fasman, G. D. , CRC Press. 589 (1975).
  13. Puglisi, J. D., Tinoco, J. I. Absorbance melting curves of RNA. Meth. Enzymol. 180, 304-325 (1989).
  14. Johansson, M. K., Fidder, H., Dick, D., Cook, R. M. Intramolecular Dimers: A New Strategy to Fluorescence Quenching in Dual-Labeled Oligonucleotide Probes. J. Am. Chem. Soc. 124, 6950-6956 (2002).
  15. Barrois, S., Wörner, S., Wagenknecht, H. A. The Role of Duplex Stability for Wavelength-Shifting Fluorescent DNA Probes: Energy Transfer vs Excition Interactions in DNA "Traffic Lights", Photochem. Photobiol. Sci. 13, 1126-1129 (2014).

Tags

आण्विक जीवविज्ञान अंक 113 ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स ऊर्जा हस्तांतरण प्रतिदीप्ति क्लिक रसायन विज्ञान रंजक photostable
Photostable जाती रंगों का उपयोग करके वेवलेंथ बदलने वाले डीएनए संकरण जांच के संश्लेषण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arndt, S., Walter, H. K.,… More

Arndt, S., Walter, H. K., Wagenknecht, H. A. Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes. J. Vis. Exp. (113), e54121, doi:10.3791/54121 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter